UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA
LA MOLINA
FACULTAD DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
I. INTRODUCCIÓN
La espectrofotometría es uno de los métodos de análisis más usados, y se basa en la relación
que existe entre la absorción de luz por parte de un compuesto y su concentración. Cuando
se hace incidir luz monocromática (de una sola longitud de onda) sobre un medio
homogéneo, una parte de la luz incidente es absorbida por el medio y otra transmitida,
dependiendo del compuesto y el tipo de absorción a medir, la muestra puede estar en fase
líquida, sólida o gaseosa. En las regiones visibles y ultravioleta del espectro
electromagnético, la muestra es generalmente disuelta para formar una solución, cada
sustancia tiene su propio espectro de absorción, el cual es una curva que muestra la cantidad
de energía radiante absorbida. Este método se rige en base a las leyes de Lambert y Beer las
cuales establecen que la intensidad de un haz de luz monocromática disminuye
exponencialmente al aumentar aritméticamente la concentración de la sustancia absorbente
(Skoog, 1992).
En la industria alimentaria permite determinar la concentración de compuestos, nutrientes,
microorganismos que componen los alimentos, pero como todo método es siempre
importante tener en cuenta que la concentración de la muestra analizada debe estar dentro de
un intervalo pequeño porque de lo contrario se desviaría de las leyes anteriormente
mencionadas (Hart, 1991).
Esta práctica tiene como objetivo conocer algunos métodos de determinación
espectrofotométrica para alimentos líquidos y sólidos, en este caso se tomaron como
muestras glucosa, néctar de durazno, piña verde, piña madura, manzana verde y manzana
roja “chilena”.
II. REVISIÓN DE LITERATURA
ación, un concepto ondulatorio” (Atkins y de Paula, 2008).
Figura 1. La distribución de Planck
Fuente: Atkins y de Paula (2008).
A. Regiones del espectro electromagnético
La zona de luz visible es muy pequeña en comparación con la gran amplitud del espectro,
se trata de una radiación determinada (λ), que es físicamente imposible de aislar. Aunque
se puede obtener un rango de radiaciones pequeño según la exactitud del dispositivo de
selección (difractares de radiación y filtros), pero nunca una sola. De la misma manera
que no se puede obtener o aislar un punto de una recta, sino un trozo pequeño (Arenas y
López, 2004).
Figura 2. Regiones del espectro electromagnético
Fuente: Harris (2007).
2.1. ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN ULTRAVIOLETA - LUZ
VISIBLE
La absorción de absorción en las regiones ultravioleta y visible del espectro
electromagnético es, la más utilizada en la práctica del análisis cuantitativo de las técnicas
espectroscópicos (Hernández y González, 2002).
La región ultravioleta está comprendida entre 195-380 nm, y la región visible en el intervalo
de longitudes entre 390-780 nm, siendo el orden de los colores de mayor a menor longitud,
que lo conforman: violeta, azul, verde, amarillo, naranja y rojo (Silva y García, 2006).
2.1.1. Fundamento
La absorción de este tipo de radiación se produce como consecuencia de la excitación de los
electrones externos de los átomos, además la molécula debe tener grupos cromóforos, que
son grupos funcionales que contienen dobles o triples enlaces, dobles enlaces conjugados,
etc (Silva y García, 2006).
Se basa en la absorción de esta radiación por el analito, como consecuencia de los cual se
origina un estado activado que posteriormente elimina su exceso de energía en forma de
calor (Hernández y González, 2002).
2.1.2. Instrumentación
Según Silva y García (2006):
A. Fuente de radiación: puede ser continua como la lámpara de hidrogeno o deuterio,
arco de xenón y filamento de tungsteno.
B. Selector de longitud de onda: pueden filtros (fotómetro o colorímetro) o
monocromadores (espectrofotómetro).
C. Cubetas: de material transparente a la radiación, en UV suelen ser de cuarzo y en
visible suelen ser de vidrios silicatados.
D. Detectores: tanto la radiación UV como la visible tienen energía para producir el
efecto fotoeléctrico, por lo que se puede usar los detectores de fotones; células
fotovoltaicas, fototubos y tubo fotomultiplicadores
2.1.3. Aplicaciones
A. Análisis cualitativo: no es muy utilizado, sirve para visualizar la existencia o no de
cromóforos en la molécula (Silva y García, 2006).
