UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA

FACULTAD DE INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE CIENCIAS TECNOLOGiA E

INGENIERÍA DE ALIMENTOS

TINGO MARIA

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y CUANTIFICACIÓN DE

QUERCETINA EN DOS ESPECIES DE FRIJOL: FRIJOL PALO (Cajanus
caján L.) V FRIJOL CHAUCHA (Phaseolus vulgarls L)

Tesis
Para optar el titulo de:

INGENIERO
. EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

QUINTANILLA ALCA, JOSEFA ROSARIO

PROMOCIÓN 2007 • 11
Tingo Maria- Perú
2011
Ji
-
BIBLIOTECA CENTRAL -UNAS

Q04
Q7
Quintanilla Alea, Josefa Rosario

Evaluación de la Actividad Antioxidante y Cuantificación de Quercetina en Dos

Especies de Frijol: Frijol Palo (Cajanus caján L.) y Frijol Chaucha (Phaseolus vulgaris L.)

62 h.; 16 cuadros; 18 fgrs.; 61 ref.; 30 cm.

Tesis ( Ing. Industrias Alimentarias ) Universidad Nacional Agraria de la Selva,
Tingo María (Perú). Facultad de Ingeniería en Industrias Alimentarias.

l. CAJANUS CAJÁN L. 2. PHASEOLUS VULGARIS L. 3. CUANTIFICACIÓN

4. POLIFENOLES 5. QUERCETINA 6. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE 7. PERÚ.

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. ~~\lstR'AS:<l UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA
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. . .. ~· FACULTAD DE INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
.... ·..· ··. . Av. Universitaria s/n. Teléfono (062) 561385- Fax (062) 561156
· . •· Apart. Postal156 Tingo María [Link]; fia@[Link] .

ACTA DE SUSTENTACIÓN DE TESIS

Los Miembros del Jurado que suscriben, reunidos en acto público el 09 de

Noviembre de 2011, a horas 05:00 p.m. en la Sala de Grados de la Universidad
Nacional Agraria de la Selva, ubicada en la ciudad de Tingo María, provincia de
Leoncio Prado, departamento de Huánuco, para calificar la tesis presentado por la
Bach. QUINTANILLA ALCA, Josefa Rosario, titulada:

"EVALUACION DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y

CUANTIFICACION DE QUERCETINA EN DOS ESPECIES DE
FRIJOL DE LA ZONA: FRIJOL DE PALO (Cajanus caján L.) Y
FRIJOL CHAUCHA (Phaseolus vu/garis L.)

Después de haber escuchado la sustentación, las respuestas a las preguntas

formuladas, lo declaran APROBADO con el calificativo de BUENO en
consecuencia la Bachiller, queda apta para recibir el título de Ingeniero en
Industrias Alimentarias del Consejo Universitario, de conformidad con el Art. 22°
de la Ley Universitaria 23733; los artículos 51° y 52° del Estatuto de la
Universidad Nacional Agraria de la Selva.

Tingo María, 1O de Noviembre de 2011

~e;...
~a·~~ ~t~~mbro
ln9."L·.·

.................. ~~ ........
Dra. Elizabeth·O~d~AJ Gómez
Asesora
 DEDICATORIA

A Dios, por darme la vida, guiar

mis pasos, brindarme salud y fuerza.

A mi esposo, Miguel Herazo Q.

con inmenso amor y profunda

gratitud por su paciencia,

sacrificio, confianza y apoyo.

A mis hijos, Sebastián y Andrea, por

los momentos sacrificados, los amo

infinitamente.

A mi padre, Andrés Quintanilla

por inculcarme valores e

incentivarme a ser profesional y a

la memoria de mi Madre Julia

Alea.

A mis hermanos, Marco, Miriam,

Ornar y Orlando por el apoyo y cariño.

 AGRADECIMIENTOS

• A la Universidad Nacional Agraria de la Selva, mi alma mater por

acogerme en sus aulas y permitir realizarme como profesional.

• Al Ph.D. Manuel Sandoval Chacón. por guiarme en el desarrollo del

presente trabajo de investigación, por su gran gentileza de impartir sus

conocimientos constantemente y sobre todo por la confianza que

depositó en mí.

• A la Doctora Elizabeth Ordóñez G. y al Ingeniero Jhony Vargas S. por su

valiosa colaboración en el asesoramiento que hizo posible la

culminación del presente trabajo.

• A los docentes de la Facultad de Ingeniería en Industrias Alimentarias,

por todos los conocimientos que me brindaron y quienes contribuyeron

en mi formación profesional.

• A mi querido suegro J. Francisco Herazo D. por su gran esfuerzo en

hacer que mis dificultades no obstaculicen mis metas y a mi suegra

quien en vida me brindó cariño y sus sabios consejos.

• A todas aquellas personas que de una u otra manera colaboraron en la

culminación del presente trabajo de investigación.

 ÍNDICE

Página

l. INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 1

11. REVISIÓN DE LITERATURA .......................................................................... 3

2.1. Generalidades del frijol ............................................................................... 3

2.1.1. Aspectos generales .......................................................................... 3

2.1.2. Aspectos botánicos .......................................................................... 4

2.1.3. Frijol de palo (Cajanus caján L.) ...................................................... 6

2.1.4. Frijol chaucha (Phaseolus vu/garis L.) ............................................. 7

2.2. Las leguminosas en la nutrición humana .................................................... 8

2.2.1. Composición nutritiva ....................................................................... 8

2.2.2. Factores antinutricionales .............................................................. 1O

2.3. Generalidades de los polifenoles .............................................................. 11

2.3.1. Características de los flavonoides ................................................. 12

2.3.2. Quercetina ..................................................................................... 13

2.3.3. Propiedades físicas y químicas de la quercetina ........................... 14

2.4. Aspectos generales de la actividad antioxidante y radical libre ................ 15

2.4.1. Antioxidantes ................................................................................. 15

2.4.2. Radicales libres .............................................................................. 16

2.4.3. Química del radicallibre ................................................................. 17

2.4.4. Especies reactivas del oxígeno (ERO) ........................................... 18

2.4.5. Radicales sintéticos ....................................................................... 19

111. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................ 21

3. 1. Lugar de ejecución ................................................................................... 21

3.2. Materia prima ............................................................................................ 21

3.3. Materiales y equipos de laboratorio .......................................................... 21

3.3.1. Materiales de Laboratorio .............................................................. 21

3.3.2. Equipos de laboratorio ................................................................... 22

3.3.3. Reactivos y soluciones ................................................................... 22

3.4. Métodos de análisis .................................................................................. 23

3.4.1. Cuantificación de polifenoles totales .............................................. 23

3.4.2. Cuantificación de quercetina .......................................................... 23

3.4.3. Radical DPPH (2,2-diphenyl-picrilhydrayl) ..................................... 23

3.4.4. Radical peroxilo (ABTS) ................................................................. 24

3.5. Metodología experimental ........................................................................ 24

3.5.1. Preparación de las muestras ......................................................... 24

3.5.2. Preparación de los extractos .......................................................... 25

3.5.3. Cuantificación de polifenoles totales de dos especies de frijol. ...... 26

3.5.4. Cuantificación de quercetina en dos especies de frijol.. ................. 28

3.5.5. Evaluación de la capacidad antioxidante en dos especies de

frijoles ............................................................................................. 31

IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................... 35

4. 1. Cuantificación de polifenoles totales en la cáscara y cotiledón de dos

especies de frijoles ................................................................................... 35

4.2. Cuantificación de quercetina en dos especies de frijol ............................. 38

4.2.1. Determinación de la curva estándar .............................................. 38

 4.2.2. Cuantificación de quercetina ......................................................... .40

4.3. Evaluación de la capacidad antioxidante en dos especies de frijol ......... .43

4.3.1. Coeficiente de inhibición del radical DPPH ................................... .43

4.3.2. Coeficiente de inhibición del radical peroxilo ................................ .45

V. CONCLUSIONES ......................................................................................... 49

VI. RECOMENDACIONES ................................................................................ 50

VIl. ABSTRACT ................................................................................................ 51

VIII. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA ............................................................... 53

IX. ANEXOS ...................................................................................................... 62

X. GLOSARIO ................................................................................................... 67
 ÍNDICE DE CUADROS

Cuadro Página

1. Composición química del frijol. ..................................................................... 9

2. Preparación de la curva estándar de polifenoles totales ............................ 27

3. Preparación de concentraciones para la cuantificación de polifenoles

totales ......................................................................................................... 28

4. Preparación de la curva estándar de quercetina ........................................ 30

5. Contenido de polifenoles totales en la cáscara y cotiledón de dos

especies de frijol. ................................. :...................................................... 36

6. Concentraciones de quercetina para la curva estándar. ............................. 39

7. Contenido de quercetina en dos especies de frijol. .................................... 41

8. Comparación del coeficiente de Inhibición ICso (DPPH) en dos

especies de frijol. ........................................................................................ 44

9. Resultados del coeficiente de Inhibición IC5o (radical peroxilo) en dos

especies de frijol. ........................................................................................ 46

1O. Resultados de la curva estándar de polifenoles totales .............................. 63

11. Análisis de variancia del contenido de polifenoles totales en cáscara y

cotiledón de dos especies de frijol. ............................................................. 64

12. Análisis de variancia para el contenido de quercetina ................................ 64

13. Preparación de soluciones intermedias para evaluar la capacidad

antioxidante de los extractos de frijol por radical DPPH ............................. 65

14. Análisis de varianza del extracto etanólico de las especies de frijol y

partes del grano frente al radical DPPH ..................................................... 65

15. Preparación de soluciones intermedias para evaluar la capacidad

antioxidante de los extractos de frijol por el radical peroxilo ....................... 66

16. Análisis de varianza del extracto etanólico de las especies de frijol y

partes del grano frente al radical peroxilo ................................................... 66

