Informe trabajo práctico nº 1
Nombre: Jaime Alonso Barrueto Estay
Fecha: 11/11/18
Título: Predicción de la estructura 3D de proteínas: creación de modelo por homología de la proteína
Ferredoxina de M. luteus.
Parte 1: Resumen y resultados obtenidos
En el práctico de laboratorio computacional se realizó un modelamiento 3D de la proteína Ferredoxina
de M. luteus mediante el criterio de homología de proteínas. Para esto se procedió a realizar una
búsqueda en BLAST en la pagina web Uniprot [1] con la secuencia de dicha proteína extraída del
archivo FASTA. Se obtuvieron diversos modelos candidatos que poseen diferentes grados de
identidad con nuestra proteína problema. Se eligió aquella con mayor porcentaje de identidad, que es
de 74,5 % [2], la que corresponde a la Ferredoxina de M. smegmatis (2V2K), y se descargó en formato
PDB.
A continuación se procedió a realizar un alineamiento entre las secuencias problema y homologa con
el script [Link], consiguiendo 2 archivos resultantes, uno en formado PIR y el otro en formato
PAP (mas simple de observar).
Luego se continuó con el modelamiento. Para esto se usó otro script llamado [Link] el cual
estaba escrito para generar 4 modelos a los cuales se les dieron nuevos nombres con el comando
mv; rasmol se utilizó para observar los modelos 3D obtenidos.
Se procedió a evaluar dichos modelos, y para esto con la ayuda de la herramienta que nos da
Modeller, la que nos entrega perfiles energéticos calculados para cada modelo, o entre otras
palabras, el DOPE score, que es en resumen, un potencial estadístico. Los resultados obtenidos
fueron los que se indican en la tabla 1.
Tabla 1. DOPE score obtenido para cada modelamiento
Modelo FXD* DOPE score
FXD.01 -10592.000000
FXD.02 -10381.005859
FXD.03 -10479.704102
FXD.04 -10426.311523
Parte 2: Cuestionario
1. Considerando la búsqueda realizada mediante BLAST en base de datos de Uniprot. En el
caso del modelamiento de la Ferredoxina, ¿Qué otras estructuras se podrían haber utilizado
como molde, en lugar de 2V2K?
R: De todas las estructuras arrojadas en la búsqueda por BLAST, 2V2K es la estructura que posee
mayor porcentaje de identidad, con un 74,5 %, y se recomienda, para modelos por homología de
secuencia proteica, un porcentaje de identidad mayor a 60% [3], puesto que la fiabilidad del modelo
aumenta con este porcentaje. El resto de estructuras arrojadas por BLAST poseen porcentajes de
identidad menores a 60 %, pero si se quisiera usar otra secuencia como molde para el modelamiento,
aparte de 2V2K, se podrían usar: la Ferredoxina 7Fe de H. schlegelli, que posee un 59,2 % de
identidad; también se puede utilizar la secuencia de la Ferredoxina de T. thermophilus que posee un
55,6 % de identidad, y desde ahí en adelante se arriesga mucho al ocupar secuencias con bajo
porcentaje de identidad, pues el modelo resultante no sea tan bueno. Por otra parte, en la bibliografía
se ha señalado que se han conseguido modelos de muy buena calidad con un porcentaje de
identidad mayor al 30%[3].
2. Al ejecutar el modelamiento, ¿por qué se construye más de un modelo?
R: El método utilizado es comparativo o por homología, y mas específicamente por satisfacción de
restricciones moleculares, el cual se encarga de ver y analizar parámetros como distancias, ángulos,
orientaciones, posiciones, entre otros, de los átomos de las estructuras alineadas [4]; en los diferentes
modelos que se generan se varían de muchas maneras estos parámetros, arrojando finalmente un
potencial estadístico (DOPE score) diferentes entre todos ellos (incluso por muy mínimo que sea), y
por tanto entre todos los modelos generados podemos tomar una decisión con respecto a qué modelo
es más representativo. Así, podríamos haber realizado muchos mas modelos y haber elegido entre
todos ellos el que más nos acomodo bajo los criterios pertinentes.
3. ¿Cómo fue llevado a cabo la evaluación de los modelos generados? Investigue, defina y
explique la evaluación realizada con DOPE.
R: El DOPE score, por sus siglas en ingles, que significan: Energía discreta de proteínas optimizada,
es un potencial estadístico basado en la estructura nativa de la proteína. Esta estructura nativa tiene
generalmente la energía libre mas baja de todos los estados, bajo condiciones nativas, así, un función
de la energía libre podría permitir la predicción y evaluación de estructuras de proteínas. Entonces, un
enfoque que se usa para obtener aproximaciones de la energía libre consiste en la construcción de
una función de puntuación cuyo mínimo global corresponda a una estructura nativa a partir de una
muestra de estructuras nativas de diferentes secuencias, estas las encontramos en una base de
datos en formato PDB. Así, debido a la dependencia con la estructura de proteínas conocidas, la
función de puntuación se le denomina potencial de conocimiento o potencial estadístico, el cual en
este caso corresponde al DOPE score, que es dependiente de la distancia atómica, que se calcula a
partir de una muestra de estructura de proteína nativa y se basa completamente en teoría de
probabilidades [5]. Por tanto, se debe elegir el menor puntaje DOPE, la cual nos indica menor energía
libre asociada al modelo, y se espera que este sea un mejor modelo de la proteína de interés.
4. ¿Existen otras formas de evaluar los modelos, además de DOPE? Mencione al menos tres.
