PRACTICA 2

ANALISIS ORGÁNICO

Preparación del material para el trabajo en Microbiología,

Limpieza, Esterilización y Preparación de Medios de Cultivo

Q.F.B: FRANCISCA GARCÍA ESPINOSA

TESSA XIMENA AGUILAR MEDINA

CNEyS “C” N.L:1

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Objetivo:
En el trabajo del laboratorio de Microbiología tienen importantísima aplicación los
procedimientos, técnicas y productos que suprimen o disminuyen la vitalidad de
los microorganismos patógenos. No existe un procedimiento de esterilización y
desinfección aplicable a todos los casos. El método de esterilización será
seleccionado para cada caso teniendo en cuenta la naturaleza física del objeto y la
naturaleza biológica del contaminante. Como rara vez se conoce la población de
microorganismos sobre un objeto que debe ser tratado, debemos presuponer que
se encuentran presentes las formas microbianas más resistentes: las endosporas.
El método de esterilización a emplearse debe ser previamente valorado.
Actualmente existen valores tabulados de tiempo de exposición, temperatura y
concentración de principios activos para los métodos de esterilización más usados
que nos permiten elegir el más adecuado para cada caso. En la elección debe
tenerse en cuenta también el uso posterior que le será dado (o no) al objeto a
esterilizar.
Marco teórico:
ESTERILIZACIÓN La esterilización es la muerte y/ o eliminación de todo
microorganismo. No existen grados de esterilidad, un objeto es estéril o no lo es.
Esterilización es la acción y efecto de esterilizar. Este verbo refiere a la acción de
destruir los gérmenes patógenos o de hacer estéril e infecundo algo que antes no
lo era. Puede utilizarse la noción de esterilización, por lo tanto, para nombrar al
control del crecimiento microbiano que permite eliminar toda forma de vida, como
virus y esporas. De esta manera, la esterilización se encarga de la destrucción de
los microorganismos que se hallan en un objeto, sustancia o lugar.

La esterilización microbiológica puede desarrollarse a través de diferentes

métodos químicos y físicos. Una alternativa frecuente es someter aquello que se
quiere esterilizar a altas temperaturas que causen la muerte de los
microorganismos. Los implementos que se utilizan en los hospitales, los productos
sanitarios y los alimentos son algunas de las cosas que suelen someterse a la
esterilización.
El proceso esterilizador puede categorizarse en diferentes procesos que pueden
ser físicos o químicos.
ESTERILIZACION POR CALOR
3 MANERAS DIFERENTES:
1. CALOR HUMEDO: Vapor de agua, mas eficaz que calor seco, con varias
formas de emplearlo…
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 Agua hirviendo: (100 C) tiene una acción desinfectante. NO elimina
endosporas de ciertas bacterias.
 Para que el calor alcance una temperatura mayor a 100C, se emplea la
autoclave
AUTOCLAVE
En esencia, una autoclave es un recipiente en el que se consigue exponer el
material a esterilizar a temperaturas superiores a la de ebullición del agua, gracias
a aumentar la presión.
Normas para tomar en cuenta:
Temperatura y tiempo seleccionados deben alcanzarse en todo el líquido. Como la
transmisión del calor en el líquido de los recipientes se realiza de fuera hacia
dentro, la eficacia del proceso dependerá del volumen del liquido
No conviene esterilizar juntos recipientes
Tener en cuenta que algunos productos son termolábiles a tempo. De
esterilización con autoclave

