2017
INTRODUCCIÓN
El aumento de la densidad poblacional y el crecimiento industrial hace necesario e
indispensable tratar las aguas residuales para que, de esta manera puedan tener varios
usos, considerando que es un recurso indispensable. Así mismo, las aguas residuales,
especialmente las de origen doméstico, albergan bacterias, virus y otros organismos
microscópicos, convirtiéndose en un vehículo de transmisión de enfermedades.
El aislamiento de patógenos de muestra de aguas residuales, no es accesible a todos los
laboratorios por su alto costo y requerimiento de personal especializado. Pero es necesario
el examen rutinario de estas aguas y determinar su grado de seguridad desde el punto de
vista microbiológico.
Para evaluar las condiciones sanitarias del agua se utilizan bacterias del grupo Coliformes
y E. coli, que actúan como indicadores de contaminación fecal, y se encuentran en gran
número en la flora intestinal del hombre y de animales de sangre caliente.
La Escherichia coli forma la mayor parte de la flora comensal aerobia y anaerobia
facultativa del tubo digestivo y se elimina por las heces al exterior, por lo tanto no es
infrecuente que se encuentre en el medio ambiente, donde son capaces de sobrevivir
durante cierto tiempo en el agua y los alimentos. Puede intervenir en procesos patológicos
como la producción de cuadros intestinales, diarreas e infecciones extra intestinales
diversas.
PRACTICA N° 06: ENUMERACIÓN DE COLIFORMES POR EL MÉTODO
CONVENCIONAL DEL NMP (Número Más Probable)
I. OBJETIVOS:
- Brindar al estudiante la técnica del cómputo bacteriano a través del método del
Número Más Probable (NMP).
- Distinguir paso a paso la identificación de Coliformes totales y Coliformes
fecales E. coli.
II. FUNDAMENTO TEÓRICO:
2.1. Método del Número Más Probable
En 1904, Eijkman propuso que la producción de gas a partir de glucosa a 46º
C podría ser un buen método para la determinación de coliformes de origen
fecal en un cuerpo de agua, una modificación de este método sirve para definir
las bacterias coliformes fecales termo tolerantes, que son las que poseen las
propiedades antes citadas a una temperatura de 44º o 45ºC, estas últimas,
cuando fermentan tanto la lactosa como otros sustratos adecuados, como el
manitol, a las mismas temperaturas con producción de ácido y gas y que
también forman indol a partir del triptófano, se consideran como E. coli
presuntivas.
Se puede confirmar que se trata de E. coli mediante la demostración de un
resultado positivo en la prueba del rojo de metilo, al no producir acetil-metil-
carbinol y no utilizar citrato como única fuente de carbono. Estas no son
definiciones taxonómicas sino prácticas de trabajo que se usan en el análisis
del agua y, en ese sentido, están comprendidos miembros de diversos géneros.
Así por ejemplo, algunos organismos que desde el punto de vista taxonómico
se identificarían como coliformes no serán reconocidos como tales cuando se
analizan en el agua, como también algunas cepas de E. coli que no son
termotolerantes. En estos ejemplos se incluyen especies de bacterias
coliformes que son anaerogénicas y algunas que no fermentan la lactosa.
Dentro de los coliformes termotolerantes aparte de la E. coli, se pueden
encontrar, entre otros menos frecuentes, Citrobacter freundii y Klebsiella
pneumoniae. (Goez et al, 1996)
La OMS emitió recomendaciones para la calidad bacteriológica de agua
potable en 1993 (Revision of the WHO 1993). Estas directrices se enmarcan
dentro de nuevos criterios de contaminación, según los cuales los organismos
coliformes se analizan solo como señalizadores de la eficacia del tratamiento
y la integridad del sistema de distribución no como indicadores de la
presencia de patógenos, mientras que los organismos coliformes
termotolerantes, en este caso los E. coli se analizan como indicadores de
contaminación fecal.