B. Análisis cuantitativo: usado para análisis de sustancias que absorben por sí mismas,
análisis de sustancias no absorbentes y análisis de mezclas (Silva y García, 2006).
2.2. LEY DE LAMBERT-BEER
Ley fundamental que rige la absorción de todos los tipos de radiación electromagnética,
aplicable a disoluciones y también a gases y sólidos. Se basa en que la absorbancia de
radiación electromagnética producida por una especie absorbente es directamente
proporcional a la trayectoria de la radiación a través de la disolución y a la concentración en
ésta de la sustancia que produce la absorción (Serrano, 2018).
A=a×b×c
Donde,
a: constante de proporcionalidad, absortividad, es una propiedad intensiva de la materia y
por tanto relacionada únicamente con la naturaleza de la misma
b: trayectoria de la radiación a través de la muestra (cm)
c: concentración (g/l), entonces “a” tiene unidades de l·g-1 ·cm
La absortividad pasa a denominarse absortividad molar y se expresa con el símbolo ε, cuando
la concentración está en (moles/litro) y b en (cm), siendo sus unidades l·mol-1 ·cm -1
(Serrano, 2018)
2.3. DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES POR MÉTODO DE
“DNS” (Ácido 3,5-dinitrosalicilico)
Sumner y colaboradores desarrollaron un método utilizando el ácido 3,5 dinitrosalicílico
(DNS) para calcular la concentración de azúcares reductores en distintos materiales. El
procedimiento se basa en una reacción redox que ocurre entre el DNS y los azúcares
reductores presentes en la muestra. Este método ha sufrido varias modificaciones a través de
los años para adecuarse al análisis de diferentes materiales y su principal ventaja radica en
su alta sensibilidad y productividad debido a que es un método espectrofotométrico (Bello
et al., 2006).
2.4. MUESTRAS ANALIZADAS
2.4.1. Néctar de durazno “Pulp”
Por néctar de fruta se entiende el producto sin fermentar, pero fermentable, que se obtiene
añadiendo agua con o sin la adición de azúcares y/o edulcorantes o a una mezcla de éstos.
Podrán añadirse sustancias aromáticas, componentes aromatizantes volátiles, pulpa y
células, todos los cuales deberán proceder del mismo tipo de fruta y obtenerse por
procedimientos físicos (Codex Alimentarius, 2005).
Cuadro 1. Contenido de néctar y azúcar, por flor.
mg de néctar por % de azúcares
Especie mg de azúcares
flor
Durazno 1.19 0.31 26
Fuente: Lesser (2004).
Cuadro 2. Composición media del néctar
Nutriente Contenido en porcentaje (%)
Agua 75 – 80
Azucares reductores 7–8
Sacarosa 7–8
Otros azucares 4–5
Fuente: Lesser (2004).
2.4.2. Manzana chilena y manzana de agua
Los azúcares que nos encontramos en la manzana son fructosa, glucosa, sacarosa y sorbitol.
Entre el 12,6% y 15 % de los componentes de la manzana son hidratos de carbono en forma
de azúcares. Se trata en su mayor parte de fructosa y en menor proporción, de glucosa y
sacarosa (Úbeda, 2012).
Cuadro 3. Azucares simples del zumo de manzana
Nutriente Cantidad (g/100g zumo)
Agua 84
Fructosa 5.74
Glucosa 2.03
Sacarosa 2.55
Lípidos 0.4
Fuente: Úbeda (2012).
El contenido en azúcares reductores es 7,38 g glucosa/100 mL de extracto en las manzanas
de producción ecológica y en las frutas procedentes del cultivo convencional es 3,48 g/100
mL. El estado de madurez en los frutos es similar, la mayor concentración en azúcares
reductores de los frutos ecológicos evidencia una síntesis más adecuada para estos frutos
(Raigón et al., 2006).
Figura 3. Contenido en azúcares reductores (g glucosa / 100 mL) de las manzanas según el
tipo de cultivo.
Fuente: Raigón et al (2006).
2.4.3. Piña
La piña tiene una mayor cantidad de sacarosa, respecto a los azúcares simples. Los azúcares
simples (glucosa y fructosa) se presentan más o menos en la misma cantidad (Úbeda, 2012).