Etapas del funcionamiento de la autoclave

Puesta en Marcha
Se cierran las puertas herméticamente para que la cámara quede sellada.
Expulsión de Aire
En esta fase se eliminará el aire contenido en la cámara y se favorecerá a la
eliminación posterior del aire dentro de los paquetes y de los contenedores. Para
ello se inyecta vapor en la cámara y se activa el sistema de vacío.
Preparación
Para la extracción del aire de los productos y de la cámara, se realiza una serie de
fases (hasta cuatro) de inyección de vapor (de recámara a cámara) seguidas de
fases de vacío (prevacío), mediante el sistema de vacío, para eliminar
completamente el aire restante.
Calentamiento
Se introduce vapor en la cámara y en el interior de los contenedores, hasta
alcanzar la temperatura y presión de esterilización.
Esterilización
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Se mantiene constante la temperatura y presión en la cámara durante el
correspondiente tiempo de esterilización.
Desvalorización
El vapor de la cámara es eliminado por el sistema de vacío y se produce un
descenso de la presión.
Secado
Se inicia un vacío final, profundo y duradero. Se mantiene el vapor en la recámara,
para mantener caliente la cámara y ayudar a secar el producto a fin de evitar todo
tipo de recontaminación bacteriana durante el transporte y el almacenamiento.
Igualación
Entrada de aire atmosférico a la cámara, a través de un filtro de aire estéril, para
compensar la presión de la cámara (que estaba en depresión) con la atmosférica.
El vapor utilizado se condensa y se convierte en agua transportándose a un
depósito.
Finalización del Proceso
Se liberan las puertas para que puedan ser abiertas.
Esterilización fraccionada:
para esterilizar medios de cultivos o reactivos líquidos, que no resistan ser
sometidos al autoclave, pero si a los 100C.
Pasteurización:
Cuando no pueden someterse a elevadas temperaturas que desnaturalizan sus
componentes, solo se reduce población microbiana.
CALOR SECO:
Aire a temperatura elevada, aparato más utilizado es el horno Pasteur , que se
emplea para esterilizar materiales de vidrio u otros materiales que sean termo
resistentes.
Si elimina pirógenos.
ESTERILIZACIÓN POR RADIACIONES
Las radiaciones más largas que la luz visible, son de bajo poder energético.
Generan calor que indirectamente y según la dosis puede tener un efecto
bactericida.
Las radiaciones de longitud de onda más corta que la luz visible son muy
germicidas. Las radiaciones ionizantes (rayos x, gamma, cósmicos).
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La Luz ultravioleta es más fácil de aplicar por razones técnicas y de seguridad.
Una de sus limitaciones es su nula penetración.
Esterilización por filtración.
Filtración: consiste en hacer pasar un fluido (gas o liquido) por un filtro la acción
combinada de los poros del filtro, la trama de este y la naturaleza química del
material de que está construido retiene los microorganismos ´pero no el fluido.
La filtración es adecuada para bacterias y otros microorganismos de cierto tamaño
Los virus y algunas otras bacterias de tamaño no muy pequeño, ejemplo: las
micoplasmas no son retenidos por los filtros habituales
Sistemas de protección de muestras
Cámaras de aire filtrado.
Determinados filtros acoplados a un motor de ventilación suministran aire limpio de
partículas de polvo y bacterias.
Su aplicación en el laboratorio es bajo la forma de cabinas de seguridad biológica.
Existen tres tipos de diseños:

hacen fluir el aire directamente desde la habitación hacia el interior de la cabina.

De esta forma se evita que el operador se contamine con microorganismos
depositados en el exterior.
b) Cabinas de presión positiva
Introducen el aire filtrado en su interior expulsándolo sobre la posición de trabajo.
No evita que el operador se contamine.
c) Cabinas de flujo laminar
Se crea una cortina de aire laminar entre el espacio de trabajo y el exterior. Se
proporciona protección simultanea al operador.
esterilización por eliminación física de los contaminantes presentes en un fluido,
sin producir ni la inactivación ni la muerte de los microorganismos
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Materiales y Equipo:

A Laboratorio: - 1 cinta Testigo o Masking Tape

(Por salón)
Por Equipo:
- 1 Litro de alcohol etílico 70%
- 1 Probeta de 100 ml o 200 ml
tapa azul o el que tengan.
- 1 Pipeta de 10 ml
- 1 Pliego de papel kraft o
- 4 pipetas de 1 ml estraza (1.5 metros)

- 2 Matraces Erlenmeyer de 250 - 1 rollo de papel aluminio de

ml poquitos metros

- 3 tubos de ensaye - 1 rollo de servilletas (para todo

el salón)
- 1 Tripie
- 1 Bolsa de Algodón de barra
- 1 Mechero Bunsen con chica
manguera
- 5 abatelenguas
- 1 Tela de alambre
- 5 palitos de madera delgados
- 2 varillas de vidrio largos(para brocheta)
- 1 espátula - 1 Marcador Sharpie (Negro,
- Agua destilada 300 ml azul o rojo)

- Balanza analítica - 1 Jabón líquido

- Agar Bacteriológico - 1 Gel Antibacterial

- Caldo nutritivo - 2 Franelas limpias

- Agar Mac Conkey - 1 Tijeras para cortar papel

- 1 Exacto para cortar palitos de
madera
Traer por equipo:
- 1 cajita de Gasas (se necesitan
- 1 encendedor o cerillos 4 Gasas)
- 1 cinta de papel para etiquetar
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Diagrama de flujo:

