UNIDAD 10

INMUNOHEMATOLOGÍA Y HEMOCOMPATIBILIDAD

I. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 2

II. GRUPOS SANGUÍNEOS .......................................................................................................... 2

1. Conceptos fundamentales sobre inmunohematología. .................................................... 2

2. Grupos sanguíneos eritrocitarios ...................................................................................... 3
3. Sistema ABO ...................................................................................................................... 3
4. Sistema Rh ......................................................................................................................... 7
5. Otros sistemas de grupos sanguíneos ............................................................................... 9
III. PATOLOGÍAS RELACIONADAS CON LA HEMOCOMPATIBILIDAD......................................... 11

1. Reacciones transfusionales ............................................................................................. 11

2. Enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN) .......................................................... 13
3. Anemias hemolíticas ....................................................................................................... 15
IV. TÉCNICAS PARA EL ESTUDIO DE LA HEMOCOMPATIBILIDAD ............................................. 16

1. Las técnicas de aglutinación ............................................................................................ 17

2. Preparación de las muestras ........................................................................................... 17
3. Aglutinación en tubo y en placa ...................................................................................... 17
4. Aglutinación en columna de gel ...................................................................................... 18
5. La lectura de resultados .................................................................................................. 19
V. PRUEBAS DE HEMOCOMPATIBILIDAD ................................................................................ 19

1. Determinación de grupo ABO ......................................................................................... 20

2. Determinación del grupo Rh ........................................................................................... 21
3. Detección de anticuerpos irregulares ............................................................................. 21
4. Pruebas cruzadas............................................................................................................. 22
5. Otras pruebas de compatibilidad .................................................................................... 22
VI. PRUEBAS INMUNOHEMATOLÓGICAS DIAGNÓSTICAS ........................................................ 23

1. Pruebas de la antiglobulina o Test de Coombs ............................................................... 23

2. Test de Donath Landsteiner ............................................................................................ 24
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Unidad 10 Técnicas de Análisis Hematológico

 INMUNOHEMATOLOGÍA Y HEMOCOMPATIBILIDAD

I. INTRODUCCIÓN
La transfusión es un procedimiento mediante el cual se pasa sangre, o alguno de sus
componentes, de un donante a un receptor. Los objetivos de las transfusiones pueden ser diversos:
reponer el volumen sanguíneo, aumentar la hemoglobina y la capacidad de transporte de oxígeno o
corregir los niveles de proteínas o de otros componentes de la sangre. Un factor determinante para
poder realizar una transfusión es la compatibilidad entre donante y receptor, para que no se
produzca una reacción inmunológica entre antígenos (Ag’s) y anticuerpos (Ac’s) de donante y
receptor. Por ese motivo se analiza la inmunohematología.

II. GRUPOS SANGUÍNEOS

Los llamados grupos sanguíneos se refieren a un conjunto de proteínas y polisacáridos que se
encuentran, fundamentalmente, en la membrana de las células sanguíneas y que les dan
especificidad de grupo. Son de carácter antigénico y, por lo tanto, también existen anticuerpos
capaces de reaccionar contra ellas. Cada individuo posee unos determinados antígenos que le son
transmitidos genéticamente por sus progenitores. Dichos antígenos permanecen estables y
constantes durante toda la vida de la persona. Al grupo de antígenos situados sobre las membranas
de las células hemáticas se les denomina “sistema de grupos sanguíneos”.

1. Conceptos fundamentales sobre inmunohematología.

La inmunohematología es la parte de la hematología que se ocupa del estudio de los grupos
sanguíneos de los hematíes, leucocitos y plaquetas, y de las reacciones inmunológicas relacionadas
con ellos, aunque, en general, cuando se habla de grupos sanguíneos se hace referencia a los
eritrocitarios, porque fueron los primeros conocidos y son los más importantes en la transfusión
sanguínea. De cara al estudio de los grupos sanguíneos es imprescindible recordar algunos
conceptos:

Antígeno (Ag)
Molécula capaz de producir una respuesta inmune y de reaccionar con los anticuerpos
formados específicamente en el respuesta inmunitaria.
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Anticuerpos (Ac) o inmunoglobulinas (Ig)
Sustancia que elabora el organismo como respuesta al contacto de antígenos y que
reaccionan específicamente contra ellos. Los anticuerpos de mayor importancia en las reacciones
debidas a transfusiones son de tipo IgG e IgM, rara vez IgA:

IgG: pueden fijar el complemento. Debido a su tamaño, pueden atravesar la barrera

hematoplacentaria y provocar la enfermedad hemolítica de recién nacido (EHRN), que
estudiaremos más adelante.

IgM: son aglutininas muy potentes, y algunas activan el complemento eficazmente. Tienen
forma de pentámero y un alto peso molecular, por lo que no pueden atravesar la
barrera hematoplacentaria.

IgA: están presentes en secreciones. En el plasma se encuentran en forma de monómeros y

en las secreciones en forma de dímeros.

Aglutinación
Es el agrupamiento de los hematíes u otras partículas al reaccionar un antígeno presente en
ellos con el anticuerpo específico que los hace agruparse y formar grumos que pueden ser visibles
macroscópicamente. La aglutinación puede presentarse en diversos grados de reacción, y en algunas
ocasiones es necesario informar sus características.

Hemólisis
Es la destrucción de los hematíes por la unión al anticuerpo específico en presencia del
complemento.

2. Grupos sanguíneos eritrocitarios

Las reacciones de aglutinación son el fundamento de las pruebas de laboratorio para la
investigación de grupos sanguíneos. Existen numerosos sistemas de grupos sanguíneos relacionados
con los eritrocitos, que vienen determinados por diferentes Ag que están situados sobre si
membrana citoplasmática, y que han sido estudiados y clasificados por diferentes autores. De todos
ellos, los más importantes son los Ag del sistema ABO y los del sistema Rh, y en segundo lugar los Ag
de los sistemas Kell, Duffy, Kidd, Lutheran, Lewis, MNSs, P, I, etc.

3. Sistema ABO
En el sistema ABO los antígenos que determinan el grupo sanguíneo son cadenas cortas de
oligosacáridos (carbohidratos) unidas a esfingolípidos de la membrana eritrocitaria (ceramida), que
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sobresalen hacia el exterior de los hematíes. Los tres antígenos que caracterizan a este sistema
tienen una parte común y se diferencian solo en el residuo terminal de la cadena.

La expresión de estos antígenos está controlada por dos genes: el gen H (cromosoma 19) y el
gen ABO (cromosoma 9), que codifican para enzimas glicosiltransferasas. A partir de un oligosacárido
precursor común, la transferasa H cataliza la incorporación de una L-fucosa, generando el antígeno o
sustancia H, que es la base para la síntesis de los antígenos A y B.

El gen ABO tiene 3 alelos:

Alelo A: codifica para la transferasa A, que cataliza la adición de un residuo de N-acetil-
galactosamina al antígeno H, originando el antígeno A.

Alelo B: codifica para la transferasa B, que incorpora un residuo de D-galactosa al antígeno H,

dando lugar al antígeno B.

Alelo O: codifica para una proteína sin actividad glicosiltransferasa y que no puede modificar
la sustancia H.