Hasta este momento, en casi todos los laboratorios se determinan coliformes
totales y coliformes fecales de acuerdo con la definición siguiente: todo bacilo
Gram negativo, capaz de desarrollarse en presencia de sales biliares u otros
agentes (tensoactivos) que tengan propiedades similares inhibitorias del
crecimiento y que sean capaces de fermentar la lactosa a temperaturas de 35º
ó 37ºC, con producción de ácido, gas y aldehido en un lapso de 24 a 48 horas;
también son oxidasa negativas, no esporágenas (no producen esporas) y
reducen el nitrato a nitrito. Este grupo comprende, según la clasificación de
Clark y Pagel en los géneros Escherichia, Citrobacter, Klebsiella y
Enterobacter pertenecientes a la familia de las enterobacterias (mencionado
Goez et al, 1996). Sin embargo, hay autores que discrepan de esta
clasificación como Lecrerc y Mossel que incluyen Serratia y Buttiauxella.
(Guías para la calidad del agua potable, 1987)
2.1.1. Resumen del método
El método consta de tres etapas: prueba presuntiva, prueba confirmativa
y prueba complementaria (Ver figura 2). La prueba presuntiva consiste
en colocar volúmenes determinados de muestra en una serie de tubos
conteniendo caldo lauril triptosa y son incubados a 35 °C +/- 0.5 °C
durante 24 – 48 horas. En esta prueba presuntiva la actividad metabólica
de las bacterias es estimulada vigorosamente y ocurre una selección
inicial de organismos que fermentan la lactosa con producción de gas.
La formación de gas a 35 °C +/- 0.5 °C dentro de las 24 – 48 horas,
constituye una prueba presuntiva para la presencia de bacterias del
grupo Coliforme. La prueba presuntiva no debe usarse rutinariamente
sin confirmación para análisis de agua y aguas residuales. (Cincinnati,
1978)
De acuerdo al objetivo del estudio, en algunos casos en que exámenes
anteriores indican que los resultados de la prueba presuntiva son
comparables a la prueba confirmativa. (Cepis, 1978)
La prueba confirmativa consiste en transferir todos los tubos positivos
de la prueba presuntiva a tubos conteniendo caldo lactosado verde
brillante bilis 2% y son incubados durante 24 – 48 horas a 35 °C +/- 0.5
°C. Esta prueba reduce la posibilidad de resultados falsos gas –
positivos que pueden ocurrir por la actividad metabólica de los
organismos formadores de esporas o por la producción sinergística de
gas debido a que algunas cepas bacterianas no pueden, individualmente,
producirlo a partir de la fermentación de la lactosa. El caldo lactosado
verde brillante bilis contiene agentes selectivos e inhibidores que
suprimen el desarrollo de todos los organismos no coliformes. La
producción de gas a 35 °C después de las 24 – 48 horas constituye una
prueba confirmativa positiva. (Cincinnati, 1978)
2.1.2. Aplicación:
El procedimiento del NMP para la determinación de Coliformes Totales
puede ser usada para evaluar la potabilidad de aguas tratadas y como
identificador de la calidad bacteriológica de aguas naturales y
contaminadas. (Cepis, 1978)
2.1.3. Ventajas:
La prueba presuntiva y confirmativa consiste en observar la presencia
o ausencia de gas, para lo cual se requiere mínima experiencia.
Muestras de agua con alta turbiedad y gran número de algas no
producen aparentemente efectos nocivos en la reacción de los tubos.
(Cepis, 1978)
2.1.4. Limitaciones:
El tiempo requerido para la prueba puede ser de 96 horas con la prueba
confirmativa. El requerimiento horas – hombre para la preparación del
material de vidrio y medios de cultivo para la prueba es significativo.
(Cepis, 1978)
2.1.5.
2.2. Definición del Grupo Coliforme:
El grupo Coliforme incluye todos los bacilos Garm – negativos aerobios o
anaerobios facultativos no esporulados, que fermenten la alctosa con
producción de gas, dentro de 24 – 48 horas a 35°C. (Madigan y Martinko, 2006)
Si consideramos este grupo en relación con la familia Enterobacteriaceae se
verá que incluye los géneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter y
Klebsiella. La demostración y el recuento de organismos coliformes, puede
realizarse mediante el empleo de medios de cultivos líquidos y sólidos con
características selectivas y diferenciales. (Madigan y Martinko, 2006)
Según Madigan y Martinko, 2006, indican los siguientes tipos de E. coli
existentes según sus investigaciones:
- Escherichia coli es un bacilo corto Gram negativo que se encuentra
clasificado dentro de la familia Enterobacteriaceae (bacterias entéricas),
existe como comensal en el intestino delgado de humanos y animales. Sin
embargo, existen algunas cepas de E. coli patógenas que provocan
enfermedades diarreicas. Estas se clasifican con base en las características
que presentan sus factores de virulencia únicos, cada grupo provoca
enfermedad mediante un mecanismo diferente. Se sabe que sus propiedades
de adherencia a las células epiteliales de los intestinos grueso y delgado son
codificadas por genes situados en plásmidos. De manera similar las toxinas
son mediadas por plásmidos o fagos.
Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: E.
coli enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteropatógena (EPEC), E. coli
enterohemorrágica (EHEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli
enteroagregativa (EAEC) y E. coli enteroadherente difusa (DAEC). Existen
otras cepas que no han sido perfectamente caracterizadas; de las cepas
anteriores, las 4 primeras están implicadas en intoxicaciones causadas por
el consumo de agua y alimentos contaminados.
- Escherichia coli enterotoxigénica ETEC es reconocida como el agente
causal de la diarrea del viajero, la cual se caracteriza por diarreas acuosas
con o sin fiebre. Este tipo de infecciones es muy frecuente en países
subdesarrollados y afecta principalmente a los niños.
Patogénesis: El microorganismo es capaz de producir dos tipos de toxina.
Una toxina termolábil de aproximadamente 89 kDa cuya secuencia,
antigenicidad y función es similar a la toxina del cólera, la otra toxina que
produce es termoestable y es de bajo peso molecular (4 kDa) y es capaz de
resistir temperaturas de ebullición hasta por 30 minutos.
La infección puede ser adquirida por el consumo de alimentos tales como
vegetales frescos (lechuga en ensaladas) y agua. La dosis infectiva para
adultos ha sido calculada en aproximadamente 108 bacterias, por otra parte
en jóvenes y ancianos la dosis infectiva puede ser más baja.
- Escherichia coli enteropatógena ECEP. Es causa importante de diarrea en
los lactantes particularmente en los países en vías de desarrollo. La ECEP
se adhiere a las células de la mucosa del intestino delgado. Sus factores de
virulencia favorecen la adhesión y en ocasiones penetra a las células
mucosas. La infección por ECEP provoca diarrea acuosa generalmente
autolimitada aunque en ocasiones puede ser crónica.
Patogénesis. El microorganismo produce dos proteínas: la intimina que es
codificada por el gen eae y un factor de adherencia que es codificado por un
plásmido, ambas proteínas permiten su unión a los enterocitos y la
destrucción de las microvellosidades intestinales.
Las epidemias causadas por este microorganismo se deben al consumo de
agua contaminada y productos cárnicos. En estudios con voluntarios se
encontró que la dosis infectiva es de 106 microorganismos. La diarrea por
ECEP se ha vinculado con múltiples serotipos específicos de E. coli los
cuales pueden ser identificados mediante la tipificación del antígeno O
(somático) y en ocasiones del antígeno H (flagelar).
- Escherichia coli enteroinvasiva EIEC. Este microorganismo se encuentra
estrechamente relacionado con el género Shigella, produce una enfermedad
similar a la shigelosis. La enfermedad se presenta comúnmente en niños de
países subdesarrollados y en personas que viajan a dichos lugares. La EIEC
provoca la enfermedad (diarrea disentérica invasiva) al invadir las células
epiteliales de la mucosa intestinal.
A pesar de que la dosis infectiva para Shigella es de 10 a 100
microorganismos, en el caso de EIEC la dosis infectiva es de
aproximadamente 106 bacterias. Algunas características importantes de este
microorganismo que permiten diferenciarlo de la cepa típica de E. coli son:
No utiliza la lactosa como fuente de carbono, no descarboxilan la lisina, es
inmóvil y anaerogénicas.
La patogenicidad de este organismo se debe a su capacidad para invadir y
destruir el epitelio del colon debido a que es capaz de evadir la lisis en los
fagolisosomas.
- Escherichia coli enterohemorrágica EHEC produce verotoxina,
denominada así por su efecto citotóxico sobre las células Vero, una línea de
células renales de mono verde africano. Existen al menos dos variantes
antigénicas de la toxina. La ECEH se ha asociado con colitis hemorrágica,
una variedad grave de diarrea; y con el síndrome urémico hemolítico,
enfermedad capaz de producir insuficiencia renal aguda, anemia hemolítica
microangiopática y trombocitopenia. La verotoxina tiene propiedades
similares a la toxina shiga producida por algunas cepas de Shigella
dysenteriae tipo 1; De los serotipos de E. coli que producen la verotoxina el
más común y el único que puede identificarse en muestras clínicas es el
O157:H7. La E. coli O157:H7 no emplea sorbitol y es negativa a la prueba
de MUG.