PROCEDIMIENTO PREVIO:
CONSIDERACIONES PREVIAS PARA PREPARAR EL MATERIAL A
ESTERILIZAR:
LIMPIE SU ÁREA DE TRABAJO, USE AGUA Y JABÓN, GEL ANTIBACTERIAL,
EMPLEE FRANELA LIMPIA Y SECA (NUEVA). La dinámica de la esterilización
dice que la proporción de microorganismos muertos en iguales periodos de tiempo
es constante. A mayor temperatura, mayor acción y menos tiempo necesario para
esterilizar. Esto es válido para cualquier procedimiento químico o físico excepto
filtración.
Para asegurar el éxito de un proceso esterilizante es necesario considerar las
siguientes pautas:
1. Esterilización previa: Será necesaria cuando el material y/ o equipos hayan
sido utilizados con material infeccioso o presunto infeccioso, por ejemplo placas de
Petri inoculadas, tubos conteniendo cultivos de microorganismos, frascos
empleados en el cepario, etc. serán esterilizados en autoclave a 1 atm. de presión
durante 15 – 30 minutos. Para las pipetas, micropipetas y tubos de hemólisis
puede emplearse este método o sumergirlas inmediatamente después de ser
utilizadas en solución desinfectante de formol al 10 % durante una hora.
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2. Limpieza previa: Se realizará para eliminar las partes gruesas de suciedad
o residuos no infecciosos (gratitud, resto de pegamento, cinta adhesiva, carbono,
tinta de rotulado, etc.). Se empleará el raspado con espátulas, cepillo, esponjas
metálicas, paños, etc. Se enjuagará repetidas veces bajo el chorro de agua
corriente a presión (conectando a la canilla un tapón perforado o tapando
parcialmente con un dedo). Se aconseja un último enjuague con agua destilada.
Se dejará secar en canasto o rejilla de alambre boca abajo a temperatura
ambiente o estufa a 60 – 80 °C. El material de vidrio que luego de este tratamiento
aún quedase manchado será sumergido en una solución sulfocrómica durante 24
hrs
3. Preparación del material de vidrio: este acondicionamiento debe realizarse
de manera tal de asegurar la perfecta esterilización del mismo en todos sus puntos
y evitar la posterior contaminación.
a. Placas de Petri de vidrio: se envuelven en papel madera según la técnica
indicada por el instructor (se esterilizan en estufa a 160- 180ºC durante dos o una
hora respectivamente) o en autoclave.
b. Tubos de ensayos: se confecciona en tapón de algodón y se cubre con un
capuchón de papel aluminio o papel estraza o kraft. (se esterilizan en estufa o
autoclave).
c. Pipetas: se obtura el extremo superior con un filtro de algodón y luego se
envuelven con tiras de 4 a 5 cm. de ancho de papel madera comenzando por la
punta de la misma. Debe rotularse cada una con la capacidad y graduación
correspondiente (se esterilizan en estufa o autoclave).
4. Flameado Pasar dos o tres veces por la llama del mechero de
Bunsen varillas de vidrio, bocas de tubos, frascos y similares. Las asas y otros
utensilios metálicos se someten a la llama directa hasta calentarse al rojo. Las
pinzas se sumergen en alcohol y luego se secan a la llama. Estos métodos son
instantáneos y no mantienen la esterilidad en el tiempo.
Procedimiento para preparar material: (nota: todo material a esterilizar deberá ir
etiquetado con cinta de papel)
1. Limpiar (lavar si es necesario con agua y jabón) los materiales a utilizar
2. Acondicionar el material limpio para ser esterilizado:
a) Hacer 6 Hisopos (utilice algodón y palitos de madera nuevos)
b) Colocar los hisopos en tubos de ensaye, dos hisopos por cada tubo de ensaye,
colocarle un tapón de algodón para cubrir la boca del tubo, poner una cubierta de
papel estraza o papel Kraft y cerrar con cinta testigo.
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c) Envolver con papel estraza o kraft cinco abatelenguas por separado y cerrar
con cinta testigo.
d) Preparar 4 pipetas de 1 ml, de cada una se obtura el extremo superior con un
filtro de algodón (1.5 cm aprox y que quede un hilo por fuera de la boquilla) y luego
se envuelven con tiras de 4 a 5 cm. de ancho de papel estraza o kraft
comenzando por la punta de la misma de forma diagonal y haga doblez. Debe
rotularse cada una con la capacidad y graduación correspondiente
3. Esterilizar el material usado presuntamente infeccioso en autoclave
(descontaminación).