 ÍNDICE DE FIGURAS

Figura Página

1. Planta común del género Phaseolus vulgaris L. ............................................. 3

2. Estructura anatómica del frijol. ....................................................................... .4

3. Vainas y granos de frijol de palo Cajanus cajan L. ......................................... 6

4. Vainas y granos de frijol chaucha Phaseolus vulgaris L. ................................ 8

5. Estructura básica de los flavonoides ............................................................. 13

6. Estructura molecular de la quercetina ........................................................... 15

7. Reacción del radical DPPH con un antioxidante ........................................... 19

8. Flujograma de operaciones para la obtención de muestras .......................... 25

9. Secuencia de operaciones en la preparación de extracto etanólico ............. 26

1O. Flujograma de preparación de muestra para la cuantificación de

quercetina ................................................................................................. 29

11. Secuencia para la cuantificación de quercetina .......................................... 31

12. Diseño experimental para cuantificación de polifenoles totales y

coeficiente de Inhibición IC 50 del radical DPPH y peroxilo ........................ 34

13. Comparación del contenido de polifenoles totales entre los

tratamientos .............................................................................................. 36

14. Curva estándar de quercetina ..................................................................... 39

15. Comparación del contenido de quercetina entre los tratamientos .............. 41

16. Comparación entre la eficiencia de los tratamientos frente al radical

DPPH ........................................................................................................ 44

17. Comparación del coeficiente de inhibición IC 50 del radical peroxilo ........... .46

18. Curva estándar para la cuantificación de polifenoles totales ...................... 63

 RESUMEN

Los frijoles son fuentes de fibra y proteínas, sin embargo su

potencial nutracéutica llama mucho la atención en la prevención de

enfermedades crónicas y degenerativas debido a que son valorados como

fuentes de metabolitos secundarios, el efecto protector de los frijoles están

asociados al contenido de compuestos tal como fitoalexinas entre ellos la

quercetina el cual según estudios muestra propiedades antimutagénicos y

previene la formación de radicales libres que eventualmente deterioran las

moléculas biológicas. La zona de selva alta de la región Amazónica de Perú

especialmente Tingo María tiene áreas extensas con tierras poco utilizadas

donde los frijoles nativos crecen para buenos propósitos, sin embargo, su valor

biológico no fue muy investigado. El objetivo de este estudio fue cuantificar el

contenido de polifenoles y quercetina y evaluar la actividad antioxidante en dos

especies nativas Cajanus caján L. (frijol palo) y Phaseolus vulgaris L. (chaucha)

que forman parte de la dieta alimenticia de los lugareños. La investigación se

realizó en el Centro de Investigación de Productos Naturales de la Amazonía

(CIPNA) y los laboratorios de Biotecnología de la Universidad Nacional Agraria

de la Selva (UNAS), ubicada en el distrito de Rupa-Rupa, provincia de Leoncio

Prado, región Huánuco de Perú. La cuantificación de polifenoles fue realizado

por el método de Folin-Ciocalteau, el contenido de quercetina se determinó por

el método descrito por TOKUSOGLU et al., 2003, la actividad antioxidante fue

establecido por inhibición de DPPH descrito por BRAND-WILLIAMS et al., 1995

y los radicales peroxilo por el método ABTS. Los análisis fueron realizados
usando un espectrofotómetro Genesys 6 UV. El análisis estadístico fue

realizado usando el diseño completo al azar (DCA) y el post análisis fue

realizado si p<0,05 usando prueba Tuckey (lnStat Graphic). Los resultados del

contenido de polifenoles (GAE mg/1 OOg) fueron: cáscara de chaucha

2747,8±52,84, cáscara de frijol palo 54,725±0, 18, el cotiledón de chaucha

24, 176±0,74, cotiledón de frijol palo 38,492±0,50. La concentración de

quercetina (mg/mL) fue: cáscara de frijol chaucha 159,67±9,0, cáscara de frijol

palo 4,291±0,34, el cotiledón de frijol chaucha 2,711±0,21 y el cotiledón de frijol

palo 2,087±0, 15. El ICso (mg/mL) para inhibición de DPPH fue: cáscara de frijol

chaucha 0,032, cáscara de frijol palo 6,28±0, 1, cotiledón de frijol chaucha

20,64±0, 14 y cotiledón de frijol palo 21,63±0,26 respectivamente. El IC50

(mg/mL) para inhibición de peroxilo fue: cáscara de frijol chaucha 0,0078,

cáscara de frijol palo 0,891 ±0, 1, el cotiledón de frijol chaucha 1,890±0,02 y

cotiledón de frijol palo 1,642±0,02 respectivamente.

PALABRAS CLAVES: Cajanus caján L., Phaseolus vu/garis L., cuantificación,

polifenoles, quercetina, actividad antioxidante, Perú.

 1. INTRODUCCIÓN

Las leguminosas de mayor consumo a nivel mundial son los frijoles

comunes, como el Phaseo/us vutgaris L. existiendo muchas otras especies con

cualidades características para su consumo, por ejemplo en la zona tropical es

muy apreciado el Cajanus caján L. por su valor nutricional, disponibilidad y por

su relativo bajo costo, la Amazonia peruana es un provisor de recursos

naturales de mucha importancia por su gran biodiversidad. Los frijoles son

reconocidos como fuente de proteínas, carbohidratos y minerales, además de

compuestos polifenólicos que tienen un efecto protector contra enfermedades

crónicas y degenerativas como el cáncer, arterosclerosis, diabetes, entre otros

y aportan nutrientes básicos para el correcto funcionamiento del organismo

vivo.

Recientemente se ha incrementado el interés en el estudio de los

compuestos fitoquímicos de las semillas y cáscara de las diversas plantas

comestibles tales como el frijol, debido según (BOATENG, 2007) a la

importancia de la actividad biológica de compuestos polifenólicos que son

benéficos para la salud tal como catequinas, antocianinas, y quercetina, la

proteína y ácido fítico tienen también efectos antimutagénico

anticarcinogénicos y antioxidante (son capaces de neutralizar a los radicales

libres que producen daños a las membranas). La quercetina es un metabolito

secundario, que corresponde al grupo de compuestos químicos denominados

 2

flavonoides, clasificado en la subclase: flavonol, que junto a la vitamina C tiene

efectos sinérgicos para cumplir con sus funciones antioxidativas, también la

quercetina protege de la oxidación a la vitamina E y disminuye la peroxidación

de lípidos en la membrana. En base a este marco se planteó los siguientes

objetivos:

• Cuantificar el contenido de polifenoles y quercetina, en dos especies de

frijol: palo (Cajanus caján L.) y frijol chaucha (Phaseolus vulgaris L.) y en

dos partes del grano: cáscara y cotiledón.

• Evaluar la actividad antioxidante frente al radical DPPH y radical peroxilo en

las dos especies de frijol y dos partes del grano cáscara y cotiledón.
 11. REVISIÓN DE LITERATURA

2.1. Generalidades del frijol

2.1.1. Aspectos generales

El frijol es de origen americano, en la época precolombina se

cultivaba en sus muchas formas, desde lo que hoy es Canadá hasta Chile,

(CASSERES, 1970). Fue llevado a Europa después del descubrimiento de

América y su cultivo se extendió por los diversos países del mundo donde

encontró condiciones de clima apropiados formando variedades adaptables a

los diversos ambientes, teniendo amplia difusión en todos los países con clima

templado (CHIAPPE, 1970).

Figura 1. Planta común del género Phaseolus vulgaris L.

Existe aproximadamente 13,000 especies de leguminosas, pero

menos de 20 son utilizadas como alimento (BRUNO, 1990) así, el principal

componente de la dieta alimenticia especialmente en Latinoamérica es el

 4

Phaseolus vulgaris L., éste género incluye a todas las especies de leguminosas

más conocido como frijol común (OCHO-ANIN et al., 2010).

2.1.2. Aspectos botánicos

[Link]. Morfología

El género Phaseolus comprende unas sesenta especies,

pertenecientes a los países cálidos, sus tallos son delgados de mayor o menor

altura según que se trate de variedades de enrame o enanas, (CUBERO y

MORENO, 1983).

CORTE LONGITUDINAL

Figura 2. Estructura anatómica del frijol.

Las hojas son compuestas de tres folíolas enteras, las flores

son de diverso color, papilionáceas y con pétalos desiguales, estandarte

orbicular, alas obovales, a veces ablongas, quilla lineal dispuesta en espiral o

en espolón, las flores se reúnen en racimos sencillos, insertos en la axila de las

hojas. El fruto es una legumbre de forma variabilísima, recta o curva con borde

redondeado o comprimido y las semillas son generalmente arriñonadas,

provistas de dos cotiledones gruesos (Figura 2), (TAMARO, 1981).

 5

[Link]. Taxonomía

La clasificación taxonómica para el Phaseolus vulgaris L.

variedad chaucha según (CASSERES, 1970) es la siguiente:

• División: Fanerógamas

• Subdivisión: Angiospermas

• Clase: Dicotiledones

• Orden: Rosales

• Familia: Leguminosae

• Subfamilia: Papilionordeas

• Tribu: Faseolas

• Género: Phaseolus

• Especie: vulgaris

• Nombre común: frijol, habichuela, judía común.

Asimismo (CEDANO, 2006) describe la clasificación

taxonómica para Cajanus caján L. frijol de palo, de la siguiente manera:

• Clase: Angiosperma

• Subclase: Dicotyledoneae

• Orden: Leguminosae

• Familia: Papilionaceae

• Género: Cajanus

• Especie: Caján L.
 6

2.1.3. Frijol de palo (Cajanus caján L.)

Esta planta según (CEDANO, 2006) es una leguminosa arbustiva

de crecimiento determinado y/o indeterminado, de ciclo perenne, posee hojas

alternadas trifolioladas distribuidas en forma espiral a lo largo del tallo, miden

por lo general de1 a 4 m de altura, poseen un follaje verde amarillento a verde

púrpura, fuera de la época de producción son arboles leñosos y crece sobre un

amplio rango de suelos bien agotados de playa a arcillas y materiales

metamórficos y en zonas húmedas con buen drenaje, en el Perú puede

cultivarse desde el nivel del mar hasta los 2500 msnm de altitud (OLIDEN,

1995).