La causa más común de esta infección es el consumo de carne sin cocinar o
poco cocinada, particularmente carne picada procesada en grandes
cantidades. Los casos de colitis hemorrágica y sus complicaciones asociadas
pueden prevenirse mediante la cocción completa de la carne.
2.3. Reglamento de la Calidad del Agua para Consumo Humano:
Según el Reglamento de Calidad de Agua para Consumo Humano, DS N°
031 – 2010 – SA. Elaborado por la Dirección General de Salud Ambiental.
Ministerio de Salud, Lima – Perú, 2011.
Indica los Límites máximos permisibles de parámetros Microbiológicos y
Parasitológicos.
TABLA N° 01
Fuente: Reglamento de Calidad de Agua para Consumo Humano, DS N° 031
– 2010 – SA
III. MATERIALES Y MÉTODOS:
3.1. Materiales:
- Material de vidrio esterilizado: Fiolas, tubos de ensayo, pipetas graduadas
de 1ml, 5ml y 10ml; Matraces.
- Incubadora.
- Gradilla
- Campanas Durkham
- Baño maría
- Solución reguladora de peptona
- Caldo lactosado o Caldo Lautil trptosa fosfato.
- Caldo Verde Brillante Bilis (Brilla)
- Caldo E coli
- Mechero Bunsen.
- Pipeteador
- Indol
3.2. Metodología:
IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES:
TABLA N° 02: Número Más Probable, Muestra de Agua Potable – Prueba
Presuntiva
MUESTRA: DILUCIÓN
AGUA
𝟏𝟎−𝟏 𝟏𝟎−𝟐 𝟏𝟎−𝟑
POTABLE
a b c a’ b’ c’ A B C
Coliformes
Totales + + + + + + + + +
Coliformes
Totales 3 3 3
En la etapa Presuntiva del Número más probable se verifica que todos los tubos so
positivos por lo que tienen el valor de 3, 3, 3: Por ello al dirigirnos a la tabla de
NMP, se encuentra que hay 2400 Coliformes Totales por mililitro de muestra.
El valor obtenido nos advierte de una presunta presencia de Coliformes en la
muestra de agua Potable analizada, por ello se realiza la siguiente prueba del NMP.
IMÁGENES: Prueba presuntiva de NMP – muestra de agua potable
TABLA N° 03: Número Más Probable, Muestra de Agua Potable – Prueba
Confirmativa
MUESTRA: DILUCIÓN
AGUA
𝟏𝟎−𝟏 𝟏𝟎−𝟐 𝟏𝟎−𝟑
POTABLE
a b c a’ b’ c’ A B C
Coliformes
Totales + + + + + + + + +
Coliformes
Fecales 3 3 3
En esta segunda etapa se confirma la presencia de coliformes fecales, ya que se
obtienen todos los tubos positivos, encontrando así 2400 Coliformes fecales por
mililitro de muestra. Con lo hallado en esta etapa se puede determinar que la
muestra analizada no posee inocuidad para el consumo humano.
IMÁGENES:
TABLA N° 04: Número Más Probable, Muestra de Agua Potable – Prueba
en Caldo E. coli
MUESTRA: DILUCIÓN
AGUA
𝟏𝟎−𝟏 𝟏𝟎−𝟐 𝟏𝟎−𝟑
POTABLE
a b c a’ b’ c’ A B C
Coliformes
Totales + + + + + + + + +
E. coli
3 3 3
Por lo observado en la tabla todos los tubos nos indican la presencia de E. coli, el
cual indica también la presencia de otros microorganismos patógenos. Al usar la
tabla del NMP, indica que hay 2400 Coliformes fecales por mililitro de muestra.
IMÁGENES:
Según el Reglamento de Calidad de Agua para Consumo Humano, DS N° 031 –
2010 – SA. Elaborado por la Dirección General de Salud Ambiental. Ministerio de
Salud, Lima – Perú, 2011. Indica los Límites máximos permisibles de parámetros
Microbiológicos y Parasitológicos. El cual nos indica que el limite permisible de
Coliformes Totales y E coli, es cero; entonces podemos manifestar que la muestra
analizada no es apta para consumo, por el alto contenido de coliformes fecales
presentes por mililitro de muestra.