Procedimiento para preparar MEDIOS DE CULTIVO:

1. Preparar tres medios de cultivo, utilice matraces Erlenmeyer
2. Hacer un tapón de algodón compacto para cada matraz, puede envolver
con una gasa el tapón de algodón para hacerlo más firme y usar poquita cinta
testigo. (Para asegurarnos de que estos tapones funcionen, cubrimos la boca el
matraz y al quitarla tendrá que generar un sonido)
3. Con el papel aluminio hacer tres charolitas pequeñas para pesar los medios
de cultivo en la balanza analítica.
4. Pesar la cantidad adecuada de cada uno de los medio de cultivo para un
volumen de 150 ml cada uno (Hacer cálculos), LEER la etiqueta del Frasco del
Medio de Cultivo para prepararlo.
5. Etiquetar los matraces con cinta de papel como Agar Nutritivo, y el otro
matraz como Agar Mac Conkey, # Equipo y uno de los integrantes.
6. Colocar 150 ml de agua destilada a cada uno de los matraces Erlenmeyer
etiquetados, agregue al matraz etiquetado como AGAR NUTRITIVO el Agar
bacteriológico que se utiliza como agente gelificante en la preparación de medios
de cultivo y el Caldo nutritivo para dar como resultado el Agar Nutritivo de acuerdo
a la cantidad pesada y volumen requerido. En el matraz etiquetado como Mac
Conkey agregue lo que peso de Agar Mac Conkey de acuerdo al volumen
solicitado.
7. Preparar equipo de calentamiento (Tripie, mechero bunsen y tela de
alambre y proceda a calentar los matraces con los medios de cultivo hasta disolver
homogéneamente.
8. Colocar el tapón a cada matraz y cubrir con papel de estraza o Kraft, poner
cinta testigo y esterilizar en autoclave.
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Observaciones:
Estábamos un poco perdidos al comenzar la práctica al comenzar la práctica,
empezamos pidiéndole a Braulio e Isaac que empezaran hacer los isotopos lo cual
fue un trabajo muy difícil, ya que también trate de realizarlo.
No alcanzamos Agar Mac Conkey suficiente para sacar la solución deseada pero
realizamos los cálculos para poder realizarlo.
Envolvimos los abate lenguas con papel estraza y ya cuando estaba la maestra
nos enseñó como envolver los isotopos para ser esterilizados, yo realice el tapón
de uno de los matraces con las gasas y algodón, solo que quedo un poco hundido,
lo sellamos, colocamos y entregamos los materiales
Hicimos un regadero con el algodón al intentar hacer los isotopos.

Abate lenguas ya
Braulio realizo envueltos y listos
una barrita para para estirazar
la maestra con
efectos
especiales

Preparación de agares,
con su tapón ya ajustado,
la maestra nos ayudó a
hacer uno
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 Materiales listos
para empezar el
medio de cultivo
y estilización

Agar calentado para después Braulio e Isaac desesperados porque

ponerle el tapón no les salen los isotopos

Resultados:
1. ¿Pasteurización es sinónimo de esterilización? Diga en qué casos se aplica la
Pasteurización. Fundamente la respuesta.
Pasteurización no es sinónimo de esterilización, porque no destruye a todos los
microorganismos.
En la pasteurización se emplea temperaturas inferiores a 100º C, suficientes para
destruir las formas vegetativas de un buen número de microorganismos patógenos
y saprofitos. Las bacterias esporuladas y otras denominadas termodúricas
resisten, normalmente, a este proceso.