Figura 3. Vainas y granos de frijol de palo Cajanus caján L.

El fruto es una legumbre o vaina que tiene de 2-9 semillas, su

forma es lineal-oblonga con los extremos agudos u obtusos, posee dos valvas

comprimidas con depresiones ligeras más o menos septada entre semillas. Las

semillas tienen forma arriñonada o redondeadas pueden ser blancas,

marrones, tintos o grises, las raíces producen nódulos similares al cowpea o

 7

anconí del grupo de los Rhizobium y su tamaño varía de 0,2 a 2 cm (CEDANO,

2006).

Son una fuente excelente de proteína, las semillas son consumidas

como verduras; los constituyentes químicos investigados indican que las hojas

del frijol de palo son ricos en flavonoides y estilbenos, los cuales son

considerados responsables de las eficacias benéficas en la salud humana, (WU

et al., 2009). El rendimiento según reporte de (OLIDEN, 1995) es de 1,244 a

1,662 TM/Ha, el peso de 1000 granos es de 80,7 a 91 ,3g.

2.1.4. Frijol chaucha (Phaseolus vulgaris L.)

Es de crecimiento arbustivo determinado de 40-45 cm, flor blanca a

lila, vainas de color verde con estrías moradas y granos de color rojo con jaspe

cremas. El inicio de la floración es a los 45 días de la siembra, la maduración

uniforme a partir de los 100 días de la siembra. Amplia adaptación desde 100

hasta 2500 msnm, razonablemente tolerante a la acidez del suelo con pH 5,5-

6,5; en el valle interandino la siembra puede ser todo el año, según lo señala

(MANDUJANO, 2008).

Se diferencian tres partes en el frijol común: la cáscara de la

semilla, el cotiledón y corte embriónico. La parte más importante en términos

de peso es el cotiledón porque contiene proteínas y carbohidratos, mientras

que la cáscara de la semilla contiene elevadas concentraciones de compuestos

fenólicos estos últimos asociados a la prevención de enfermedades crónicas,

(ROCHA-GUZMAN et al., 2007) en la Figura 4, se presenta las vainas y granos

de frijol chaucha.
 8

Según el Proyecto PARA (2003) citado por (MANDUJANO, 2008),

el rendimiento es de 2,000 a 4,000 kg/Ha, el peso de 100 granos es de 40

gramos.

Figura 4. Vainas y granos de frijol chaucha Phaseolus vulgaris L.

2.2. Las leguminosas en la nutrición humana

2.2.1. Composición nutritiva

Las leguminosas son plantas productoras de proteína por

excelencia y se encuentran en las hojas y semillas, el contenido de proteína en

frijol es 2-5 veces superior al de los cereales.

Las semillas de las leguminosas tienen un alto contenido en

promedio de carbohidratos de 35% al 67%, siendo el principal constituyente el

almidón, además tenemos la xilosa, celulosa y azúcares solubles en etanol

(CUBERO Y MORENO, 1993 y BRUNO, 1990}, en el Cuadro 1 se presenta la

composición químico proximal del frijol.

El contenido de grasa es bajo entre 1-2% en promedio, siendo algo

superior en garbanzos 6% y soya 18%. Las grasas de las leguminosas son

 9

ricas en aceites esenciales, el ácido oleico y linoleico están contenidos en 60-

65% del total de ácidos grasos.

Cuadro 1. Composición química del frijol.

1 2 3
Componentes

Humedad 9,68 NR 10,2

Proteína 18,71 19,73 22,5

Grasa 2,97 1,55 2,2

Cenizas 4,75 3,82 3,2

Fibra 3,15 NR 5,1

Carbohidratos 60,75 NR 61,9

NR: no reporta, 1: LOPEZ y BRASSANI (2008); 2: LEON et al., 1993 (frijol de palo); 3: BEJARANO et.

al. (2002).

Existen dos tipos de vitaminas en las leguminosas: las

hidrosolubles como la tiamina (81) de 0,3-0,4mg/100g, niacina 16mg/100g,

ácido fólico, ácido pantoténico y con escaso contenido la rivoflavina (82) de

0,1-0,4mg/ 100g, el ácido ascórbico (C) es muy escaso que son eliminados con

las operaciones culinarias de cocción y almacenamiento y las liposolubles

donde están el tocoferol y el caroteno (provitamina A) los valores de caroteno

oscilan entre 50-300 U.l. de vitamina A/1 OOg según el color y la variedad de

especies. Una Unidad Internacional (U.I.) de vitamina A equivale a 0,3 [Link] de

alcohol de vitamina A cristalina o retinol.

Entre los oligoelementos, se tiene: calcio 1OOmg/ 1OOg y hierro

7mg/ 1OOg, estos contenidos son absorbidos en un 10% debido en la presencia

 10

de ácido fítico y oxalatos presentes en los vegetales (CUBERO Y MORENO,

1993 y BRUNO, 1990).

2.2.2. Factores antinutricionales

Las semillas de las leguminosas contienen numerosos compuestos

con efectos antinutricionales sobre su valor nutritivo, algunos son termolábiles

desapareciendo tras un adecuado tratamiento térmico, otros son

termoestables, pudiendo desaparecer por lavado o cocido.

Entre los factores termolábiles están los inhibidores de la proteasa

que inhiben la acción de las enzimas digestivas como tripsina y quimiotripsina;

las lecitinas que son glicoproteínas capaces de unirse a azucares específicos,

los goitrógenos encontrados sólo en soya es un factor que causa bocio en

animales y humanos. Los cianógenos, se produce a partir de un glucósido por

la acción de una enzima presente en los tejidos vegetales; los factores

antivitamínicos aumentan los requerimientos de la vitamina O y B12, tienen

actividad antivitamina E, relacionada a la presencia de a-tocoferol oxidasa. En

los taninos condensados, el aumento considerable del valor nutritivo de las

leguminosas al ser tratados térmicamente no parece estar relacionado con la

presencia de factores antinutricionales como los antes mencionados, sino con

taninos condensados similares a los existentes en sorgo. La testa de

numerosas variedades de leguminosa contiene taninos condensados del tipo

pro-antocianina, estos polímeros consisten en moléculas flavan-3-oles

(Catequina, galocatequina) y flavan-3,4-dioles (leucocianidina, leucodelfinidina),

y son oligómeros con diferente grado de polimerización.

 11

Entre los factores termoestables están los alcaloides, que en la

tribu Phaseolae se encuentran en la forma indol, tiramina, y/o feniletilamina,

son responsables del amargor estando presentes en mayor o menor grado. Los

aminoácidos tóxicos, ej. La canavanina típica de la Papilionoideae, las

saponinas, se encuentran en las partes vegetativas como semillas de algunas

leguminosas como glucósidos de sapogenina; las flavonas e isoflavonas y los

fitatos, la importancia nutricional deriva de su gran poder quelante de iones

metálicos calcio y magnesio y de microelementos como hierro y zinc, no

obstante el fósforo contenido en los fitatos puede absorberse por acción de

fitasas; factores de flatulencia, sus principales causantes son la rafinosa y la

verbascosa, estos oligosacaridos desvían la digestión debido a la falta de la

enzima a-galactosidasa en los hombres (CUBERO Y MORENO, 1993 y

BRUNO, 1990).

2.3. Generalidades de los polifenoles

Los polifenoles son un conjunto heterogéneo de moléculas que comparten

las características de poseer en su estructura varios grupos bencénicos

sustituidos por funciones hidroxílicas (HERNÁNDEZ y GONZALES, 1999). Son

efectivos donadores de hidrógenos, particularmente los flavonoides, su

potencial antioxidante es dependiente del número y de la posición de los

grupos hidroxilos y su conjugación, así como la presencia de electrones

donadores en el anillo estructural, debido a la capacidad que posee el grupo

aromático de soportar el desapareamiento de electrones por desplazamiento

del sistema de electrones (KUSKOSKI et al., 2004).

 12

Los polifenoles se forman en el reino vegetal a partir de la fenilalanina y la

tirosina, e incluyen a los flavonoides, isoflavones, lignanos y taninos; en las

legumbres el color de la cáscara está determinado por la presencia y cantidad

de polifenoles tal como glicósidos, taninos condensados y antocianinas y estos

actúan como antioxidantes (DOSS et al., 2010).

2.3.1. Características de los Flavonoides

Los flavonoides son metabolitos secundarios que inicialmente se

forman como glicósidos y están subdivididos en 6 clases: flavonas, flavanonas,

isoflavonas, flavonoles, flavanoles, y antocianinas, que varían en sus

características estructurales alrededor del anillo heterocíclico de oxígeno. A

través de las diferencias en la composición de los glicósidos de flavonoides que

ocurren de una planta a otra, los glicósidos de flavonoides derivan solo de unas

cuantas agliconas (sin residuo de azúcar) y son absorbidos probablemente por

el organismo humano en esas formas. (KUSKOSKI et al., 2004).

La estructura química de los flavonoides se basa en el anillo de

flavano (Figura 5). La quercetina, kaempferol, myricitina, luteolina, apigenina

son algunos ejemplos importantes de flavonoides presentes en las fuentes

dietéticas (GUPTA et al., 2010).

Los flavonoides protegen al organismo del daño producido por

agentes oxidantes, pueden interactuar directamente con especies reactivas de

oxígeno y son inhibidores de la lipoperoxidación, (GONZÁLEZ-TORRES et al.,

2000).
 13
3'

4'

5'

5 4

Figura 5. Estructura básica de los flavonoides.