Cada individuo posee 2 cromosomas 9 (uno del padre y otro de la madre), que se combinan
de modo que podemos encontrar los genotipos AA, AO, BB, BO, AB y OO, procedentes de las
combinaciones del alelo “A”, el alelo “B” y el alelo “O”. Los alelos “A” y “B” son codominantes.
Dependiendo del antígeno o antígenos presentes en la superficie de los hematíes, se
diferencian cuatro grupos sanguíneos en este sistema:
Grupo A: los hematíes presentan antígeno A.

Grupo B: los hematíes presentan antígeno B.

Grupo AB: los hematíes presentan antígenos A y B.

Grupo O: los hematíes presentan sólo antígeno H (no tienen antígeno A ni antígeno B)

Los hematíes de los grupos A, B y AB tienen también en superficie el antígeno H, aunque en

menor proporción que los del grupo O. No toda la sustancia H es transformada en antígeno A o B.

El gen H posee dos alelos que la determinan la síntesis de sustancia H, el alelo “H” (más
frecuente), y el alelo “h” amorfo o nulo. Los genotipos HH y Hh son los determinantes de la
formación de la sustancia H sobre la membrana de los hematíes. El genotipo hh no aparece en casi
ningún individuo (grupo Bombay).
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Anticuerpos del sistema ABO
Los anticuerpos del sistema ABO tiene un gran interés transfusional, ya que aparecen en el
suero de la persona de forma natural desde los primeros meses de vida, frente a los antígenos que
no poseen en sus hematíes. Se desarrollan aglutinina completas naturales del tipo IgM muy potentes
contra los antígenos eritrocitarios. Contra el Ag A la aglutinina anti-A y contra el Ag B la aglutinina
anti-B. También puede ser del tipo IgG, aunque poco frecuente y generalmente producidas por
individuos del grupo O.
- Si una persona es del grupo A, en su suero se detectan anticuerpos anti-B.
- Si es del grupo B, en su suero se detectan anticuerpos anti-A.
- Si es del grupo O, en su suero se detectan anticuerpos anti-A y anti-B.

Algunas personas tienen condición secretora, y los antígenos del sistema ABO y sustancia H
se hallan en el plasma, en la saliva y en otros líquidos orgánicos. Su presencia en dichos líquidos está
controlada por el gen “Se”, que es autosómico y dominante. Un individuo secretor tiene un genotipo
“SeSe” o “Sese”, los individuos no secretores poseen un genotipo “sese”.

Subgrupos de A y B
Se han descrito varios subtipos dentro del sistema ABO, hablándose de subgrupos o
variantes. Son debidos a mutaciones en el gen ABO que alteran la eficiencia de la transferasa
codificada o modifican su afinidad por el sustrato sobre el que actúan. De esta forma, la mayor parte
de los subgrupos de A y B son variantes cuantitativas, que presentan menor cantidad del antígeno A
o B sobre la membrana de los hematíes. Hay también aluna variante cualitativa que afecta a la
estructura antigénica, sobre todo al grado de ramificación del antígeno. A1 es el subgrupo
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 mayoritario (80%) en los individuos tipo A. Otros subgrupos de A incluyen A2 (19%), A3, Ax, y Ael. Del
mismo modo, B (B1) es el más común entre los individuos B, y otros subgrupos B son B3, Bx, y Bel. Los
grupos A y B débiles, tienen gran importancia transfusional porque no aglutinan con los antisueros
convencionales anti-A y anti-B, y en la prueba celular pueden ser erróneamente identificados como
O, por lo que en algunos casos se usan métodos moleculares para tipar estos subgrupos. Para
diferenciar entre A1 y A2, el grupo A2 presenta menor cantidad de antígeno y está poco ramificado,
mientras que el A1 está muy ramificado, se pueden diferenciar por aglutinación con una lectina, A1
aglutinará y A2 no.

Grupo Bombay
Con relación al sistema ABO, hay que mencionar un grupo muy poco frecuente denominado
Bombay (grupo Oh), donde se descubrió. Las personas que pertenecen a este grupo poseen dos
alelos recesivos del gen H (hh) por lo que carecen de esterasa H, no pueden producir sustancia H, y
por tanto, tampoco antígenos A ni B. Fenotípicamente, con la prueba celular estas personas se
clasifican como grupo O, pero cuando se analiza su suero (prueba sérica) se obtiene una fuerte
aglutinación con hematíes de todos los grupos, incluidos los del grupo O. Esto es debido a que los
individuos O Bombay poseen anticuerpos anti-A, anti-B y anti-H, y la sustancia H no está presente
como antígeno en los hematíes.

Antígenos
Genotipo H Genotipo ABO Anticuerpos Séricos Grupo Sanguíneo Fenotipo ABO
Hemáticos
AA
HyA Anti-B A A
AO
HH BB
o HyB Anti-A B B
BO
Hh
AB H, A y B --- AB AB
OO H Anti-A y Anti-B O O
Sustancia Anti-A, Anti-B
hh Cualquiera Bombay (Oh) O
precursora y Anti-H

Herencia del sistema ABO

El grupo ABO se hereda mendelianamente, cada individuo tiene dos alelos para el gen ABO,
uno del padre y otro de la madre. Esto constituye el genotipo, el fenotipo viene determinado por los
antígenos expresados en la superficie de los hematíes. Los alelos A y B son codominantes entre sí y
dominantes sobre el O.
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4. Sistema Rh
El sistema Rh (D) es mucho más complejo y el de mayor importancia después del sistema
ABO. Su nombre viene del animal en el que se descubrió, el mono Macacus Rhesus. Ellos clasificaron
a los hematíes humanos de acuerdo con su capacidad de ser aglutinados por los anticuerpos de dicho
mono, en Rh positivo (Rh+) y el Rh negativo (Rh-).

Actualmente existen varias teorías que intentan explicar el sistema Rh. De todas ellas, las dos
más importantes son la de Fisher-Race y la de Wiener. Sólo ampliaremos la de Fisher-Race, ya que es
la más utilizada.

Se han descrito más de 50 antígenos en este sistema, pero los principales son 5: D, C, c, E y e.
Estos antígenos son glicoproteínas integrales de la membrana de los hematíes. Los términos Rh
positivo y Rh negativo se refieren a la presencia o ausencia del antígeno D en los hematíes, ya que es
altamente inmunogénico:

- Las personas que tienen antígeno D son Rh positivas (85% de las personas) y sólo
pueden donar sangre a personas con Rh positivo.

- Las personas que no tienen antígeno D son Rh negativas y pueden donar sangre a
individuos Rh positivos y Rh negativos.

El antígeno D puede ser detectado por una prueba de aglutinación directa con un suero
clasificador anti-D.

En el sistema Rh se incluyen 2 genes situados en el cromosoma 1, estrechamente ligados y

con alto grado de homología:
Gen RHD: codifica para el antígeno D. La expresión del alelo D genera el fenotipo Rh positivo,
la presencia del alelo d en homocigosis, determina el fenotipo Rh negativo. El alelo
d se le llama amorfo o silencioso, porque no se expresa como antígeno.
Gen RHCE: codifica para los antígenos C, c, E y e. En principio hay 4 formas alélicas de este
gen, cada una de las cuales determinan la expresión de una pareja de antígenos: CE,
Ce, cE y ce.
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 Al igual que el sistema ABO, el sistema Rh requiere para poder expresarse, un tercer gen
denominado RHAG, que codifica para una glicoproteína asociada a Rh. Este gen constituye también
un sistema de grupo sanguíneo independiente del sistema Rh.