Cuadro 4. Azucares simples del zumo de piña
Nutriente Cantidad (g/100g zumo)
Agua 86.5
Azúcar 9.71
Fructosa 2.59
Glucosa 2.60
Sacarosa 4.51
Lípidos 0.10
Fuente: Úbeda (2012).
Cuadro 5. Porcentaje promedio de azucares reductores y no reductores.
Fuente: Ávila et al. (2012).
III. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. MATERIALES Y EQUIPOS
Muestra (Manzana verde de agua y roja chilena, piña, néctar “Pulp”)
Beaker
Balanza analítica
Cuchillo
Tabla de picar
Fiolas de 25 mL, 100 mL y 50 mL
Tubos de Prueba
Espectrofotómetro (lectura a 550 nm)
Licuadora
Papel filtro
Pipetas de 5 mL y 10 mL
Cubetas
Papel Tissue
Gradilla
Vortex
3.2. REACTIVOS
Agua destilada
Solución DNS (ácido 3,5 dinitrosalicílico)
Solución estándar de glucosa
Sal de Rochelle
3.3. PROCEDIMIENTO
3.3.1. Preparación de la curva estándar
3.3.2. Análisis de la muestra
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1. Curva patrón Glucosa
Mediante la correlación para las curvas patrón de Glucosa utilizando el método del DNS. Se
detectan los cambios en la concentración de azúcares reductores con cambios proporcionales
en las lecturas de densidad de óptica a 550 nm.
Cuadro 6. Valor de la absorbancia promedio y la concentración (mg/ml) de la glucosa.
Promedio Concentración
Dilución Repetición Absorbancia
absorbancia (mg/ml)
R1 0.178
7mL R2 0.196 0.20 0.02
R3 0.232
R1 0.292
9mL R2 0.260 0.27 0.03
R3 0.250
Glucosa
R1 0.397
11mL R2 0.396 0.38 0.03
R3 0.358
R1 0.573
14.5mL R2 0.672 0.56 0.04
R3 0.444
R1 0.890
22mL 0.93 0.06
R2 0.920
1.000
y = 17.595x - 0.1602
0.800 R² = 0.9982
Absorbancia
0.600
0.400
0.200
0.000
0.000 0.010 0.020 0.030 0.040 0.050 0.060 0.070
Concentración
Figura 4. Curva patrón obtenida de glucosa.
Ecuación de relación: Y = 17.974X-0.1602
R2 = 0.9982
Para verificar el cumplimiento de la Ley de Beer, se debe realizar la curva de calibración;
absorbancia (A) en función de concentración (C), para lo cual se preparan soluciones de la
sustancia de concentraciones conocidas y se mide la absorbancia a la longitud de onda elegida
(Dial y Barcenas, 2010).
Por tal motivo en la práctica para la obtención de una curva de calibración (o patrón) se analizó
muestras de glucosa a diferentes concentraciones, para ello se hicieron diferentes diluciones,
luego se le agrego la solución de DNS, con esto se pudo realizar una lectura de absorbancias
para cada concentración de glucosa.
El DNS reacciona únicamente con los azúcares reductores. La sacarosa es un disacárido no
reductor, pero tras su hidrólisis en medio ácido se liberan glucosa y fructosa que sí son
reductores y reaccionan con el DNS generando un producto coloreado. La intensidad del color,
que se puede medir por métodos espectrofotométricos es proporcional a la concentración
(Muñoz y Vega, 2014).
De igual forma Miller (1959), señala que el método DNS, se basa principalmente en la
reducción del DNS (de color amarillo) por la glucosa u otro azúcar reductor al ácido 3-amino-
5- nitrosalicílico (de color rojo ladrillo), cuya presencia puede detectarse por lectura de la
Absorbancia en la zona de 540-
IV. CONCLUSIONES
La concentración de azucares reductores es directamente proporcional a la absorbancia.
La curva de calibración de glucosa es utilizada para comprobar la Ley de Lambert-Beer.
La manzana roja chilena trabajada en laboratorio pudo haber estado refrigerada, su valor
promedio de azucares reductores de 11.31%, por el método DNS.
La manzana verde posee un valor menor de azucares reductores es mucho menor al de la
manzana roja, siendo reflejado por un valor de 6.51%.