2.3.2. Quercetina

En la categoría de flavonol, la quercetina es el componente más

abundante en vegetales y frutas presente mayormente en te, vino, cebollas,

lechuga, repollo, brócoli, frijol, manzanas, melocotones trigo y en muchos otros,

sus propiedades biológicas están asociadas a sus elementos: antibacterial,

antiviral, antioxidantes antiinflamatorio y efectos anticarcinogénicos, (MAKRIS

Y ROSSITER, 2001).

En alimentos la quercetina, está presente en forma de glicosilados

mayormente como (3-glicósidos y la naturaleza de la glicosilación influye en la

eficiencia de la absorción de quercetina. La aglicona quercetina y sus

glucósidos son absorbidos mejor que la quercetina administrada en forma no

glucosídica, (WICZKOWSKI et al., 2008). In vivo, la absorción y metabolismo

de quercetina o de los glicósidos de quercetina se llevan a cabo en el intestino

delgado (CRESPY et al., 2001).

Recientes trabajos han demostrado beneficios efectivos en

formulaciones tópicas conteniendo quercetina (emulsiones no aniónicas y

 14

aniónicas), mostrando buena actividad antioxidante, al inhibir el estrés oxidativo

e inflamación inducido por irradiación UVB (VICENTINI et al., 2007).

2.3.3. Propiedades físicas y químicas de la quercetina

La quercetina es de color amarillo o algo anaranjado, normalmente

es sólido cristalino con un sabor amargo, poco soluble en alcohol, soluble en

agua, ácido acético glacial y en soluciones acuosas alcalinos (NTP-

TECHNICAL REPORT, 1992). Es un radical hidroxilo (*OH) y con sus

glucósidos sirven como poderosos antioxidantes porque muestran un potente

efecto supresivo del daño al ADN inducido por H2 0 2 (HERNÁNDEZ Y

GONZALES, 1999) también contra la peroxidación lipídica en fosfolípidos

biliares y en lipoproteína humana de baja densidad (MAKRIS Y ROSSITER,

2001) y la inhibición es dependiente de la dosis.

Es un potente antioxidante y tiene propiedad antiradical hacia el

radical hidroxilo, peroxilo, anión superóxido e inhibe la peroxidación de los

lípidos comparado con otros flavonoides. Estas propiedades de la quercetina

son debido a la presencia de 3 grupos funcionales químico activo en su

estructura (Figura 6): (i) la configuración del 3'4- dihidroxi catecol en el anillo B

que hace mas estable al radical fenoxi después de la donación del átomo de

hidrogeno. (ii) el enlace doble 2,3 en conjunción con el grupo 4 carbonilo en el

anillo C, (iii) el grupo 3-hidroxi en combinación con el doble enlace 2,3

incrementa la estabilidad del electrón a través de la molécula (VICENTINI et al.,

2007).
 15

OH
OH

HO

OH O

Figura 6. Estructura molecular de la quercetina.

2.4. Aspectos generales de la actividad antioxidante y radical libre

2.4.1. Antioxidantes

Un antioxidante es una sustancia capaz de neutralizar o bloquear la

acción oxidante de los radicales libres, manteniendo su estabilidad (AVELLO y

SUWALSKI, 2006).

La oxidación en organismos vivos es esencial para la generación

de energía en procesos biológicos. Sin embargo, el oxígeno de los radicales

libres y otras especies de oxígeno, que son continuamente producidos in vivo

trascienden en muerte celular y daño a los tejidos (CHYAU et a/., 2002).

[Link]. Sistemas de defensa antioxidante

El sistema de defensa antioxidante está constituido por un

grupo de sustancias que al estar presente en concentraciones bajas con

respecto al sustrato oxidable, retrasan o previenen significativamente la

oxidación de éste. Como sustrato oxidable se pueden considerar casi todas las

moléculas orgánicas o inorgánicas que se encuentran en las células vivas,

como proteínas, lípidos, hidratos de carbono y las moléculas de ADN. Los

antioxidantes impiden que otras moléculas se unan al oxígeno y las especies

 16

reactivas del oxígeno que con el resto de las moléculas presentes. La acción

del antioxidante es de sacrificio de su propia integridad molecular para evitar

alteraciones en lípidos, proteínas, ADN, etc., funcionalmente vitales o más

importantes (VENEREO, 2001 ).

[Link]. Antioxidantes enzimáticos

Las defensas antioxidantes consisten en evitar la reducción

univalente del oxígeno mediante sistemas enzimáticos. Se han descrito un

grupo de enzimas especializadas en inactivar por diferentes mecanismos a las

ERO, como es el caso de la superóxido dismutasa (SOD), la catalasa (CAT) y

la glutatión peroxidasa (GSH-Px), entre otros (HICKS et al., 2006).

[Link]. Antioxidantes no enzimáticos

Algunos de los antioxidantes no enzimáticos son: el

glutatión en su forma reducida (GSH), algunos minerales como selenio, cinc o

vitaminas como la rivoflavina, ácido ascórbico (vitamina C) y a-tocoferol

(vitamina E), éstos son esenciales para la defensa contra el daño oxidante

debido a que actúan como ca-factores de las enzimas antioxidantes (HICKS et

al., 2006).

2.4.2. Radicales libres

Los radicales libres son átomos, grupos de átomos o fragmentos de

moléculas que ~ontienen uno o más electrones desapareados o libres, en el

orbital externo, dándole una configuración espacial que genera gran

inestabilidad por lo que son muy reactivos ya que tiende a captar un electrón de

moléculas estables con el fin de alcanzar su estabilidad electroquímica. Una

vez que el radical libre ha conseguido sustraer el electrón que necesita, la

 17

molécula estable que se lo cede se convierte a su vez en un radical libre por

quedar con un electrón desapareado, iniciándose así una verdadera reacción

en cadena que destruye nuestras células (VENEREO, 2001 ).

Todos los seres vivos que utilizan el oxígeno para la generación de

energía liberan radicales libres, lo que es incompatible con la vida a menos que

existan mecanismos de defensa contra estas especies (ELVIR, 1994).

Las fuentes de producción de radicales libres pueden ser:

exógenos (que ingresan a través de la cadena alimenticia como antibióticos,

medicamentos contaminantes, quimioterapia, la exposición a radiación

ultravioleta e ionizante) o endógenos (que son sintetizados por la célula como

autoxidación de catecolamina, fagocitosis, peroxidación de lípidos, oxidación de

proteínas, oxidación de carbohidratos), (AVELLO Y SUWALSKI, 2006).

2.4.3. Química del radical libre

El oxígeno molecular es un dirradical, conteniendo 2 electrones

desapareados con una configuración espiral paralelo, como los electrones son

opuestos al espiral que ocupa la misma orbita, los electrones añadidos al

oxígeno molecular son transferidos uno a uno durante su reducción,

produciendo diversos intermedios altamente reactivos. La reducción completa

del oxígeno a H20 requiere 4 pasos y la generación de diversos radicales libres

y H202, que no es un radical libre en sí, porque contiene electrones no

apareados. El H202 es sin embargo considerado una especie reactivo de

oxigeno (ROS) por su capacidad de generar radicales libres altamente

reactivos a través de interacciones con transición de metales reactivos

 18

(CLARKSON y THOMPSON, 2000). La completa reducción del oxígeno es

expresado en las siguientes ecuaciones:

02 +e- ___. o2-* radical superóxido (1)

o2-* + H20 ___. H02* +OH- radical hidroperóxido (2)

H02* +e-+ H ___. H202 peróxido de hidrógeno (3)

H202 +e- ___. *OH+ OH- radical hidroxilo (4)

2.4.4. Especies Reactivas del Oxígeno (ERO)

Especies reactivas del oxígeno (ERO) es el término que se aplica

colectivamente a las moléculas radicales y no radicales que son agentes

oxidantes y/o son fácilmente convertidos a radicales (AVELLO y SUWALSKI,

2006).

Entre los radicales libres, por su importancia, están algunas

especies reactivas del oxígeno (ERO) y los lipoperóxidos o peróxidos lipídicos.

Las ERO con alto potencial reactivo son: el anión superóxido (Ol), el peróxido

de hidrógeno (H202) y el radical hidroxilo (OH). Por su parte, los lipoperóxidos

(R-COO) son moléculas de ácidos grasos en las que el grupo hidroxilo de la

formación carboxilo se halla en un estado de singlete activado, confiriéndole

propiedades de radical libre. El mecanismo oxidante de los radicales libres está

íntimamente ligado a su génesis, la cual sigue una secuencia de reacciones en

cadena (BENITEZ, 2006).

 19

2.4.5. Radicales sintéticos

[Link]. Radical DPPH (1, 1 difenil-2-picril-hidrazil)

La capacidad para secuestrar los radicales DPPH está en

función al contenido del principio activo presente en cada una de las plantas en

estudio.

(Á)) N
(Á)) N
1 1
N* +RH - - • • NH + R*
NO~N02 NO~N02
1" h
1" h

N02 N02

Figura 7. Reacción del radical DPPH con un antioxidante.