Anticuerpos del sistema Rh

Los anticuerpos contra los antígenos Rh suelen ser inmunes, son del tipo IgG incompletos,
activos a 37ºC, no fijan complemento, son clínicamente significativos, y generan destrucción
eritrocitaria extravascular en el sistema mononuclear fagocítico. Los que se presentan con mayor
frecuencia son el anti-D, anti-E y el anti-C.

Los anticuerpos producidos en el sistema Rh son de carácter inmune, porque necesitan una
estimulación previa para su aparición en la sangre. Esta estimulación puede producirse por una
primera transfusión con sangre Rh+ o por contacto feto-materno. Un primer contacto de sangres
incompatibles en este sistema da lugar a la formación de anticuerpos con sensibilización de los
hematíes. En un segundo contacto se producirá el rechazo con un proceso hemolítico más o menos
grave. Los anticuerpos del sistema Rh. El más importante de todos ellos es el anti-D producido contra
el Ag D. los otros antígenos de este sistema son menos inmunológicos, poco productores de
anticuerpos, por lo que éstos tienen poco interés transfusional, salvo en ocasiones muy aisladas que
puedan estar presentes en la sangre. Los anticuerpos del sistema Rh suelen estar relacionados con la
enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN), con las anemias hemolíticas autoinmunes (AHAI) y
algunas reacciones transfusionales.

Fenotipos
Debido a lo estrechamente ligados que están sus genes y su orientación opuesta, se suelen
producir recombinación e intercambio genético, lo que produce múltiples variantes parciales y
débiles del antígeno D:
Fenotipos D parcial: se identifican como D, pero carecen de una parte del antígeno. Existen
diversas variantes, reaccionan débilmente a la prueba de antiglobulina humana, pero
pueden generar una respuesta importante en una trasfusión.
Fenotipo D débil: los eritrocitos tienen antígeno D, pero en niveles muy bajos. Esto hace que no se
detecte el antígeno mediante los métodos serológicos rutinarios. Se detecta mediante
la técnica de antiglobulina indirecta.

Ante una transfusión, la presencia de variantes parciales o débiles del antígeno D debe
tratarse como:
- Rh positivo: si es el donante
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- Rh negativo: si es el paciente o receptor de transfusión

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 Fenotipo Rh null o nulo: es un fenotipo raro. Los individuos carecen de todos los antígenos del
sistema Rh. Aunque se conocen varias causas que originan este fenotipo, la principal es
la mutación en el gen RHAG que determina ausencia o alteración funcional de la
glicoproteína asocia a Rh. Esto provoca una anemia hemolítica crónica con aumento de
la fragilidad osmótica, esferocitosis y estomatocitosis.

Herencia del factor Rh

El factor Rh se hereda mendelianamente, pero en lugar de hablar de dos alelos codificantes,
uno paterno y otro materno, hablando de copias funcionales del gen RHD: dos copias (DD), una copia
(Dd o D –) o ninguna copia (dd o – – ). Las personas Rh positivas tienen, al menos, una copia funcional
del gen [(DD) o (Dd o D –)] y las personas Rh negativas no tienen ninguna copia funcional del gen (dd
o – – ).

Compatibilidad
Al combinar los dos sistemas ABO y Rh:

SISTEMA ABO Sistema Rh

Ag en los
Ag de los hematíes Ac en el suero
hematíes
A B Anti-A Anti-B D
A+ SI NO NO SI SI
A- SI NO NO SI NO
B+ NO SI SI NO SI
B- NO SI SI NO NO
AB+ SI SI NO NO SI
AB- SI SI NO NO NO
O+ NO NO SI SI SI
O- NO NO SI SI NO

A+ A- B+ B- AB+ AB- O+ O-
A quién A+ A± B+ B± A+ AB+ Donante
AB+ AB±
puede donar AB+ AB± AB+ AB± B+ O+ universal
De quién A± A- B± B- Receptor A- AB-
O± O-
puede recibir O± O- O± O- universal B- O-

5. Otros sistemas de grupos sanguíneos

Aunque los sistemas antigénicos eritrocitarios más importantes son el ABO y el Rh, se
conocen muchos más. Algunos de ellos tienen importancia transfusional porque son capaces de
producir anticuerpos específicos. Los más importantes son:
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Sistema li
Los antígenos son carbohidratos cuya raíz es el mismo oligosacáridos que el de los antígenos
A, B y H. El antígeno “i” (no ramificado) está presente en los eritrocitos del neonato y el “I”
(ramificado) en la mayoría de los hematíes adultos. Una enzima ramificadora hace que al crecer el
antígeno “i” se convierta en “I”. Los anticuerpos anti-I se asocia con Mycoplasma, y los anti-i con la
mononucleosis infecciosa e infecciones víricas. Son anticuerpos fríos, por lo que antes de
transfundirse las unidades deben calentarse a temperatura fisiológica antes de su administración.

Sistema de Lewis (Le)

Los antígenos de este sistema son solubles, no se encuentran ubicados sobre la membrana
de los hematíes, sino que proceden del plasma, de donde son adsorbidos y se incorporan a la
membrana. Se denominan Lea y Leb, Lea se encuentra en los portadores del gen Lewis pero no del
gen secretor (Se), mientras que el antígeno Leb se produce cuando se asocian al gen secretor. Sus
anticuerpos, anti-Lea y anti-Leb, se producen de forma natural (IgM), que no pueden atravesar la
barrera placentaria y, por tanto, no se da la EHRN. Como es un sistema frecuente, es extraño que se
produzcan reacciones transfusionales.

Sistema P
Tiene un único antígeno, P1. Las personas que expresan el antígeno P1 tienen el fenotipo P1,
las que no, tienen el fenotipo P2. El anti-P1 puede ser una IgM natural que se encuentra en las
personas P2, no activa a 37ºC. Pero en algunas personas puede ser una IgG que sí es activa a 37ºC, y
produce reacciones transfusionales hemolíticas.

Sistema MNS
Se refiere a un grupo de antígenos estrechamente ligados que se heredan conjuntamente, M,
N, S, s y U. los anticuerpos formados pueden ser naturales o inmunes, IgM e IgG. El más importante
de ellos es el Ac anti-M, que puede dar algunas reacciones, aunque es muy poco frecuente. Los
anticuerpos pueden provocar hemólisis por lo que hay que transfundir sangre que carezca de estos
anticuerpos.

Sistema Kell (K)

Se conocen más de 20 antígenos pertenecientes a este sistema. Los más importantes por su
elevada incidencia son el Ag K (Kell) (9%), que es muy inmunógeno y productor de Ac anti-K, y el Ag k
(Cellano) (90%), que es poco inmunógeno. EL antígeno K (Kell) como es poco frecuente, es fácil
encontrar sangre negativa para la transfusión. El antígeno k (Cellano) que es muy frecuente, y por
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ello es complicado encontrar sangre carente cuando es necesaria para una transfusión (lo más

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probable es que la sangre donada lo contenga). Este sistema contiene muchos antígenos
clínicamente significativos, de carácter inmune de la clase IgG, que son estimulados por transfusión o
relación feto-materna. Dan lugar a reacciones transfusionales y a la EHRN.