El néctar de durazno (Pulp) registro un valor porcentual de 2.57% de azucares reductores
determinado por el método DNS. Lo cual se encuentra dentro del rango permitido de
azucares reductores en néctares y zumos.
La determinación de azúcares reductores en la piña verde y la piña madura resultó 4.47 y
3.77% aplicando el método de DNS.
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VI. ANEXOS
Anexo 1:
PROCEDIMIENTO PARA DETERMINACION DE SODIO, POTASIO Y CALCIO
EN ALIMENTOS
Método Espectrofotométrico de Absorción Atómica de llamas. Método AOAC 985.35
1. OBJETIVO: Determinar la concentración de sodio, potasio y calcio en muestras de
alimentos con bajo contenido de grasa.
2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE: El método es aplicable a alimentos con bajo
contenido en grasa: cereales, formulas infantiles, alimentos para animales. Puede ser aplicado
a otras matrices similares si se demuestra la aplicabilidad para la matriz de interés, a los niveles
de concentración de interés.
3. FUNDAMENTO: Se basa en la destrucción de la materia orgánica por vía seca hasta lograr
la digestión del alimento para posteriormente solvatar los residuos con ácido nítrico diluido
para la posterior determinación del o los analitos por Espectrofotometría de Absorción Atómica
con llama.
4. DESARROLLO:
4.1 Preparación del material de laboratorio:
Después de realizar el lavado con agua destilada, sumergir los crisoles y sus respectivas tapas
entre 8-12 hrs. en solución de HNO3 20% v/v, luego, enjuagar 3 veces con agua desionizada.
Dejar enfriar y llevar a desecador por 2 hrs. Material de vidrio: Después de realizar el lavado
con agua destilada, sumergir el material entre 8-12 hrs. en solución de HNO3 20% v/v, luego,
enjuagar 3 veces con agua grado desionizada. Posteriormente secar a < 70ºC. Luego preparar a
lo menos 3 soluciones de trabajo entre el rango de 0,2 a 2,00 mg/l del analito a determinar.
Tomar los volúmenes de las soluciones detalladas en la tabla correspondiente según analito a
cuantificar, agitar y llevar a matraces de 100 ml aforar con HNO 3 1M. Agitar para
homogeneizar bien. Las soluciones están listas para leer, el resto de la solución se puede llevar
a un envase plástico, cerrar, etiquetar y almacenar. Estas soluciones son estables en
refrigeración aproximadamente 6 meses.
4.2 Digestión de la muestra:
Moler y homogeneizar, pesar en un crisol entre 1 a 3 g de muestra dependiendo de la
concentración esperada del o los analitos. Registrar el peso colocar el crisol con la muestra sin
tapar en placa calefactora, estufa o mufla a 100ºC por 30 minutos, colocar el crisol con la
muestra tapado en mufla a 525 ºC por un periodo de 3 a 5 hrs hasta obtener cenizas blancas y
proceder de acuerdo al punto De obtenerse cenizas grises dejar enfriar y agregar al crisol de 0,5
a 3 ml aproximadamente de HNO 3 65%, colocar el crisol destapado en placa calefactora a unos
100ºC, hasta evaporar. Luego llevar nuevamente mufla a 525ºC por 1 a 2 hrs. hasta cenizas
blancas Digerir las cenizas blancas contenidas en el crisol con 5 ml de HNO 3 1 M en placa
calefactor calentando de 3 a 5 minutos, cuantitativamente llevar el licor de cenizas a un matraz
aforado de 25 ml, a través de lavados sucesivos con porciones de alrededor de 3 ml de HNO 3
1 M. Agregar al matraz: a) para determinación de Calcio 2,5 ml de NaCl 3, 1% b) para
determinación de Sodio y Potasio 1,25 ml de cloruro de Cesio al 10% y luego aforar con HNO
3 1M. La solución está lista para ser cuantificada. De ser necesario, diluir con HNO 3 1M para
ajustar en el rango lineal.
4.3 Medición por Espectrofotómetro de Absorción Atómica:
Ajustar el equipo con el control del blanco aspirando por el capilar del quemador y hacer
autocero. Ajustar la sensibilidad con concentración de estándar referencial indicado en el
manual del equipo para lograr la máxima sensibilidad, aspirar las soluciones estándares de la
curva de calibración en orden creciente por el capilar del quemador y leer en E.A.A. Las lecturas
son obtenidas por interpolación desde la curva de calibración y están expresados en mg/l del
analito.