El principio del método de DPPH consiste en la sustracción

de un átomo de hidrógeno proveniente de un donador (ejemplo compuesto

fenólico) para generar el compuesto difenilpicrilhidrazina y una especie radical

(GARCIA et al., 2001). La reducción de la concentración del DPPH está

indicada como el decremento de la absorvancia en el tiempo. Según Brand-

Williams et al. (1995) citado por (SANDOVAL et al., 2001) la reacción producida

es la siguiente:

DPPH +AH DPPH-H +A

DPPH + R DPPH-R.
 20

[Link]. Radical peroxilo (ABTS)

Actualmente el método ABTS según (JANASZENSKA y

BARTOSZ, 2002) es muy usado tanto para materiales biológicos, compuestos

puros o extractos de plantas de naturaleza hidrófila o lipofílica. El ABTS,

generador del radical libre 2,2'-azinobis (3-etil-benzotiazolino-6-ácidosulfónico)

presenta color azul/verde con máximo de absorción a 342nm, es muy soluble

en agua y químicamente estable. El ABTS•+ una vez generado por medio de

enzimas (peroxidasa, mioglobina) o químicamente (dióxido de manganeso,

persulfato potásico o ABAP 2,2' -azobis-(2- midinopropeno), presenta nuevas

características con máximos de absorción a 414, 645, 734 y 815 nm. El radical

generado químicamente (persulfato potásico) fue validado por su estabilidad, la

reacción es relativamente rápida comparada con el DPPH. La alta reactividad

de este radical influye directamente en la obtención deiiC50 . Asimismo es más

indicado para ensayos de compuestos coloreados, como el caso de los

antocianas por presentar absorción máxima próxima a la región infrarroja (734)

reduciendo posibilidades de interferencia de compuestos coloreados que

absorben en la región visible o compuestos resultantes de reacción secundaria,

(KUSKOSKI et al., 2004).

 111. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. Lugar de ejecución

El presente trabajo de investigación se ejecutó en los laboratorios de

Biotecnología en el Centro de Investigación de Productos Naturales de la

Amazonia (CIPNA), de la Universidad Nacional Agraria de la Selva (UNAS);

ubicado en Av. Universitaria s/n, distrito de Rupa Rupa, Provincia de Leoncio

Prado, región Huánuco; a una altitud de 667 m.s.n.m. con clima tropical

húmedo y con una temperatura promedio 24°C y humedad relativa media de

89%.

3.2. Materia prima

Se empleó dos especies de semillas de frijoles desarrollados pero no

secos: frijol de palo (Cajanus caján L.) y frijol chaucha (Phaseolus vulgaris L.),

procedentes de la zona Alto Huallaga, fueron colectados en el mercado modelo

de la provincia de Leoncio Prado.

3.3. Materiales y equipos de laboratorio

3.3.1. Materiales de Laboratorio

• Matraces erlenmeyer de 150, 250 ml.

• Vasos de precipitación de 50, 80, 100, 250 y 1000 ml.

• Pipetas graduadas de 1O ml.

• Micropipetas 10-50 [Link], 10-1 [Link], 20-200 [Link] y 100-1000 [Link].

 22

• Tubos de ensayo Gene Mate® de 1O m l.

• Fiolas de 10, 50, 100, 500 y 1000 ml.

• Probetas graduadas de 1O, 100, 250 y 500 ml.

• Cubetas de poliestireno, Gene Mate®(1cmx1cmx4,5 cm).

• Tips, FISHERBRAND® (1000 y 200 ¡.tl).

• Microtubos (1 ,5-2,00 ml).

• Frascos color ámbar (250, 500 ml)

• Bolsa de polietileno de alta densidad.

• Papel filtro n° 42 fino (whatman).

3.3.2. Equipos de laboratorio

• Espectrofotómetro modelo Genesys 6 (Thermo Electrón Corporation).

• Balanza analítica modelo ESJ-210-4 (Digital precisión).

• Estufa eléctrica modelo ODH6- 9240A (TOMOS Heatring Drying Oven)

• Desionizador modelo D 7035 (Barnstead).

• Centrifuga modelo MIKRO 22R (Hettich).

• Homogenizador modelo VORTEX GENIE-2 (Scientific industrias SI™).

• Baño Maria modelo YCW-01 OE (Associated With Cannic, lnc, USA).

• Refrigeradora Ice beam Door Cooling LG GR-5392QLC.

• Molino de grano de 1 mm de luz.

• Balanza analítica modelo SCOUT PRO SP2001 (Ohaus).

• Sonicador modelo KD-05AB,JACUitrasonic.(Lab. Corporation).

3.3.3. Reactivos y soluciones

• Ácido gálico al 98,1% Sigma Aldrich.

• Quercetin hydrate, 95% Sigma Aldrich.

 23

• 1, 1-Diphenyl-1-picrilhydrayl (DPPH; Sigma Aldrich, USA).

• 2,2-azino-bis (3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt

(ABTS; Sigma Aldrich, USA).

• 2,2-azobis (2-amidino-propane)(ABAP; Sigma Aldrich, USA)

• Fosfato de potasio dihidrogenado (Scharlau, UE).

• Metanol (grado HPLC), Sigma Chemical

• Etanol al99.99% Merck KGaA.

• Folin-Ciocalteu phenol reagent, 2N, Sigma Aldrich.

• Carbonato de sodio (Na2C03) p.a. ISO. Scharlau.

• Hidróxido de Sodio (NaOH) en lentejas p.a. ISO. Merck. Germany.

• Agua destilada desionizada (H20dd).

• Ácido clorhídrico pureza: 36,01%, Merck. Germany.

3.4. Métodos de análisis

3.4.1. Cuantificación de polifenoles totales

Se realizó según el método de Folin-Ciocalteu, reportado por

SANDOVAL et al. (2001).

3.4.2. Cuantificación de quercetina

Se realizó de acuerdo al método espectrofotométrico descrito por

TOKUSOGLU et al. (2003).

3.4.3. Radical DPPH (2,2-diphenyl-picrilhydrayl)

Se utilizó el método espectrofotométrico descrito por Brand-

Williams et al. (1995) reportado por SANDOVAL et al. (2001).

 24

3.4.4. Radical peroxilo (ABTS)

Se empleó el método de ABTS reportado por SANDOVAL et al.

(2001).

3.5. Metodología experimental

3.5.1. Preparación de las muestras

Para la obtención de las muestras en estudio se siguió el

Flujograma (Figura 8) y se detalla a continuación:

• Recepción: En el laboratorio se recolectó las semillas en vainas verdes del

frijol chaucha y palo.

• Desvainado: En esta operación, los granos de frijol fueron liberados

manualmente de la vaina que los contiene.

• Separación: Esta operación fue manualmente, consistió en separar la

cáscara y cotiledón.

• Secado: El secado se realizó a 45°C/48 horas para eliminar la humedad.

• Molido: La molienda se realizó en un molino de granos con malla 1mm de

luz, para reducir el tamaño de las partículas.

• Envasado: se envasó en bolsas de polietileno de alta densidad y se

sellaron herméticamente.

• Almacenamiento: se almacenó a -2oac hasta el momento de análisis.

 25

Recepción

Vainas

Cascara Cotiledón

1mm de malla

Bolsas de polietileno

Figura 8. Flujograma de operaciones para la obtención de muestras.

3.5.2. Preparación de los extractos

Para la evaluación del contenido de polifenoles totales y la

capacidad antioxidante (radical DPPH y peroxilo) se procedió según la Figura

9. Se pesó 20g de muestra seca pulverizada en un frasco ámbar a la que se le

añadió 1OOmL de etanol al 70%(v/v) obteniendo una solución stock de 200

mg/ml de concentración, se tapó herméticamente y se dejó macerar por 24

horas a temperatura ambiente, luego las muestras se filtraron. Seguidamente el

líquido filtrado se centrifugó a 1000 rpm 1 10 min. a 4°C. Finalmente se

 26

realizaron las diluciones respectivas para cada una de las pruebas. Los

tratamiento en estudio fueron: cotiledón de frijol palo (MP); cáscara de frijol

palo (CP); cotiledón de frijol chaucha (MC); cascara de frijol chaucha (CC).

Muestra

20g/1 OOmL, etanol 70%

24 h/ temperatura ambiente

1O 000 rpm/4 oC/1 O m in

R1 R2 R3

Figura 9. Secuencia de operaciones en la preparación de extracto etanólico.

3.5.3. Cuantificación de polifenoles totales de dos especies de frijol

[Link]. Determinación de la curva estándar

Para determinar la curva estándar de polifenoles totales se

preparó solución de ácido gálico a diferentes concentraciones según el Cuadro

2. En tubos de ensayo de 1Oml, se añadió 1,58ml de agua desionizada, 20¡JL

de control y estándares (agua desionizada), luego se le agregó 1OO¡JL de

 27

solución fenol Folin-Ciocalteu, se incubó por 1 minuto a temperatura ambiente y

se neutralizó la reacción añadiendo 300¡.JL de Na2C03 al 20%, se dejó incubar

por 2 horas, a temperatura ambiente.

Cuadro 2. Preparación de la curva estándar de polifenoles totales.

ácido gálico Etanol70% Volumen final

Concentración

(tJg/mL) (tJL) (tJL) (tJL)

0,0625 42 958 1000

O, 1250 83 917 1000

0,2500 167 833 1000

0,5000 333 667 1000

1,0000 667 333 1000

1,5000 1000 o 1000

La lectura de la absorvancia se efectuó a 700 nm, los

resultados fueron plateados considerando la concentración vs las absorvancia,

con los que se obtuvo la ecuación matemática y se determinó el coeficiente de

correlación.

[Link]. Cuantificación de polifenoles totales

Para la cuantificación de polifenoles totales se tomó

alícuotas del extracto etanólico (Figura 9). Estas alícuotas se centrifugaron a

4°C, 10,000 rpm/ 10 min. Se preparó concentraciones intermedias por

quintuplicado de cada una de las muestras (Cuadro 3). Seguidamente se

trabajó igual que la curva patrón con la única variación que en lugar de los

20¡.JL del control se adicionó la misma cantidad de muestra en estudio, se tomó

 28

la lectura de la absorvancia a 700 nm. Las muestras fueron analizadas

siguiendo el diseño experimental de la Figura 12.

Cuadro 3. Preparación de concentraciones para la cuantificación de

polifenoles totales.

Concentración Muestra Etanol70% volumen

Tratamientos mg/mL FD IJL IJL totaiiJL

MP 400 1 1000 o 1000

CP 200 1 1000 o 1000

MC 400 1 1000 o 1000

ce 10 20 990 10 1000

MP=cotiledón de frijol palo, CP= cascara de fríjol palo, MC= cotiledónde frijolchaucha, CC=

cáscara de frijol chaucha.