Sistema Kidd (Jk)

Es un sistema de alta frecuencia en la raza blanca, el cual presenta 2 antígenos, el Jka y el Jkb,
que son inmunógenos débiles. Los anticuerpos formados por inmunización previa son del tipo IgG,
muy poco frecuentes por la alta frecuencia de este sistema. Pueden causar la EHRN y algunas
reacciones transfusionales.

Sistema Duffy (Fy)

Está constituido por dos alelos codominantes localizados en el cromosoma 1 y presentan dos
antígenos Fya y el Fyb. Existen varios fenotipos Fy (a+b-), Fy (a+b+), Fy (a-b+) y muy
infrecuentemente Fy (a-b-). Los anticuerpos de este sistema Duffy son generalmente de tipo inmune
clase IgG y se producen por inmunización previa, se detectan con la prueba de la antiglobulina
indirecta o test de Coombs. Los antígenos Fya y Fyb poseen receptores para el parásito de la malaria
(Plasmodium vivax), por lo que los individuos que son fenotípicamente Fy (a-b-) tienen una
resistencia natural a este parásito. Los anticuerpos del sistema Duffy se observan más
frecuentemente en individuos de raza negra y en pacientes politransfundidos. El anti-Fya es mucho
más común que el anti-Fyb.

Sistema de Lutheran
Posee 2 antígenos, el Lua y el Lub, que son poco estimuladores para la producción de
anticuerpos. Sus anticuerpos, anti-Lua y anti-Lub, pueden ser de la clase IgG o IgM, y causan
patologías leves.

III. PATOLOGÍAS RELACIONADAS CON LA HEMOCOMPATIBILIDAD

1. Reacciones transfusionales
Se ha avanzado mucho en la seguridad en las transfusiones, pero las transfusiones con sangre
incompatible siguen siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad. Una transfusión con
sangre ABO incompatible tiene grandes riesgos e incluso pequeñas cantidades pueden ser fatales en
ciertas condiciones. La destrucción de los eritrocitos ocurre a nivel intravascular y es inmediata
produciendo coagulación intravascular diseminada (CID), fallo renal y muerte.
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 Las causas más comunes no se asocian con errores técnicos, sino con errores administrativos,
como errores en la identificación de los pacientes o de las unidades a transfundir. Las reacciones
transfusionales pueden ser inmunológicas o infecciosas.

1.1 Reacciones transfusionales inmunológicas

Se deben a la presencia en la sangre de antígenos para los que el receptor tiene anticuerpos
o es capaz de sintetizarlos.

Reacción transfusional hemolítica aguda

Tiene lugar durante las 4 horas posteriores a la transfusión, se produce por la reacción de los
anticuerpos existentes en el receptor con los hematíes transfundidos. La más habitual es debida al
sistema ABO. Los anticuerpos se unen a los antígenos de los hematíes y activan el complemento, lo
que ocasiona una hemólisis en el torrente vascular. A su vez, la hemólisis activa el sistema de
coagulación y se produce una coagulación intravascular diseminada (CID), hipotensión,
hemoglobinemia, hemoglobinuria, choque y fracaso renal. Cuanto mayor sea el volumen de sangre
transfundida más grave será la reacción, por lo que es fundamental detener una transfusión en
cuanto se observe cualquier reacción.

Reacción transfusional hemolítica retardada

La reacción se debe a una producción de anticuerpos que tiene lugar entre los 5 y los 14 días
posteriores a la transfusión. Los anticuerpos que no están presente antes de la transfusión, por lo
que no es posible prever esta reacción a partir del estudio de una muestra pretransfusional. Cuando
se producen los anticuerpos, se detecta una bajada inexplicable de hemoglobina y una elevación de
la bilirrubina indirecta, todo ello con poca sintomatología. En estos casos hay que identificar el
antígeno causante de la reacción para que las sucesivas transfusiones que se realicen carezcan de él.

Reacción transfusional febril no-hemolítica

Se debe a anticuerpos del receptor dirigidos contra los leucocitos o las plaquetas de la sangre
que recibe. Su incidencia disminuye con la leucorreducción de los componentes celulares sanguíneos.
Los síntomas son fiebre y escalofríos, en ocasiones hipertensión pero nunca hipotensión.

Lesión pulmonar aguda asociada a la transfusión

Es un edema pulmonar no cardiogénico producido por transferencia de anticuerpos
antigranulocitos del donante al receptor.
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Reacción alérgica (urticaria)
Se produce por hipersensibilidad a alérgenos del plasma del donante. Ocasionalmente puede
provocar reacciones anafilactoides en pacientes con defecto de IgA, debido a la IgA transfundida o
por fármacos presentes en el plasma del donante.

Enfermedad postransfusional del injerto contra huésped (EICH-T)

Se produce en pacientes inmunodeprimidos, y se debe a que los linfocitos existentes en los
componentes sanguíneos transfundidos atacan a las células del huésped. La irradiación de los
componentes sanguíneos previene el EICH-T porque destruye la capacidad de los linfocitos para
replicarse.

Otras
Los anticuerpos antiplaquetarios pueden provocar reacciones febriles transfusionales,
refractariedad plaquetaria (Ac HLA o propios de las plaquetas) y púrpura neonatal inmune.

1.2 Reacciones transfusionales infecciosas

Los componentes sanguíneos pueden transmitir agentes infecciosos, bien procedentes del
donante o bien por contaminación.

Reacción transfusional séptica por contaminación bacteriana

Se debe a la contaminación de los componentes sanguíneos transfundidos. En caso de
detectarse esta reacción hay que analizar las bolsas para identificar el microorganismo causante y
obtener el antibiograma, mientras se inicia un tratamiento con antibióticos de amplio espectro.

Infección viral y otras infecciones

Muchos virus pueden trasmitirse a través de transfusiones sanguíneas: virus de la hepatitis
(A, B, C y G), virus de Epstein-Barr, VIH, HTLV-I y II, citomegalovirus, etc. Se pueden transmitir
enfermedades bacterianas como la sífilis (Treponema pallidum) y enfermedades parasitarias como la
enfermedad de Chagas (Trypanosoma cruzi).

Para evitar contagios hay que analizar pruebas a las unidades que se vayan a usar en
transfusiones.

2. Enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN)

La EHRN se debe a una agresión inmune hacia los eritrocitos fetales por anticuerpos
maternos formados anteriormente, en general en un embarazo, un aborto, o una transfusión
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sanguínea. Un feto hereda los antígenos tanto de la madre como del padre, algunos de ellos son
distintos de los que posee la madre. Durante el embarazo una pequeñísima cantidad de hematíes

Unidad 10 Técnicas de Análisis Hematológico

fetales pueden pasar a la circulación materna, aunque es en el momento del parto cuando esta
cantidad es más importante. Ambas circunstancias, si los antígenos que poseen los hematíes fetales
son diferentes de los maternos, se forman anticuerpos contra ellos en la circulación materna. Si esto
sucede, los aloanticuerpos formados contra los antígenos eritrocitarios extraños en un segundo
embarazo pueden reaccionar contra los antígenos de los hematíes fetales que posean dichos
antígenos, causando su destrucción y hemólisis.