Muchos alimentos, sobre todo bebidas, se pasteurizan; la leche es el ejemplo más

clásico. Sin embargo, los alimentos pasteurizados son inocuos debido a la
posibilidad de que contengan microorganismos supervivientes, su caducidad es
corta y requieren ser conservados en frío.
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2. Defina Tindalización.
La tindalización es un método de esterilización que permite eliminar las esporas y
las bacterias resistentes a las temperaturas elevadas. Este método lo creó John
Tyndall y somete a las bacterias a un calentamiento durante 30 minutos a bajas
temperaturas. Se renueva la operación hasta que las formas vegetativas son
eliminadas y el ambiente ha quedado totalmente esterilizado. La tindalización
corresponde, sobretodo, el proceso de esterilización que permite conservar la
carne.
3. Por qué es necesario purgar el aire de la cámara de la autoclave. Relacione con
la Ley de Dalton de las Presiones Parciales.
Los autoclaves no requieren termómetro para indicar a qué temperatura se
encuentra el vapor de agua interior puesto que hay una relación directa entre la
presión de vapor saturado de agua y la temperatura del vapor.
Inconvenientes del Purgador de Impulso
Los purgadores de impulso no se pueden cerrar del todo y soplarán vapor con
cargas ligeras.
Les afecta mucho la suciedad que entra en el cuerpo debido al espacio tan
pequeño entre pistón y cilindro. Pueden vibrar con cargas ligeras causando ruido,
golpes de ariete incluso daños a la misma válvula.
No trabajan cuando hay una contrapresión que excede el 40% de la presión de
entrada.
4. ¿Cómo se realiza el control del proceso de esterilización?
Diseño y control de autoclaves
Para ser eficaces contra bacterias y virus formadores de esporas, los autoclaves
deben:
 Hacer que el vapor entre en contacto directo con el material que se desea
esterilizar (así, la carga de los objetos es muy importante).
 Crear el vacío para desplazar todo el aire presente originariamente en el
autoclave y sustituirlo por vapor.
 Implementar un programa de control bien diseñado para la evaluación del
vapor y la refrigeración, de modo que la carga no se deteriore.
5. Compare los métodos de esterilización por calor seco (estufa) y por calor
húmedo (autoclave) teniendo en cuenta: mecanismo de acción, tiempo,
temperatura y tipo de material a tratar.
esterilización por calor húmedo
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 Papel : 7 días.
 Tela : 15 días.
 Plástico (polipropileno) : 6 meses y más tiempo.
Temperatura : 180ºC (350ºF)
Tiempo de Exposición : 2 horas, después de finalizada la etapa de
precalentamiento.
No utilizarlo en : -Material textil
-Material termosensible (goma, plástico, látex)
-Sustancias Acuosas o alcalinas
-Fármacos Orgánicos
-Objetos esmaltados
esterilización por calor seco
método más sencillo, económico y práctico para esterilizar. El calor húmedo se
produce en los aparatos comúnmente llamados autoclave, estos funcionan a
presión
conseguida con vapor.
Al aplicar a un determinado material aire caliente por un tiempo determinado, se
produce la destrucción total de los microorganismos viables presentes en el
mismo.
El autoclave permite la esterilización de material reutilizable y material
potencialmente
contaminado que vaya a ser eliminado. La temperatura para esterilizar con calor
húmedo
oscila entre 121°C a 132°C.
tiempo de garantía
con que?
El tiempo de esterilización de acuerdo al material es:
 Líquidos : 15 minutos (poco usual)
 Materiales de caucho : 20 minutos a 124°C
 Instrumental y los paquetes de ropa: 30 minutos a 132°C - 134°C
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6. ¿Qué características presentan las membranas utilizables para el proceso de
filtración esterilizante?
Las principales características de los procesos de separación con membranas son
las siguientes:
 Permiten la separación de contaminantes que se encuentran disueltos o
dispersos en forma coloidal.
 Eliminan contaminantes que se encuentran a baja concentración.
 Las operaciones se llevan a cabo a temperatura ambiente.
 Procesos sencillos y diseños compactos que ocupan poco espacio.
 Pueden combinarse con otros tratamientos.
 No eliminan realmente el contaminante, únicamente lo concentran en otra
fase.
 Pueden darse el caso de incompatibilidades entre el contaminante y la
membrana.
 Problemas de ensuciamiento de la membrana: necesidad de otras
sustancias para llevar a cabo la limpieza, ajustes de pH, ciclos de parada para
limpieza del equipo.
 Deficiente escalado: doble flujo-doble de equipos (equipos modulares).
 Ruido generado por los equipos necesarios para conseguir altas presiones.
7. ¿Qué método de esterilización se recomienda para materiales termolábiles?
Cite ejemplos
Preparación De Medios De Cultivo Con Componentes Termolábiles Los
requerimientos nutricionales especiales de muchas bacterias son sustancias
termolábiles. Como la forma usual de esterilización es el calor, tales sustancias
deben esterilizarse por separado. Sus soluciones estériles se añaden al resto de
componentes del medio de cultivo, una vez esterilizados. Para ello las sustancias
termolábiles del medio se solubilizan en un pequeño volumen de agua y se
estirilizan por filtración. El resto de componentes se disuelven en un volumen de
agua suficiente para que al mezclar con la solución estéril del componente
termolábil se restablezca el volumen final adecuado.

8. ¿Cómo actúa el óxido de etileno?

Actúa como agente alquilante, provocando una modificación irreversible en
enzimas e inhiben la actividad su actividad. Es activo contra todo tipo de bacterias,
incluyendo esporas bacterianas, virus y bacilos tuberculosos.
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Conclusiones:

Los medios de cultivo son uno de los métodos más usados para el análisis de
microorganismos con varios fines, como el de multiplicación, identificación,
antibiograma, entre otros, y puede ofrecer información valiosa sobre los mismos si
se realiza de manera adecuada e higiénica para evitar la contaminación del medio
y la alteración de los resultados.
Bibliografía:
[Link]
[Link]
[Link]
[Link]
instrumentos-de-un-laboratorio-quimico/[Link]
[Link]
ón_por_filtració[Link]
[Link]

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