Los resultados obtenidos de la cuantificación de polifenoles

totales fue evaluado mediante el diseño completo al azar (DCA), en los niveles

de significancia se aplicó la prueba de Tuckey P< 0,05, los cálculos se

realizaron en el programa lnStatGraphic.

3.5.4. Cuantificación de quercetina en dos especies de frijol

La preparación de muestras se realizó según el Flujograma de la

Figura 1O. Que implicó una hidrolisis acida, seguido de un agitado vigoroso con

calentamiento, se dejó enfriar a temperatura ambiente y luego se sometió a una

sonicación con la finalidad de liberar el oxígeno atrapado en las células

presentes en la solución y finalmente se filtró con papel whatman no 40 para

separar el sobrenadante.
 29

Frijol pulverizado

Hidrólisis ácida Metano! al 1% con HCic + 5 ml de HCI 1,2M

Agitado A 90°C con reflujo 1 2 horas

Enfriado Temperatura ambiente

Sonicado 3min

Filtrado

Figura 10. Flujograma de preparación de muestra para la cuantificación de

quercetina.

[Link]. Determinación de la curva estándar de quercetina

Se preparó una solución stock de 1mg/ml de

concentración (0,002g de quercetina/2ml metano! al 99.9%) a partir de ésta se

generaron soluciones a diferentes concentraciones: 1; 0,5; 0,25; O, 1 y

0,05mg/ml por triplicado como se muestra en el Cuadro 4. La lectura se realizó

a 266 nm; con los valores de concentración vs absorvancia se halló la ecuación

matemática y el coeficiente de correlación.

 30

Cuadro 4. Preparación de la curva estándar de quercetina.

Concentración Quercetina Metanol Volumen final

(IJg/mL) (IJL) (IJL) (IJL)

0,005 5 995 1000

0,010 10 990 1000

0,025 25 975 1000

0,050 50 950 1000

0,100 100 900 1000

[Link]. Cuantificación de quercetina

Para esta evaluación se pesó Sg de muestra pulverizada en

un frasco, se añadió 25 mL de metanol acidificado1% (v/v) de HCI concentrado,

en seguida se adicionó SmL de HCI 1,2M. La mezcla fue agitado con el frasco

tapado herméticamente a 90°C bajo reflujo por 2 horas, el extracto fue enfriado

a temperatura ambiente por 30 min, luego se sonicó por 3 min, el extracto final

fue filtrado y centrifugado a 10,000 rpm, a 4°C/ 5 min., finalmente se prepararon

las diluciones para todas las muestras fue 1O y para cáscara frijol chaucha fue

(CC) 100 y se procedieron a tomar las respectivas lecturasa 266 nm por

triplicado. La distribución de los tratamientos se presenta en la Figura 11.

Los resultados obtenidos de la cuantificación de quercetina

fue evaluado mediante el diseño completo al azar (DCA), en los niveles de

significancia se aplicó la prueba de Tuckey P< 0,05, los cálculos se realizaron

en el programa lnStatGraphic.
 31

Extracto hidrolizado

Filtrado

Centrifugado 1O 000 rpm/5 min/4 oc

Dilución 1:10, 1:20, 1:100

r1 r2 r3

Lectura 266nm

Cuantificación quercetina total

Figura 11. Secuencia para la cuantificación de quercetina.

3.5.5. Evaluación de la capacidad antioxidante en dos especies de

frijoles

[Link]. Coeficiente de Inhibición IC50 del radical DPPH

Se preparó 1O ml de solución stock de DPPH a 1mM en

etanol al 99%, se agitó hasta la disolución total y se almacenó a 4°C protegido

de la luz. A partir de esta solución stock se preparó 20 ml de DPPH a 100 !JM

(segunda solución) como concentración final para medir la capacidad de

secuestro de las muestras experimentales, la concentraciones de muestra

fueron 1O 000; 7 000; 4 000; 1 000 ¡.Jg/ml, se prepararon soluciones stocks de

 32

200mg/mL (Figura 9). A partir del stock se generaron soluciones intermedias

(Cuadro 13 del Anexo C) semejantes para cada tratamiento.

A una cubeta de poliestireno de 1x 1 x 4.5 cm se adicionó

50 IJL de la muestra y 950 IJL del radical DPPH a 100 IJM que son similares

para todos los tratamientos MP, CP, MC y CC, la lectura se realizóa 515 nm

con un tiempo de 1O min e intervalos de tiempo de 30 segundos. La inhibición

de los radicales libres DPPH* es determinado por la decoloración de la solución

de violeta a amarillo. Para calcular la capacidad de secuestro de radicales

DPPH por los tratamientos en estudio se utilizó la siguiente expresión:

%/nhibicionDPp H = [ (AbsControl- AbsMuestra )] x 100

AbsControl

Donde: Abs Control: Absorvancia del control (radical DPPH)

Abs Muestra: Absorvancia de la muestra en estudio a 1O m in.

Los resultados obtenidos del coeficiente de inhibición del

radical DPPH fue evaluado mediante el diseño completo al azar (DCA), en los

niveles de significancia se aplicó la prueba de Tuckey P< 0,05, los cálculos se

realizaron en el programa lnStatGraphic.

[Link]. Coeficiente de Inhibición IC 50 del radical peroxilo

Se prepararon las siguientes soluciones: 1OOmL de ABTS a

2,25 mM, 100mL ABAP a 20 mM, 11 de solución buffer fosfato a pH 7,4 (PBS)

con cloruro de sodio (NaCI) a 154 mM, fosfato de sodio heptahidratado

preparación de radical peroxilo consistió en mezclar 1O mL de solución de

ABTS, 10mL ABAP y 80 mL de PBS (pH 7,4), se incubó a 70°C en baño

 33

maría/15 min. obteniéndose una solución de color azul brillante y se dejó enfriar

sobre hielo aproximadamente 30 min. Paralelamente a esto se prepararon

soluciones intermedias partiendo de la solución stock 200mg/mL (Cuadro 15

del Anexo C) semejante para cada uno de los tratamientos

La evaluación del radical ABTS se efectuó a partir de la

adición de 101-JL de las concentraciones intermedias (2000; 1200; 400 y 40

IJg/mL con 9901-JL de la solución stock del radical ABTS. La lectura se realizó a

414 nm con un tiempo de 10 mine intervalos de tiempo de 30 segundos. El

decrecimiento de la absorvancia es determinado por la decoloración de la

solución de radicales ABTS. El porcentaje de la inhibición del radical ABTS fue

calculado de acuerdo a la siguiente ecuación:

h .b. . p
0 _., J¡
/O n
.
1 zcwn eroxz 1o = [ (AbsControl - AbsMuestra )] x 100
AbsControl ·

Donde: Abs Control: Absorvancia del control (radical peroxilo)

Abs Muestra: Absorvancia de la muestra en 1O min.

El Coeficiente de Inhibición (IC 50) se determinó mediante el

análisis de regresión lineal del porcentaje de inhibición vs la concentración de

los extractos etanólicos 70% de cada una de los tratamientos en estudio

necesarios para inhibir el 50% de radicales libres Brand-Williams et al. (1995)

reportado por SANDOVAL et al. (2001). Los resultados obtenidos del

coeficiente de inhibición ICso del radical peroxilo fue evaluado mediante el

diseño completo al azar (DCA), en los niveles de significancia se aplicó la

prueba de Tuckey P< 0,05, los cálculos se realizaron en el programa

lnStatGraphic. El diseño experimental de la investigación se presenta en la

 34

Figura 12 para la evaluación de polifenoles, quercetina y el coeficiente de

Inhibición IC 50 (mg/ml) del radical DPPH y peroxilo.

Extracto etanólico

1OOOOrpm/1 Omin/4 o

Según la muestra experimental en 1-JQ/ml.

Polifenoles/DPPH/ Peroxilo

r1 r2 r3

~ Polifenoles: 700nm
Lectura DPPH: 515nm/10min
1 J Peroxilo: 414nm/1 Omin.
~
Polifenoles totales, evaluación: DPPH y
Peroxilo (IC5o)

Figura 12. Diseño experimental para cuantificación de polifenoles totales y

coeficiente de Inhibición IC5o del radical DPPH y peroxilo.

 IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1. Cuantificación de polifenoles totales en la cáscara y cotiledón de dos

especies de frijoles

Los frijoles son una de las principales fuentes de proteína, caloría,

vitaminas del complejo B y minerales así como de fibra y polifenoles tal como

flavonoides, isoflavonas, ligninas y taninos, existe una gran infinidad de frijoles

que varían por sus características fisiológicas como colores, tamaño y otros

factores; en nuestra localidad es muy reconocido el frijol de palo (Cajanus caján

L.) y el frijol chaucha (Phaseolus vulgaris L.), cada uno con características

peculiares.

En el Cuadro 5 y Figura 13 se muestra los resultados del contenido de

polifenoles totales en cotiledón y cáscara de dos especies de frijoles que

crecen en la zona de Tingo María, frijol de palo (Cajanus caján) y frijol chaucha

(Phaseolus vulgaris), estos valores fueron obtenidos en base al modelo

matemático (Cuadro 1O y Figura 18 del Anexo A). Del análisis estadístico

(Cuadro 11 del Anexo A) podemos indicar que existe diferencia significativa

entre los tratamientos, comparando los promedios mediante la prueba de

Tuckey (p<0,05) se encontró que el mayor contenido de polifenoles esta en el

tratamiento CC (cáscara de frijol chaucha) 2,747.8±52,89 mg EAG/100g y el

menor contenido lo presentó el tratamiento CM (cotiledón de frijol chaucha)

24,176±0,74 mg EAG/100g.
 36

Cuadro 5. Contenido de polifenoles totales en la cáscara y cotiledón de dos

especies de frijol.

polifenoles totales

Frijol Partes Tratamiento Mg AGE/1 OOg *mf

Palo cotiledón MP 38,492 ± 0,50°

cascara CP 54,725 ±O, 18b

Chaucha cotiledón MC 24,176 ± 0,74b

cascara ce 2747,8 ± 52,84a

*mf representa valores en base húmeda, Los valores representan el promedio ± SEM, Los valores

en una misma columna con diferente superíndice son estadísticamente diferentes (p<0,05).