La placenta normalmente es impermeable al paso de células sanguíneas y de

macroglobulinas, como la IgM, pero permite el paso de globulinas de bajo peso molecular, como la
IgG. Los antígenos del sistema Rh, especialmente Ag D, y los del sistema ABO, son los que están
implicados de forma más habitual en los casos de EHRN, debido a que estos antígenos tienen un
elevado poder inmunógeno e inducen a la formación de aloanticuerpos tipo IgG. En este proceso de
sensibilización de la madre, también pueden intervenir los antígenos relacionados son los Kell y Kidd.

Cuando los hematíes fetales poseen un grupo Rh o ABO incompatibles con el de la madre,
ésta se inmuniza contra ellos y produce una intensa síntesis de anticuerpos, sobre todo en un
segundo embarazo con las mismas características de incompatibilidad. Cuando la incompatibilidad es
combinada, tanto para Rh como para el grupo ABO, los eritrocitos fetales que consiguen atravesar la
placenta son rápidamente destruidos por los anticuerpos naturales del sistema ABO de la madre, lo
cual impide el desarrollo de la inmunización. La incompatibilidad aislada del sistema ABO no tiene
gran importancia clínica, ya que sólo se producirán reacciones hemolíticas en los recién nacidos cuya
madre posea un título de Ac anti-A y anti-B muy elevado. La incompatibilidad del Rh- aislada es la
que con más frecuencia produce inmunización de la madre, sobre todo hacia el Ag D, causando
hemólisis de los eritrocitos fetales en un segundo embarazo incompatible. Siempre que en los
segundos embarazos se desarrollen fetos compatibles con el Rh- de la madre, no habrá reacción
inmunológica contra los hematíes del feto.

La hemólisis de los eritrocitos fetales depende del grado de inmunización materna, es decir,
de la cantidad de anticuerpos formados. Puede ser ligera, aunque en general suele ser muy grave. El
proceso de hemólisis produce en consecuencia una anemia intensa y bilirrubinemia, ésta tiende a
depositarse en diferentes tejidos, especialmente en el sistema nervioso central, provocando
trastornos neurológicos graves.

Control
Todas las mujeres, tras confirmar el embarazo, deben realizarse el grupo ABO y Rh,
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incluyendo la prueba del D débil en los casos de Rh negativo y un escrutinio de anticuerpos

irregulares.

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 - Para evitar la inmunización frente al antígeno D, a las mujeres Rh negativo se les debe
administrar una dosis de antiglobulina anti-Rh a las 28 semanas de embarazo, y otra
dentro de las 72 horas siguientes al primer parto, si el recién nacido es Rh positivo.
También se administran en situaciones de riesgo de sensibilización (abortos,
amniocentesis, etc.).
- Si se detecta un anticuerpo irregular hay que titularlo y si presenta niveles elevados o en
aumento puede necesitar estudios fetales más complejos como una amniocentesis y
determinación de bilirrubina en el líquido amniótico.
- Con las técnicas moleculares es posible obtener ADN fetal y conocer el RhD fetal.

Es importante determinar estos puntos para aplicar la antiglobulina anti-Rh y también para la
mujer sensibilizada con pareja heterocigota al gen RHD, de manera que el feto Rh negativo no
requerirá posteriores evaluaciones, mientras que el feto Rh positivo debe ser controlado a lo largo de
la gestación y en ocasiones es preciso realizar transfusión intraútero.

Tras el parto, debe practicarse al recién nacido una prueba de la antiglobulina directa e
investigación de posible hemólisis para realizar el tratamiento adecuado si es preciso. La
incompatibilidad en el sistema ABO para el recién nacido es frecuente y puede existir algún grado de
enfermedad hemolítica.

3. Anemias hemolíticas

3.1 Anemia hemolítica autoinmune (AHAI)

Se producen por autoanticuerpos dirigidos contra los antígenos de membrana de los
eritrocitos. Estás pueden ser:

Anemia hemolítica autoinmune por anticuerpos calientes

Los anticuerpos muestran su máxima reactividad a 37ºC y son predominantemente de clase
IgG. Los hematíes recubiertos con los autoanticuerpos (sensibilizados) y/o complemento son
destruidos por los macrófagos esplénicos (hemólisis extravascular). Cuando no se identifica la causa
se denomina AHAI idiopática.

Anemia hemolítica autoinmune por anticuerpos fríos

Los anticuerpos reaccionan de forma óptima a temperaturas inferiores a 37ºC y la mayoría
de ellos son IgM. Las causas pueden ser idiopáticas, secundaria a una alteración (síndromes
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linfoproliferativos o infecciones). Los cuadros de AHAI por anticuerpos fríos que cursan con anemia

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moderada de forma estable pueden requerir como único tratamiento evitar la exposición al frío. La
transfusión ce concentrados de hematíes plantea problemas técnicos en la determinación del grupo
sanguíneo y en la detección de posibles aloanticuerpos. Por eso deben reservarse para situaciones
graves y se aconseja transfundir la menor cantidad posible, de forma lenta y con la sangre a 37ºC.

Hemoglobinuria paroxística por frío

Es la menos frecuente de las AHAI. Los anticuerpos son de la clase IgG, se unen al eritrocito a
bajas temperaturas pero causan la hemólisis a 37ºC, cuando se completa la secuencia del
complemento. Antes se denominaba hemoglobinuria paroxística a frigore. Se caracteriza por
episodios agudos de hemólisis intravascular tras exposición al frío, desencadenados por una
hemolisina típica.

Es menos frecuente que coexistan autoanticuerpos calientes y fríos como responsables del
cuadro hemolítico (AHAI mixta).

El origen inmune de una anemia hemolítica se pone de manifiesto mediante la demostración

de anticuerpos y/o complemento en la membrana de los hematíes mediante el test de Coombs
directo o test directo de antiglobulina.

3.2 Anemia hemolítica inducida por fármacos

Algunos fármacos, como la alfametildopa, forman complejos inmunogénicos (IgG) y provocan
una hemólisis que puede ser grave. El anticuerpo se detecta con la prueba de la antiglobulina o de
Coombs y la hemólisis se corrige al interrumpir la administración del medicamento.

IV. TÉCNICAS PARA EL ESTUDIO DE LA HEMOCOMPATIBILIDAD

La aglutinación es la técnica más utilizada para la detección de antígenos eritrocitarios, pero
la metodología ha sufrido sucesivas transformaciones hasta su aplicación en tarjetas con columnas
de gel, que pueden usarse en sistemas automatizados.

Además, la existencia de las técnicas moleculares ayuda a la resolución de problemas que no

pueden ser resueltos con técnicas de hemaglutinación:
- Imposibilidad de detectar ciertos antígenos debido a la débil reactividad de algunos
reactivos frente a ellos.
- Tipificación de pacientes con transfusiones recientes.
- Identificación de riesgo de EHRN.
- Mejora de la fiabilidad de las unidades antígeno negativas para transfusión.
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 Hay que tener en cuenta que la identificación de un genotipo no significa que todos los
antígenos se vayan a expresar en los hematíes.

1. Las técnicas de aglutinación

Son técnicas inmunológicas que se basan en la capacidad que tienen algunos antígenos para
unirse a sus anticuerpos complementarios dando lugar a inmunocomplejos o agregados visibles a
simple vista. Mediante estas técnicas se pueden determinar los antígenos presentes en los hematíes
y también los anticuerpos presentes en el suero o plasma:
- Para detectar un antígeno presente en un hematíe se debe poner en contacto una
suspensión de hematíes con el anticuerpo específico para ese antígeno.
- Para detectar un anticuerpo presente en plasma o suero, se debe poner en contacto una
muestra de ese suero con hematíes que contengan el antígeno específico para ese
anticuerpo.