R: Entre algunos de los métodos o plataformas que nos permiten evaluar los modelos generados
están:
a) Ramachandran plot: Los gráficos de Ramachandran proporcionan una manera fácil y directa de
visualización de la distribución de los ángulos de torsión de una estructura proteica, ademas de
entregar una visión general de las regiones permitidas y no permitidas para estos ángulos,
indicándonos la calidad de la estructura tridimensional de una proteína [5]
b) ProSA: Es un servidor en línea que permite analizar el z-score y la energía en función de la
posición de la secuencia. Con este puntaje se puede determinar la calidad del modelo general,
comparando su puntaje con el puntaje de proteínas cristalizadas por rayos X o NMR con un tamaño
similar. Además, el análisis de la energía a lo largo de la secuencia permite detectar regiones con
energía positiva que por lo general resultan problemáticas e incluso, con errores.[5][6]
c) PROCHEK: este programa descargable de la web permite verificar la calidad estereoquímica de
una estructura de proteína, produciendo una serie de graficos PostScript que analizan su geometría
general y de residuo por residuo. [7]
d) CAMEO: es un proyecto en comunión para evaluar continuamente la precisión y confiabilidad de
los servidores de predicción de estructura de proteína. En la actualidad, CAMEO evalúa las
predicciones de estructura de proteínas tridimensionales predichas, predicciones del sitio de unión a
ligandos en proteínas y las herramientas de estimación de la calidad del modelo. [8]
5. De los modelos construidos para el modelamiento de la ferredoxina. ¿Con cuál modelo se
quedaría y por qué?
R: Como ya se mencionaba en la respuesta de la pregunta 3, el DOPE score nos entrega un valor
estadístico de la energía libre asociada al modelo, la elección del modelo mediante la selección del
puntaje DOPE mas bajo es lo que se debe hacer, así, en nuestro caso, se debería elegir el modelo
FXD.01 con un DOPE score de -10592.000000.
6. ¿En qué circunstancia, o para qué un investigador podría considerar agregar restricciones
experimentales al modelo?
R: Para que una proteína se encuentre en su estado nativo esta debe estar en un ambiente o inmersa
en un solvente que le proporcione las condiciones adecuadas para que se cumpla aquello. Entre
estas condiciones destaca por ejemplo la polaridad del solvente, pH, temperatura, presión, unión de
ligandos o interacción entre proteínas, entre otras. Estas son las restricciones que hay que considerar
agregar experimentalmente en el modelo. Si se tiene una aproximación se todos estos factores, o
bien, se conocen en su totalidad, resultará en la obtención de un modelo de proteína muy cercano a
la proteína nativa.
7. En el archivo [Link] se pueden visualizar desde distintos ángulos la estructura de la
región carboxilo terminal de la proteína templado (en rojo) y de los modelos generados. Para
obtener esta figura, el templado y los modelos fueron estructuralmente alineados utilizando el
comando align en PyMol. Compare y comente por qué se obtiene este resultado.
R: Se puede apreciar a simple vista que los modelos varían en conformación, orientación y
disposición hacia el C-terminal, mas e unas regiones que en otras, con respecto al molde. 3 de estos
modelos presentan mas similitud entre ellos y un 4to que se escapa y adquiere otra disposición en el
espacio. Entre las posibilidades mas razonables sería la diferencia de residuos entre los modelos y la
secuencia molde. Sea la posición determinada en aquel punto en C-terminal, un residuo distinto, ya
sea con respeto a polaridad, carga, tamaño, etc otorgaría una orientación distinta a los modelos.
Ahora bien, los modelos se construyeron con respecto a perfiles estadísticos y energéticos, lo que se
reflejaría en que el programa navegaría por cada una de las disposiciones mas probables y con
perfiles energéticos mas favorables.
8. En el archivo [Link] encontrará la disposición espacial de los equivalentes al triptófano en
posición 65 (Trp 65) de la proteína templado. Notar que la disposición de la cadena lateral varía
en los modelos generados. A partir de esta observación, explicar el concepto de rotámeros en
el contexto de la construcción de modelos con MODELLER.
R: Otro de los factores a considerar en la construcción o reconstrucción de un modelo es el
empaquetamiento de las cadenas laterales. Una forma de determinar las conformaciones con baja
energía de las cadenas laterales es usando un conjunto de conformaciones discretas de cadenas
laterales llamadas rotameros. Así, los distintos métodos intentan identificar el conjunto de rotámeros
que minimiza la energía global del modelo. Para esto se usan bibliotecas de rotámeros, que son
colecciones de conformaciones favorables multiángulo para cada residuo en la proteína, en este caso
para un residuo de triptofano en la posición 65. Las bibliotecas pueden contener información acerca
de la conformación, frecuencia, etc. Estas derivan de bioinformática estructural o, entre otros análisis
estadísticos de conformaciones de cadenas laterales en estructuras de proteínas conocidas [9]. La
diferente disposición u orientación que adquiere el residuo triptofano en la posición, otorgaría a la
estructura que esta conformando, que en este caso es en una hélice [10], una orientación que varía
con respecto a los otros modelos.
Referencias
[1] [Link]
[2] [Link]
[3] Voet, D., Voet, J.G. (2006). Bioquímica. Ed. Médica Panamericana (Ed), Predicción de la estructura terciaria
(3ra de., p. 313)
[4] [Link]
[5] Rivas, D. (2015). Modelación molecular y estudio de la isoforma 1A/IRE(+) de la proteína DMT1 Humana
(Tesis de pregrado). Universidad de Chile, Santigo de Chile
[6] Widerstein, M., Sippl, M. J. (2007) ProSA-web: interactive web service for the recognition of errors in the
three-dimensional structure of proteins. Nuclei Acids Res., 2007, 35, Web Server issue, W407-W410.
[7] [Link]
[8] [Link]
[9] Dunbrack, R. L., (2002) Current Opinion in Structural Biology Vol 12, Issue 4. Rotamer Libraries in the 21st
Century. Pg. 431-440
[10] [Link]