3000
C)
e

-
e
.....
C)
<C
w
2500

2000
C)
E
i'ª 1500
ftiCII
()"C
1- 1000
U)
Cll
oS: 500
~
oQ. o
MP CP MC ce

Figura 13. Comparación del contenido de polifenoles totales entre los

tratamientos.

MAS UM et al. (2011) reportaron resultados en varios genotipos de frijol en

el siguiente orden decreciente basado en los valores promedios black>small

 37

red >great Northerm> Pinto >Navy> Snap siendo los de color oscuro de mayor

capacidad antioxidante que los poco coloreados. Con respecto al frijol de palo

Cajanus caján el contenido de polifenoles totales en la cáscara y cotiledón

(54,725±0,18 mg EAG/100g y 38,492±0,50 mg EAG/100g respectivamente),

presenta diferencias significativas; autores como SREERAMULU et al. (2009)

reportan valores en frijol Red gramdhal (Cajanus caján) 229,33±3,34 mg

EAG/100g; OBOH (2006) reporta en frijol C. caja}án (Brown) 1,2±0,2 mg EAG/g

y en C. caján (White) 0,4±0, 1 mg EAG/g; finalmente SREERAMULU et al.

(2009) reportaron en cereales un rango de 4 7,64-373,15 mg EAG/1 OOg y en

leguminosas 62,35-418,34 mg EAG/1 OOg éstos valores son ligeramente

superiores a los obtenidos en el presente trabajo.

Comparando el valor que se reporta en cáscara de frijol chaucha (2747,8

mg EAG/100g) con otros tipos de alimentos como la cáscara de uva

5,370±0,29 mg EAG/1 OOg, ZHI Y HOWARD (2005); en lentejas (Lens

esculenta) 112,91±3,19 mg EAG/100g en soya 100,54 mg EAG/100g yen frijol

Rajmah (Phaseolus vulgaris) 332,94±8,06 mg EAG/1 OOg datos reportados por

SREERAMULU et al. (2009); así como BOATENG et al. (2007) reportaron en

frijol crudo 612,1 O mg EAG/1 OOg; ROCHA-GUZMAN et al. (2007) reportaron en

frijol Black Otomy 9,23±0, 1O mg EAG/1 OOgy en frijol yellow peruano-87

5,38±0,49 mg EAG/1 OOg se observa un amplio rango de valores.

VARGAS-ALVAREZ et al. (2004) sostienen que el contenido de los

flavonoides varía sustancialmente entre genotipos, cambios estacionales, edad

y daños que pudren el tejido vegetal. Asimismo KIM et al. (2003) también

mencionan que la distribución y composición de fitoquímicos fenólicos son

 38

afectados por el manejo, practicas horticulturales, cultivares, origen geográfica,

almacenamiento, etc.; además puede deberse al tipo de extracto empleado

(acuoso, etanólico, metanólico, etc.), en el presente trabajo se utilizó extracto

etanólico al 70%, MONROY et al. (2004) sostienen que el agua tiene una

polaridad más alta que el etanol, la presencia de compuestos orgánicos son

más solubles en etanol que en agua y sensibles al reactivo fenol de Folin-

Ciocalteu, esto provoca diferencias en la cantidad de polifenoles extraídos.

Por otro lado los resultados indican que los polifenoles están mayormente

ubicados en la cáscara de las semillas sobre todo coloreadas, en estudios

realizados por ROCHA-GUZMAN et al. (2007), demuestran que los

compuestos fenólicos no flavonoides fueron localizados mayormente en el

cotiledón; mientras que los flavonoides en la cáscara de la semillas de colores

oscuros, de igual modo [Link] et al. (2006), indica que el color

de la semilla de frijol esta determinado por la presencia y concentración de

compuestos polifenólicos y estos son mayormente flavonoides tales como

glicósidos de flavonol, antocianinas y taninos condensados (proantocianidinas)

el más ampliamente distribuido.

4.2. Cuantificación de quercetina en dos especies de frijol

4.2.1. Determinación de la curva estándar

Para la cuantificación de quercetina en las muestras de frijoles fue

necesario elaborar una curva estándar cuyos resultados se presenta en el

Cuadro 6 y Figura 14.

 39

Cuadro 6. Concentraciones de quercetina para la curva estándar.

Concentraciones (mg /mL)

Repeticiones 1 0,05 0,025 0,01 0,005

1 0,459 0,309 0,264 0,079 0,008

2 0,406 0,343 0,168 0,096 0,010

3 0,440 0,312 0,146 0,096 0,093

Promedio 0,435 0,321 0,193 0,090 0,037

Se obtuvo un modelo matemático que sirvió de base para la

cuantificación de quercetina en las muestras de frijol y el valor R fue 0,999; lo

que significa según MURRAY (1969) que existe un buen grado de correlación

entre las variables X (concentración de quercetina) y la variable Y

(absorvancia), debido a que se halla una relación proporcional entre las

variables.

0.2400
0.2200 y = 2.855x + 0.086
R2 = 0.999
0.2000
0.1800
0.1600
0.1400
0.1200
0.1000 +----,-----,----..,..------.,--------,
0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06

Figura 14. Curva estándar de quercetina.

 40

Asimismo HERNANDEZ et al. (2001 ), mencionan que tales

correlaciones se expresan en hipótesis sometidas a pruebas. El mismo autor

sostiene que la utilidad y el propósito principal de las correlaciones cuantitativas

son saber cómo se puede comportar un concepto a una variable conociendo el

comportamiento de otras variables relacionadas.

Para la curva estándar se debe utilizar sustancias puras para

estudiar el comportamiento del componente y evitar interferencias con otros

compuestos o impurezas; en el presente trabajo para la curva estándar se

utilizó quercetina con 99% de pureza, cuya fórmula química es C15 H2 00 7 , peso

molecular 302,23, según BADUI (1988) su máxima absorción es 258 y 375 nm

y presenta actividad antioxidante.

4.2.2. Cuantificación de quercetina

La quercetina es un flavonoide vegetal del tipo flavonol, se

encuentra ampliamente distribuido en la mayoría de los vegetales y frutas, por

lo que es considerado un componente común en la dieta humana, este

fitoquímico anticancerígeno que inhibe la proliferación y el crecimiento de

células tumorales, ejerce múltiples efectos bioquímicos en las células de los

mamíferos, la inhibición de actividades enzimáticas tales como las de

proteinquinasa y Rotein-tirosin-quinasa.
 41

Cuadro 7. Contenido de quercetina en dos especies de frijol.

Frijol Partes planta Tratamiento mg quercetina/1 OOg mf*

Palo cotiledón MP 2,087 ± O, 156

cascara CP 4,291 ± 0,34b

Chaucha cotiledón MC 2,711 ± 0,21b

cascara ce 159,67 ± 9,00 8

*mf base húmeda, Los valores representan el promedio ± SEM, una misma columna con diferente

superíndice diferentes (p<0,05).

180

160

e 14o
en
g
-
¡S::¡ 100
:;:::¡
120

~ 80
G)
:S 60
C"
en
E 40
20

o +-~--~--.--------.--~=-L--r--

MP CP MC ce

Figura 15. Comparación del contenido de quercetina entre los tratamientos.

En el Cuadro 7 y Figura 15 se muestran los resultados de la

quercetina; según el análisis estadístico (Cuadro 12 del Anexo B) existe

diferencia altamente significativa. Comparando los valores promedios,

encontramos que el mayor contenido lo presentó la cáscara de frijol chaucha

(CC) 159,67±9,00 mg quercetina/100g y el menor contenidos se encontró en

 42

MP, CP y MC (2,087±0, 15, CP 4,291±0,34 y MC 2,711±0,21mg Quercetina/

100 g) respectivamente, VARGAS-ALVAREZ et al. (2004) sostienen que en las

especies de frijoles los flavonoides varían fundamentalmente entre genotipos,

cambios estacionales, edad, daño de la hoja y sitios de ubicación, además

indica que las hojas jóvenes son la fuente principal de compuestos fenólicos,

porque los sintetiza como defensa contra predadores herbívoros que los

prefieren por su mayor calidad nutricional respecto a las hojas maduras.

Comparando el valor del frijol palo Cajanus caján L. (cotiledón y

cascara) y Phaseolus vulgaris L. (cotiledón) son similares (2-4 mg), por el

contrario en cáscara de frijol chaucha se reportó 159,67±9,0 mg

quercetina/1 OOg, según OCHO-ANIN et al. (201 O) en la evaluación de

compuestos bioactivos en semillas secas de Phaseolus vulgaris indica 31 mg

quercetina/1 OOg, otros autores como HALL 111 (s/d) reportan 2,5mg

quercetina/100g en trigo; VARGAS-ALVAREZ et al. (2004) evaluaron en

diferentes partes anatómicas del árbol de guayabo y reportaron el mayor

contenido en el botón floral 203,6 mg quercetina/100g seca y el menor

contenido en el fruto 12,6 mg quercetina/100g; además el mismo autor

menciona que los flavonoides varían para la época del año, incidencia de luz,

características edafológicas y la especie; además la biosíntesis de los

flavonoides esta secuenciada, siendo la quercetina el producto final de la

flavonoles y flavones antes de formar taninos. Asimismo WICZKOWSKI et al.

(2008) indican que la quercetina está presente mayormente en té, vino, cebolla,

lechuga, brócoli, frijol, manzana, trigo y otros alimentos.