2. Preparación de las muestras

Se necesita:
- Preparar adecuadamente la muestra de sangre: determinar la presencia/ausencia de un
antígeno eritrocitario será necesario elaborar una suspensión de células con una
concentración adecuada y libre de elementos que puedan generar falsos positivos.
- Disponer de los antígenos o anticuerpos específicos para la determinación (comerciales).

2.1 Preparación de una suspensión de hematíes

Muchas pruebas utilizan hematíes de la sangre problema para determinar antígenos
presentes en ellos. Para que estas determinaciones sean válidas hay que lavar los hematíes con
solución salina para eliminar el plasma, hematíes hemolizados y coágulos que puedan ocasionar
falsos positivos. Después se prepara una suspensión de hematíes, cuya concentración estará
determinada por las pruebas que se vayan a realizar a continuación.

2.2 Preparación de células A, B y O

Para realizar pruebas para determinar anticuerpos en suero se necesita disponer de los
antígenos correspondientes. Los laboratorios suelen preparar suspensiones de hematíes de los
grupos A, B y O, que utilizan posteriormente en diversas pruebas.

3. Aglutinación en tubo y en placa

Las metodologías clásicas que se siguen aplicando, son las técnicas de aglutinación en tubo,
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en placa o en microplaca.

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3.1 Técnicas de aglutinación en placa
Es una técnica que tiene muchas aplicaciones. La más tradicional en hematología es la
determinación del grupo ABO.

3.2 Técnica de aglutinación en microplaca

La técnica de algutinación se puede realizar en microplacas, que cuentan con un número
variable de pocillos en los que tienen lugar las distintas reacciones.

Existen microplacas para estudios de hemocompatibilidad, cuyos pocillos están tapizados con
anticuerpos. Habrá que seguir las instrucciones del fabricante, se van depositando las suspensiones
de hematíes de las muestras en estudios en los pocillos, se incuba y se observa si hay aglutinación. En
ese caso, los pocillos con reacción positiva tienen un aspecto rojo uniforme, porque los hematíes se
unen a los anticuerpos y cubren la superficie del pocillo. Los pocillos con reacción negativa presentan
un botón celular en el centro del pocillo porque los hematíes que no se han unido a los anticuerpos
sedimentan en la región central. La lectura de los resultados se puede hacer visualmente o utilizando
un lector de placas.

3.3 Técnica de aglutinación en tubo

El fundamento es el mismo, pero la prueba se realiza en tubos. Mediante esta técnica se
necesita más muestras, pero también se pueden observar mejor los resultados a simple vista.

4. Aglutinación en columna de gel

La tecnología de microtipificación en gel se basa en la separación por tamaño de los
eritrocitos que hayan aglutinado, lo cual se consigue mediante un proceso de centrifugación en un
gel poroso colocado en una columna. El tamaño de poro del gel permite el paso de los hematíes que
no han reaccionado con el antisuero y que mantienen sus membranas intactas y elásticas. El tamaño
de los agregados y microagregado, y la pérdida de elasticidad de las membranas eritrocitarias por su
reacción con el antisuero, impiden o dificultan su migración a través de la columna de gel. En
consecuencia, en las reacciones fuertemente positivas, los hematíes aglutinados (macroagregados)
son retenidos en la superficie de la columna. En las reacciones débilmente positivas, los
microagregados se distribuyen en la zona media de la columna. Y en las reacciones negativas, los
hematíes se acumulan en el fondo de la columna.

4.1 Tarjetas DG Gel®

Son tarjetas con varias columnas de gel, en cada una de las cuales tiene lugar una prueba
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hematoinmunológica. Existen distintos tipos de tarjetas, según la combinación de pruebas que

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incluyan: tipaje ABO, fenotipo Rh, detección de anticuerpos irregulares, pruebas cruzadas o test de
Coombs directo e indirecto.

Las columnas de gel

Partes de la tarjeta:
Cámara de reacción/incubación: es la zona donde se deposita la muestra y tiene lugar la reacción Ag-
Ac. Contiene un reactivo específico para la prueba correspondiente.

Cuello: proporcionar una mayor resistencia a la caída de los reactivos hacia el gel de la columna,
debido a que en esta zona se produce un efecto vacío.

Columna: contiene un gel sephadex compuesto por microesferas de dextranos, que permiten una
alta definición de la reacción de aglutinación, debido al tamaño de sus partículas y a una
distribución globular homogénea.

Fondo en V: proporciona una mayor definición de los resultados negativos o compatibles y

débilmente positivos.

Tipos de tarjetas DG-Gel®

El sistema dispone diferentes tipos de tarjetas, con diferentes combinaciones de pruebas:
- Tarjeta ABO/Ah: exclusivamente para la determinación de los grupos sanguíneos
hemáticos (directa) y sérico (inversa), y el Rh.
- Otros grupos: Kell, etc.
- Fenotipo Rh completo
- Identificación de Ac’s irregulares
- Pruebas cruzadas.

4.2 La autorización
Las tarjetas son muy fáciles de usar y funcionan en procedimientos manuales,
semiautomatizados y automatizados.

5. La lectura de resultados
En todas las pruebas de aglutinación, el resultado es visible y se establece fácilmente el
positivo o negativo. En el caso de las microplacas, se pueden usar lectores de microplacas y las
tarjetas DG Gel® se leen con un sistema automatizado.
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V. PRUEBAS DE HEMOCOMPATIBILIDAD
La reacción entre los Ag’s eritrocitarios y los Ac’s (suero/plasma de pacientes o reactivos
comerciales) es la base de la inmunohematología. Las pruebas de hemocompatibilidad están
encaminadas a evitar la reacción hemolítica aguda.

1. Determinación de grupo ABO

Determinación directa: grupo celular. Se usan anticuerpos anti-A y anti-B para establecerla presencia
o ausencia de antígenos A y B en los hematíes.

Determinación inversa: grupo sérico. Se usan hematíes reactivos A y B para establecer la presencia o
ausencia de anticuerpos anti-A y anti-B en el suero.

De forma general hay que tener en cuenta que:

Los Ac’s anti-A y anti-B séricos de la mayoría de los pacientes y donantes suelen ser demasiado
débiles para aglutinar los glóbulos rojos sin centrifugación o incubación prolongada, por lo
que son necesarias pruebas serológicas con métodos que detecten los anticuerpos en
tubos, microplacas o aglutinación en columnas.

En la determinación del grupo celular, además de Ac’s anti-A y anti-B se usan también Ac’s anti-AB,
para no pasar por alto antígenos A y B débiles. Los anticuerpos de este reactivo poseen
gran afinidad por los antígenos débiles y pueden provocar aglutinación aunque los anti-A y
los anti-B no la hayan provocado.