Se realizó un análisis cualitativo, con el reactivo de Cobax, para identificar como
se manifiestan los E coli; se observó la formación de un anillo grosella. Se
manifiesta debido a que E. coli genera aminoácidos (metionina) el cual reacciona
con el reactivo formando el anillo grosella en el tubo de ensayo.
IMÁGEN:
V. CONCLUSIONES:
- Se obtuvo conocimientos prácticos para el análisis microbiológico, al
determinar coliformes por el método convencional del número más probable.
- Se obtuvo resultados positivos en la determinación de coliformes totales y
coliformes fecales; interpretando así lo hallado, para identificar si la muestra
analizada en el laboratorio es apta para consumo humano o no.
VI. RECOMENDACIONES:
- El manejo adecuado y eficaz de los instrumentos al realizar la práctica influye
en los resultados obtenidos.
- Es importante que los manipuladores en la incubación estén adecuadamente
vestidos ya que el trabajo con Coliformes es riesgoso para quien realiza la
práctica.
- Es importante tener conocimientos teóricos previamente a la práctica para una
comprensión mejor de lo explicado en el laboratorio.
VII. CUESTIONARIO:
1. ¿Por qué los organismos coliformes son considerados como indicadores de
la calidad de los alimentos?
Determinar la presencia o ausencia de bacterias coliformes se ha aplicado
tradicionalmente a las diferentes fases de procesamiento y producción de
alimentos, preferencialmente para la especie humana; se hace también dentro
de los programas de buenas prácticas de producción de alimentos para animales
al igual que para el control sanitario en la cadena de producción de alimentos a
partir de la industria avícola.
La importancia de la determinación de coliformes, es que son indicadores de la
contaminación de agua y alimentos. La mayoría de los coliformes pueden
encontrarse en la flora normal del tracto digestivo del hombre o de los animales, por
lo cual estas bacterias son expulsadas por las heces. Por tal motivo, suele deducirse
que la mayoría de los coliformes que se encuentran en el medio ambiente son
de origen fecal, y que los coliformes es el grupo más ampliamente utilizado en
la microbiología de alimentos como indicador de prácticas higiénicas
inadecuadas.
2. Indique usted qué tipo de coliformes se podría encontrar en carne de pollo
refrigerada y por qué
Se puede encontrar E. coli ya que, La mayoría de los coliformes pueden
encontrarse en la flora normal del tracto digestivo del hombre o de los animales,
por lo cual estas bacterias son expulsadas por las heces. Por tal motivo, suele
deducirse que la mayoría de los coliformes que se encuentran en el medio
ambiente son de orgien fecal, y que los coliformes es el grupo más ampliamente
utilizado en la microbiología de alimentos como indicador de prácticas
higiénicas inadecuadas.
3. ¿Qué otros microorganismos indicadores se conocen en los alimentos?
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
Madigan, M T y Martinko, J M., Brock, Biology of Microorganisms, 11a ed.
2006, pp 935-936
Eijkman, C. (1904). "Die Garunsprobe bei 46º als Hilfsmittel beider
Trinkwassereruntersuchung".Centralbl. Bakteriol. Abt. I. Orig. 37: 742
Goez López, M; Vázquez García, M. J.; Pena Caamaño, P. (1996).
Determinación y Diferenciación de Escherichia coli y Coliformes Totales
usando un mismo sustrato cromogénico. Laboratorio Central. Aquagest Galcia.
Rua Isidro Parga Pondal 7 E-15702 Santiago de Compostela España.
WHO (1993) “Revisión of the WHO Guidelines for Drinking Water Quality”
World Health Organization. Geneva
Guías para la calidad del agua potable (1987). Criterios relativos a la salud y otra
información base. Vol 2. Organización Panamericana de la Salud. Whasington,
DC.
CEPIS. Guía para la evaluación de laboratorio bacteriológicos de análisis de
aguas. Serie de Documentos Técnicos, N° 3. Edición revisada. Lima, Cepis
1978.
Environmental Protection Agency, Cincinnati, Estados Unidos. Microbiolical
methods for monitoring the environment: Water and mastewater. Cincinnati,
EPA, 1978