Anexo 2: Cálculos respectivos para hallar la concentración y % de azúcar reductor en las
muestras de alimentos.
Concentración de glucosa
Dilución 7mL
204.3 mg ------------ 100mL
X7 mg ------------ 7 mL
X7 = 14.301 mg
14.301 mg ------------ 25 mL
Y7 mg ------------ 0.5 mL
Y 7= 0.28602 mg
0.28602 mg
[Glucosa7] = = 0.020
14.5 𝑚𝐿
Dilución 9mL
204.3 mg ------------ 100mL
X9 mg ------------ 9 mL
X9 = 18.387 mg
18.387 mg ------------ 25 mL
Y9 mg ------------ 0.5 mL
Y 9= 0.36774 mg
0.36774 mg
[Glucosa9] = = 0.025
14.5 𝑚𝐿
Dilución 11mL
204.3 mg ------------ 100mL
X11mg ------------ 11 mL
X11 = 22.473 mg
22.473 mg ------------ 25 mL
Y11 mg ------------ 0.5 mL
Y11 = 0.44946mg
0.44946 mg
[Glucosa11] = = 0.031
14.5 𝑚𝐿
Dilución 14.5mL
204.3 mg ------------ 100mL
X14.5mg ------------ 14.5 mL
X14.5 = 29.6235mg
29.6235 mg ------------ 25 mL
Y14.5 mg ------------ 0.5 mL
Y14.5 = 0.59247mg
0.59247 mg
[Glucosa14.5] = = 0.041
14.5 𝑚𝐿
Dilución 22mL
204.3 mg ------------ 100mL
X22 mg ------------ 22 mL
X22 = 44.946 mg
44.946 mg ------------ 25 mL
Y22 mg ------------ 0.5 mL
Y 22= 0.89892 mg
0.89892 mg
[Glucosa22] = = 0.062
14.5 𝑚𝐿
Concentración de las muestras
Piña verde
5016 mg ------------ 100mL
XPV mg ------------ 10 mL
XPV = 501.6 mg
501.6 mg ----------- 50 mL
YPV mg ------------ 0.5 mL
YPV = 5.016 mg
5.016 mg
[Néctar] =
14.5 𝑚𝐿
[Piña verde] = 0.3459 mg/Ml
Piña madura
5016 mg ------------ 100mL
XPM mg ------------ 10 mL
XPM = 501.6 mg
501.6 mg ----------- 50 mL
YPM mg ------------ 0.5 mL
YPM = 5.016 mg
5.016 mg
[Piña madura] =
14.5 𝑚𝐿
[Piña madura] = 0.3459 mg/Ml
Manzana verde
5036.4 mg ------------ 100mL
XMV mg ------------ 10 mL
XMV = 503.64 mg
503.64 mg ----------- 50 mL
YMV mg ------------ 0.5 mL
YMV = 5.0364 mg
5.0364 mg
[Manzana verde] =
14.5 𝑚𝐿
[Manzana verde] = 0.3473 mg/mL
Manzana roja
5010.0 mg ------------ 100mL
XMR mg ------------ 10 mL
XMR = 501.0 mg
501.0 mg ----------- 50 mL
YMR mg ------------ 0.5 mL
YMR = 5.010 mg
5.010 mg
[Manzana roja] =
14.5 𝑚𝐿
[Manzana roja] = 0.3455 mg/mL
Néctar de durazno
5093.7 mg ------------ 100mL
XN mg ------------ 10 mL
XN = 509.37 mg
509.37 mg ------------ 50 mL
YN mg ------------ 0.5 mL
YN = 5.0937 mg
5.0937 mg
[Néctar] =
14.5 𝑚𝐿
[Néctar] = 0.351 mg/Ml
%Azúcar reductor
Piña verde
0.015 𝑋 100%
%AR =
0.3513
%AR = 4.469%
Piña madura
0.013 𝑋 100%
%AR =
0.3471
%AR = 3.765%
Manzana verde
0.023 𝑋 100%
%AR =
0.3473
%AR = 6.512%
Manzana roja
0.039 𝑋 100%
%AR =
0.3455
%AR = 11.307%
Néctar de durazno
0.009 𝑋 100%
%AR =
0.3513
%AR = 2.569%