1.1 Técnicas de tipificación ABO

Se usan técnicas de aglutinación:
- En placa o microplaca.
- En tubos
- En columnas de gel

1.2 Discrepancias entre las pruebas celular y sérica

Cuando hay discrepancias entre el tipaje directo e inverso hay que investigar la causa y
resolverla antes de transfundir. Porque las pruebas directas e inversas son complementarias. Aunque
estas pruebas tienen buenos controles de calidad, a veces existen discrepancias que hay que
investigar:

Discrepancias por problemas de hematíes

- Antígeno A débil o ausente: no se detectan Ag’s A, pero tampoco Ac’s anti-A (propios del
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grupo B).
- Antígeno B adquirido: se detecta una pequeña cantidad de Ag’s B y también Ac’s anti-B.

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 - Glóbulos poliaglutinales: se detectan Ag’s A y B, pero también Ac’s anti-A y anti-B
- Campos mixtos: unos hematíes aglutinan y otros no, se debe a la presencia de más de una
población celular.
- Anticuerpos esperados no presentes: no se detectan los Ac’s ABO recíprocos.

Discrepancias por errores técnicos

Pueden existir errores cometidos durante la determinación del grupo sanguíneo, para
evitarlos hay que aplicar correctamente los procedimientos. Los errores más habituales son:
- Estandarización o conservación incorrecta de los antisueros.
- Muestra de sangre contaminada.
- Formación de pilas de monedas o roleaux.
- Presencia de gelatina de Wharton.
- Presencia de autoanticuerpos y anticuerpos de reacción en frío.
- Técnica incorrecta.

2. Determinación del grupo Rh

Es la tipificación Rh de rutina de donantes y pacientes, sólo es preciso determinar el antígeno
D. La determinación de otros antígenos Rh solo se efectúa en circunstancias especiales (Ac’s Rh
inesperados, pruebas de paternidad, etc.).

2.1 Determinación del antígeno D

Se pueden realizar mediante técnicas manuales, semiautomatizadas y automatizadas de
tubo, microplaca o columna de gel. Se usan sueros clasificadores o tarjetas de geles que contengan
anti-D.

2.2 Determinación del genotipo del sistema Rh

Se puede determinar el genotipo con estudios genéticos, pero el procedimiento clásico es
establecer el genotipo a partir del fenotipo. Esta técnica se basa en enfrentar los hematíes problema
con sueros anti-D, anti-C, anti-E, anti-e y anti-c. Y a partir del fenotipo obtenido se obtiene el
genotipo más probable.

3. Detección de anticuerpos irregulares

Los anticuerpos aloinmunes contra antígenos eritrocitarios, diferentes a los anticuerpos
naturales del sistema ABO se denominan anticuerpos irregulares (AI). Los AI suelen aparecer:
- En respuesta a la exposición a un antígeno eritrocitario extraño, por transfusión o
trasplante.
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- Por incompatibilidad materno-fetal.

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3.1 Técnicas para la detección de anticuerpos irregulares
Las técnicas se basan en la aglutinación y se pueden realizar en tubo y en columna. En las
pruebas anteriores es indiferente usar suero o plasma, pero en esta hay que tener en cuenta que el
uso de plasma podría impedir la detección de Ac’s irregulares que se revelan solamente por la
presencia de complemento adherido a los eritrocitos. Los paneles de hematíes para la identificación
de Ac’s irregulares deben expresar al menos: D, C, E, c, e, M, N, S, s, P1, Lea, Leb, K, k, Fya, Fyb, Jka y
Jkb.

4. Pruebas cruzadas
Una vez considerados los grupos y los anticuerpos irregulares se realiza un último grupo de
pruebas, también basadas en aglutinación, que enfrentan la sangre seleccionada para la transfusión
con el receptor concertó al que se va a hacer la transfusión. Se denominan pruebas cruzadas:
Prueba cruzada mayor: detecta Ac’s en el receptor contra Ag’s presentes en las células que se van a
transfundir. Utiliza suero o plasma del receptor y hematíes del donante.

Prueba cruzada menor: detecta Ac’s en el donante contra Ag’s presentes en los hematíes del
receptor. Usa suero del donante y hematíes del receptor.

5. Otras pruebas de compatibilidad

5.1 Prueba de compatibilidad plaquetaria

En la transfusión de concentrados de plaquetas (CP), las pruebas de compatibilidad solo se
realizan de modo excepcional en casos de sospecha de anticuerpos. Siempre que sea posible, se
debe conservar la identidad ABO, aunque también se puede transfundir concentrados con
incompatibilidad celular (mayor) o sérica (menor) respecto del grupo del receptor. En estos casos
está demostrada la menor supervivencia plaquetaria.

5.2 Prueba de compatibilidad plasmática

En la transfusión de PFC no se llevan a cabo pruebas de compatibilidad de manera rutinaria,
pero es importante tener en cuenta la compatibilidad ABO. En principio el grupo ABO del plasma
debe ser idéntico al del receptor.
Los receptores O: pueden recibir PFC de cualquier grupo. Los receptores A o B: deben recibir
PFC de su grupo, si no AB, y como última opción A para grupos B o AB, y B para grupos A o AB.
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VI. PRUEBAS INMUNOHEMATOLÓGICAS DIAGNÓSTICAS

1. Pruebas de la antiglobulina o Test de Coombs

Consiste en reacciones de hemaglutinación. Se basan en el uso del reactivo de Coombs, que
es un antisuero animal contra globulinas humanas y/o complemento. Este reactivo contiene, por
tanto, Ac’s frente a las inmunoglobulinas humanas y/o proteínas del complemento (C3 y C4). El
reactivo de Coombs puede ser:
- Monoespecífico: con anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM o anti-C3-C4.
- Poliespecífico: incluye anti-IgG y anti-C3.

La técnica se puede realizar en tubo, en microplaca o en columnas de gel.

1.1 Pruebas de antiglobulina directa (PAD) o Test de Coombs directo

En la prueba de antiglobulina directa se enfrentan los eritrocitos del paciente con el suero
antiglobulina humana y/o anticomplemento. En caso de resultado positivo, se aglutinan. Esta prueba
permite detectar la presencia de anticuerpos (IgG) unidos a antígenos eritrocitarios de membrana
y/o complemento (C3) unido a la membrana de los hematíes. Es especialmente útil para diagnosticar
anemias hemolíticas autoinmunes y por fármacos.
La prueba se incluye también en ciertos estudios de hematocompatibilidad y se realiza a
donantes de sangre y a neonatos Rh positivos nacidos de madres Rh negativas candidatas para
profilaxis con inmunoglobulina anti-Rh.
Resultados:
- Si se produce aglutinación, se considerará positiva; quiere decir que existen hematíes
sensibilizados.
- La ausencia de aglutinación indicará prueba negativa; quiere decir que los hematíes no
están sensibilizados. Es conveniente que los resultados negativos se confirmen con la
observación microscópica de la mezcla para dar un resultado negativo definitivo.
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1.2 Prueba de antiglobulina indirecta (PAI) o Test de Coombs indirecto
Permite aumentar la sensibilidad de las pruebas clásicas de hemaglutinación.
Concretamente, permite detectar la formación de complejos Ag-Ac en casos en los que la cantidad
de antígeno es muy pequeña (antígenos D débiles) o cuando la concentración de anticuerpos es muy
baja o se trata de anticuerpos no aglutinantes (algunos irregulares, como los del sistema Duffy).

