1. ¿Qué es la cromatografía de líquidos de alta resolución (CLAR)?
El HPLC es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de
interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatográfica.
La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de los componentes de una mezcla entre
dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil. En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que
fluye a través de una columna que contiene a la fase fija.
Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas de fase fija se fue disminuyendo
hasta el tamaño de los micrones, lo cual generó la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase
móvil. De esta manera, nació la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), que requiere de instrumental
especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas.
La cromatografía líquida de alta resolución se caracteriza por el empleo de una fase estacionaria constituida por
partículas de tamaño muy pequeño, del orden de los m. Esto hace que la eficacia del sistema sea muy elevada
proporcionando columnas con un número muy grande de platos teóricos.
Para vencer la enorme resistencia que ofrece la fase estacionaria al paso de la fase móvil es necesario emplear
un sistema de bombeo a alta presión.
Otra característica importante de la HPLC es la detección continua de los analitos conforme son eluidos.
En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija. La
separación cromatográfica en HPLC es el resultado de las interacciones específicas entre las moléculas de la muestra en
ambas fases, móvil y estacionaria
A diferencia de la cromatografía de gases, la cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC, de high-performance
liquid chromatography) no está limitada por la volatilidad o la estabilidad térmica de la muestra.
La HPLC es capaz de separar macromoléculas y especies iónicas, productos naturales lábiles, materiales poliméricos y
una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto peso molecular. Con una fase móvil líquida interactiva, otro
parámetro se encuentra disponible para la selectividad, en adición a una fase estacionaria activa.
La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una mayor gama de estas interacciones
selectivas y más posibilidades para la separación.
2. Señalar las principales características que deben de cumplir tanto las sustancias a separar como la fase móvil a
utilizar.
3. Mencionar los diferentes tipos de cromatografía en C.L.A.R. y sus aplicaciones, incluyendo la cromatografía de
fase normal y de fase reversa.
4. Mencione algunos tipos de fases estacionarias y clasifíquelas con base a su polaridad.
Existen diferentes modalidades de HPLC, dependiendo de la naturaleza de la fase estacionaria:
Modalidad Fase estacionaria
Adsorción Sólido adsorbente
Partición Líquido inmiscible con la f.m.
Fases ligadas Sustancia ligada por enlace covalente a un
soporte sólido
Intercambio iónico Resina cambiadora de iones
Exclusión Sólido de porosidad controlada
Afinidad Ligando afinidad
Las fases estacionarias más habitualmente utilizadas son por su polaridad:
- Cadenas hidrocarbonadas de 18 carbonos para fase inversa.
- Cadenas con extremos amino para fase normal.
5. ¿Qué factores determinan la separación en C.L.A.R.?
Todas las separaciones cromatográficas tienen lugar sobre la fase estacionaria. Las fases estacionarias en cromatografía
de líquidos, están constituidas generalmente por partículas de materiales rígidos o semirígidos, y en la gran mayoría de
los rellenos se suele utilizar sílice con este fin, aunque también es posible encontrar rellenos basados en polímeros
sintéticos. En la mayoría de los rellenos de columnas de cromatografía líquida, la sílice utilizada realiza una de las tres
funciones siguientes:- Superficie adsorbente. En este caso los propios grupos activos de la superficie dela sílice (grupos
silanol) son los responsables de la separación. - Soporte de la fase estacionaria. Esta, o bien impregna la superficie de la
sílice, o bien se encuentra ligada químicamente a ella (sílice modificada químicamente). - Actuación como substrato
microporoso. En este caso, la sílice permite la selección de moléculas en función de su tamaño.
6. Describir los componentes básicos de un sistema C.L.A.R. y señalar brevemente la función de cada parte del
mismo.
Fase móvil: Es un líquido que pasa a alta presión.
Bomba: Debe ser capaz de gestionar altas presiones, de hasta 400 atm, mantener un flujo libre de pulsos, proporcionar
caudales constantes y reproducibles, permitir cambios de disolvente de modo simple y rápido, y ser químicamente
inerte y resistente a la corrosión.
Inyector: Permite la inyección de un volumen de muestra preciso, y muy pequeño (5-500 μL), debe hacerse a la entrada
de la columna en un breve periodo de tiempo.
Horno: Mantiene estable la temperatura.
Columna: Son columnas rectas, fabricadas habitualmente de acero, aunque también se emplean columnas construidas
de vidrio y materiales poliméricos. La mayoría de ellas tienen una longitud entre 5 y 30 cm, y su diámetro interno varía
entre 3 y 10 mm. Los rellenos más comunes son de 5 a 10 μm y se mantienen en el interior del tubo mediante cierres
porosos de metal o de vidrio. La columna es el elemento fundamental de un cromatógrafo de líquidos, puesto que es en
ella donde tiene lugar la separación.
Detector: Un detector para cromatografía es un dispositivo que permite medir, a la salida de la columna, una propiedad
física del eluyente, que deberá depender de la composición de éste.
Detector índice de refracción. Detector de ultravioleta y/o visible. Detector de fluorescencia. Detector de conductividad
eléctrica. Detector electroquímico.
Registrador: Muestra los datos.
7. Mencionar los diferentes tipos de detectores utilizados en C.L.A.R., así como sus ventajas y desventajas.
8. ¿Qué es la cafeína? ¿En qué alimentos está presente?
La cafeína es un alcaloide del grupo de las xantinas, sólido cristalino,
blanco y de sabor amargo, que actúa como una droga psicoactiva,
estimulante del sistema nervioso central.
La cafeína es una sustancia amarga que se encuentra naturalmente en
más de 60 plantas, incluyendo:
Granos de café
Hojas de té
Nueces de cola, que se usan para el sabor de las bebidas de
cola
Vainas de cacao, que se utilizan para hacer productos de
chocolate
También existe la cafeína sintética (hecha por el hombre), que se
añade a algunos medicamentos, alimentos y bebidas. Por ejemplo, algunos analgésicos, medicamentos para el resfrío y
medicamentos de venta libre para la concentración contienen cafeína sintética. Lo mismo con bebidas energéticas y
productos para "aumentar la energía".
9. Investigue el contenido de cafeína en la muestra a analizar.