En ambas situaciones, la técnica clásica de hemaglutinación da un resultado negativo (no hay

aglutinación), a pesar de que hay unión de anticuerpos a antígeno eritrocitarios. Una segunda
reacción de los anticuerpos contenidos en el reactivo de Coombs con las inmunoglobulinas unidas a
los antígenos eritrocitarios propiciará la formación de macroagregados y la aglutinación.

2. Test de Donath Landsteiner

La hemoglobinuria paroxística por frío suele dar positivo a C3 y negativo a IgG en la prueba
de antiglobulina directa que se practica durante una crisis. Pero este resultado no es determinante y
es necesaria una prueba específica: el test de Donath-Landsteiner.
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 ANEXO I: PROTOCOLOS
1. PREPARACIÓN DE UNA SUSPENSIÓN DE HEMATÍES
Para hacer esta preparación se toma la muestra de sangre recogida en una tubo con EDTA y se
sigue este procedimiento:
1- Centrifugar los tubos con las muestras 5 min a 3.500 rpm.
2- Verificar que los tubos no presentan hemólisis ni coágulos de fibrina. Si se detecta presencia de
fibrina, centrifugar nuevamente a 3.5000 rpm otros 5 min.
3- Retirar el plasma sobrenadante con una pipeta pasteur, dejando los hematíes con la mínima
cantidad de plasma posible.
4- Poner 0.2-0.5ml de hematíes en un tubo de ensayo de 12 x 75 mm.
5- Agregar solución salina al 0.9%, hasta 1cm del borde del tubo. Tapar el tubo e invertir suavemente
varias veces para que los hematíes se resuspendan en la solución salina.
6- Centrifugar durante 2 min a 3.5000 rpm y decantar la solución salina.
7- Agregar un poco de solución salina y agitar para resuspender los hematíes. De esta forma se
completa un lavado.
8- Repetir los pasos 5 a 7 hasta completar 3 lavados. En el último la solución salina debe quedar clara,
sin signos de hemólisis.
9- Agregar solución salina. La concentración de hematíes que se debe conseguir depende de la
técnica que se vaya a aplicar.

2. PREPARACIÓN DE CÉLULAS A, B y O
Procedimiento:
1- Seleccionar una muestra de sangre anticoagulada del grupo A y realizarle la prueba con lectina
anti-A1 para verificar que es A1.
2- Seleccionar una muestra de sangre anticoagulada del grupo B.
3- Seleccionar una muestra de sangre anticoagulada del grupo O.
4- Centrifugar los tubos con las muestras 5 min a 3.500 rpm y descartar el plasma sobrenadante con
una pipeta pasteur.
5- Colocar 1ml de paquete globular en un tubo 12 x 75 mm y lavar las células 4 veces. Descartar el
sobrenadante en el último lavado completamente.
6- Tomar el recipiente destinado para el almacenamiento que corresponda, añadiendo 0.5 ml de
hematíes lavados y 9.5 ml de solución salina.
7- Almacenar a 4ºC.

3. AGLUTINACIÓN EN PLACA
Procedimiento:
1- Depositar una gota de suero anti-A, anti-B y anti-AB, separadas entre ellas unos centímetros.
2- Depositar una gota de hematíes problema en suspensión al 10% sobre cada gota y mezclar con
movimientos circulares.
3- Agitar la placa con suaves movimientos de rotación
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4- Observar cada gota y ver si se ha producido aglutinación (positivo)

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 ANEXO II: PROTOCOLOS
4. TÉCNICA DE AGLUTINACIÓN EN TUBO
Protocolo:
1- Pipetear en un tubo pequeño de hemólisis una gota del antisuero correspondiente y una gota de
una suspensión de los hematíes en estudio.
2- Mezclar por agitación y centrifugar 1 min a 1.000 rpm.
3- Visualizar la presencia de aglutinación dando suaves toque en la base del tubo: si no hay
aglutinación los hematíes se resuspenden homogéneamente, mientras que si hay aglutinación se
observarán grandes grumos que no se disgregan.
Determinación del genotipo del sistema Rh

5. DETERMINACIÓN DEL GENOTIPO DEL SISTEMA RH

Protocolo:
1- Rotular 5 tubos de centrífuga: D, C, E, c y e.
2- Añadir una gota de suspensión de hematíes a cada tubo y una gota del antisuero correspondiente.
3- Centrifugar todos los tubos a 1.000 rpm durante 1 min.
4- Observar si existe aglutinación o no. Para hacerlo, golpear suavemente con los dedos en el fondo
del tubo para despegar el botón hemático. Si existe aglutinación se observarán grumos de color
rojo.
5- Interpretación del resultado.

6. TEST DE COOMBS DIRECTO

Protocolo:
1- Preparar una suspensión de hematíes al 50% y lavar cuatro veces utilizando una solución isótonica.
2- Colocar una gota de la suspensión en un tubo de hemólisis y agregar una gota de reactivo de
Coombs.
3- Mezclar por agitación e incubar durante 2 min a temperatura ambiente.
4- Centrifugar a 1.000 rpm durante 1 min.
5- Observar si hay aglutinación golpeando suavemente con los dedos en el fondo del tubo para
despegar el botón hemático. Si existe aglutinación, el resultado de la prueba es positivo.
6- Todos los tubos negativos se someten a un control de Coombs: añadir una gota de hematíes
sensibilizados (reactivo comercial) y volver a centrifugar, con lo que se producirá aglutinación. Esto
indica que el suero de Coombs funciona bien y no está bloqueado por inmunoglobulinas libres. Si
el control de Coombs sigue dando negativo se invalida la prueba porque el suero de Coombs no
funciona bien.
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 ANEXO II: PROTOCOLOS
7. TEST DE COOMBS INDIRECTO
Un ejemplo para la detección en suero materno de Ig anti-Rh que puedan provocar EHRN en
un feto Rh+:
1- Incubación del suero materno con hematíes Rh +: si hay Ig anti-Rh se unirán a los hematíes. La
incubación puede ser a 37ºC
2- Incubación de la mezcla anterior con reactivo de Coombs: si los hematíes están recubiertos de
anticuerpos (sensibilizados) anti-Rh procedentes del suero materno, se dará aglutinación.

8. TEST DE DONATH-LANDSTEINER
Protocolo:
1- Extraer 2 muestras de sangre del paciente, en 2 tubos sin anticoagulante.
2- Poner las muestras en un baño a 37ºC durante 10 min.
3- Centrifugar 10 min a 3.000 rpm y separar el suero.
4- Preparar 4 tubos rotulados (1, 2, 3, y 4). Depositar 2 gotas de suero del paciente y 2 gotas de una
suspensión de eritrocitos O en cada uno de los 4 tubos.
5- Añadir al tubo 4 dos gotas de suero normal fresco como fuente de complemento.
6- Incubar:
a. Tubo 1: en hielo 0ºC durante 90 min
b. Tubo 2: a 37ºC durante 90 min
c. Tubo 3: 0ºC durante 30 min, y después a 37ºC durante 60 min
d. Tubo 4: 0ºC durante 30 min, y después a 37ºC durante 60 min
7- Concluidas las incubaciones, centrifugar los 4 tubos a 3.000 rpm durante 10 min.
8- Observar el aspecto de los sobrenadantes en busca de signos de hemólisis.
9- La prueba es positiva si se ve hemólisis en los tubos 3 y 4, y no en los tubos 1 y 2.

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