 43

En otros estudios OCHO-ANIN et al. (2010), caracterizó los

principales constituyentes bioactivos del frijol Phaseolus vulgaris L. y reveló que

estas semillas contienen alcaloides, glicósidos de flavonoides, polifenoles,

taninos y terpenoides y todos ellos son los mayores grupos fitoquímicos con

actividades biológicas, asimismo, GALVEZ-RANILLA et al. (2007), confirma

que los taninos condensados y flavonoides tales como kaempferol y glicósidos

de quercetina fueron mayormente encontrados en la cáscara de la semilla y los

cotiledones fueron ricos en ácidos fenólicos tal como acido ferúlico, sinápico,

clorogénico y otros.

4.3. Evaluación de la capacidad antioxidante en dos especies de frijol

4.3.1. Coeficiente de inhibición del radical DPPH

La familia de las leguminosas son producidos y consumidos a nivel

mundial debido a que son ricos en lisina y tripsina pero bajo en contenido de

aminoácidos azufrados, sin embargo se ha demostrado que contienen

polifenoles tales como flavonoides, isoflavonas y lignanos, que les confieren

propiedades antioxidantes.

En el Cuadro 8 y Figura 16 se presenta La evaluación del

coeficiente de inhibición (ICso) del radical DPPH en las especies de frijol

(Cuadro 14 del Anexo C) muestra mediante la prueba Tuckey (p<0,05) que

existe diferencia estadística significativa, observándose que la cáscara del frijol

chaucha (Phaseolus vulgaris) presentó la mayor eficacia en la captura del

radical 1, 1-difenil-2-picrilhidrazil IC50 0,032mg/mL, seguido del frijol palo

(Cajanus caján) 6,28±0,10 mg/ml.

 44

Cuadro 8. Comparación del coeficiente de Inhibición IC 50 (DPPH) en dos

especies de frijol.

Frijol Parte Tratamiento ICso (mg/ml)

Palo cotiledón MP 21,63 ± 0,26d

cascara CP 6,28 ± 0,10b

chaucha cotiledón MC 20,64 ±O, 14c

cascara ce 0,032± o,ooa

Los valores representan el promedio ± SEM. Los valores en una misma columna con diferente

superíndice son estadísticamente diferentes (p<0,05).

25

20
....1

-E
C)

.§.
15

J:
a..
a.. 10
e. o
!:::!"'
S

o
MFP CFP MFC CFC

Figura 16. Comparación entre la eficiencia de los tratamientos frente al radical

DPPH.

Al respecto MAS UM et al. (2011) en el trabajo referido a diferentes

genotipos de frijoles indican que los frijoles coloreados tienen gran propiedad

antioxidante y antiradical comparados con los frijoles poco coloreados. A su vez

XUT Y CHANG (2009), sostienen que la actividad antioxidante en los frijoles

 45

pintos esta dado por flavonoides y ácidos fenólicos y en frijol negro esta

actividad lo da las antocianinas, flavan-3-oles y flavonoles.

Según los resultados de la investigación el coeficiente de la

inhibición del radical DPPH en cotiledón y cáscara de ambos frijoles fue

diferente, en cotiledón fluctuaron IC5o 20-21mg/ml y en cáscara IC5o 0,032 a 6

mg/ml. Según HEIMLER et al. (2005), quienes encontraron valores de IC50 de

39-281 O mg/mg de DPPH en frijoles. KONG et al. (2009) reportaron en extracto

etanólico IC50 0,2259mg/ml; OOMAH et al. (2010), en extracto acetona 70% en

cáscara de frijol negro como mejor al COX-1 con IC50 1,2 IJg/mL y COX-2 con

IC 50 38 IJg/mL, la determinación de la cuantificación de la actividad antioxidante

es variado existe alrededor de 20 índices para expresar esta propiedad entre

ellos esta el radical DPPH, FRAP, TROLOX, AOA entre otros, el mismo autor

reporta para frijoles rajmah (Phaseolus mungo Roxb) un valor de DPPH 1,07

Trolox equivalente mg/ml y para FRAP 373 [Link]/g.

4.3.2. Coeficiente de inhibición del radical peroxilo

En el Cuadro 9 y Figura 17 se presenta la comparación de los

coeficientes de inhibición del radical peroxilo en dos especies de frijol en el

cotiledón y cáscara. Realizando el análisis estadístico de los resultados se

encontró que existió diferencia estadística significativa (Cuadro 16 del Anexo

C), comparando los medios encontramos que la mayor eficiencia antioxidante

lo presentó la cáscara del frijol chaucha IC 50 0,0078 mg/ml y el menor

correspondió al mismo frijol pero al cotiledón IC 50 1,890±0,02 mg/ml, esta

diferencia lo explican AMAROWICZ et al. (2009) quienes indican que el efecto

antiradical y antioxidante depende de la fracción analizada tal como la cáscara

 46

o toda la semilla.

Cuadro 9. Resultados del coeficiente de Inhibición IC50 (radical peroxilo) en

dos especies de frijol.

Frijol Partes Tratamiento ICso (mg/ml)

palo cotiledón MP 1 ,642± 0,02c

cascara CP 0,891 ± 0,01b

chaucha cotiledón MC 1 ,890± 0,02d

cascara ce 0,0078 ±[Link]

Los valores representan el promedio ± SEM Los valores en una misma columna con diferente

superíndice son estadísticamente diferentes (p<0,05).

2.5

...J 2
-
E
C)

E 1.5
:§'
·;e
o
; 1
~
~
o
- 0.5

o
MFP CFP MFC CFC

Figura 17. Comparación del coeficiente de inhibición ICso del radical peroxilo.

Con respecto a los resultados del Cuadro 9 y Figura 17 podemos

indicar que entre los frijoles existió una diferencia marcada tanto en el frijol de

palo y chaucha según BOATENG et al. (2007) indican que el total de

flavonoides en frijoles crudos fue 0,614 mgCE/g en frijol pinto y 0,845 mgCE/g
 47

en frijol negro, los altos niveles de flavonoides puede ser debido al alto

contenido de antocianinas: Asimismo HOSFIELD (2000) indica que el color de

los frijoles permite codificar los genes responsables y determinar sus funciones

bioquímicas. Por otro lado en el trabajo de TSUDA et al. (1994), estableció la

actividad antioxidante de las semillas de frijol Phaseolus vulgarís L blanco, rojo,

y negro y encontró que la cáscara de la semilla y germen de las variedades

blancas no tuvieron actividad en contraste a la cáscara de semilla rojo y negro

que tuvieron buena actividad antioxidante. De igual modo Los flavonoides

conocidos por su efectiva capacidad de capturar radicales libres como

Phaseolus vulgarís L, se encontró taninos condensados e hidrolizados de alto

peso molecular que han mostrado ser antioxidantes efectivos incluso con

mayor actividad que los polifenoles.

Cuando se determina la actividad antioxidante se recomienda que

se realice por lo menos con dos métodos diferentes tal como se ejecutó en este

trabajo (DPPH y peroxilo), al respecto BOATENG et al.(2007) indican que el

FRAP y DPPH en la evaluación de frijoles negros (kidney y pinto) comparado a

los claros (blanco) tienen una alta cantidad de compuestos fenólicos y

contribuyen al alto potencial antioxidante frente al valor de FRAP. Asimismo, el

alto contenido de taninos condensados o proantocianinas presentados en

frijoles oscuros más que en claros serían los responsables de tener una mayor

actividad antioxidante. TEOW et al. (2006) indican que para evaluar la actividad

antioxidante en alimentos y sistemas biológicos es necesario aplicar varios

métodos y los más comunes son DPPH y ABTS 2,2-azinobis (3-etilbenzo

tiazoline-6-ácido sultánico), el mecanismo de ambos es similar, ya que trabaja

 48

en la absorción espectral, sin embargo existe diferencia especialmente del

color cuando la muestra contiene antocianinas lo que afecta para determinar la

actividad antioxidante.

En otros productos se han reportado valores de coeficiente de

inhibición frente al radical peroxilo tales como la hoja de coca IC50 desde 23 a

26 ¡.Jg/ml BENITO (2009). Así como en noni maduro SULLON (2009) reportó

IC 50 186,96 ¡.Jg/ml y DIAZ (2010) en tres ecotipos de guayaba maduro IC 50

0,881 mg/ml en blanco, 1,228 mg/ml rojo y 0,576 mg/ml en rosado.

 V. CONCLUSIONES

• El mayor contenido de polifenoles totales se encontró en la cáscara del frijol

chaucha 2747,8±52,849 mg AEG/100g y el menor contenido corresponde al

cotiledón del mismo frijol24,176±0,743 g AEG/100g.

• El mayor contenido de quercetina lo presentó la cáscara de frijol chaucha

159,7±9,006 mg quercetina/100g y el menor contenido lo presentó el cotiledón

de frijol palo 2,087±0, 148 mg quercetina/100g.

• La mayor eficiencia de actividad antioxidante frente al radical DPPH y peroxilo

lo presentó la cáscara de frijol chaucha ICso 0,0319 mg/ml y IC50 0,0078 mg/ml

respectivamente.
 VI. RECOMENDACIONES

• Caracterizar los componentes polifenólicos de las cáscaras de los frijoles

Phaseolus vulgaris L. y Cajanus caján L: y otras especies nativas.

• Evaluar la actividad antioxidante y contenido de antocianinas en diferentes

genotipos coloreados de frijol que crecen en la zona del Alto Huallaga y en

diferentes extractos.

• Evaluar la actividad antioxidante y la estabilidad de las antocianinas durante el

almacenamiento de frijoles oscuros y pintos.

• Evaluar la actividad antioxidante por otros métodos FRAP, ORAC y para

establecer su grado de correlación en diferentes genotipos de frijol.

• Evaluar los componentes bioactivos en otras partes de la planta de frijol como

por ejemplo las hojas tiernas y maduras.

• Evaluar el efecto del procesamiento (cocido, tostado y otros) en el contenido de

antioxidante de algunas variedades de frijoles.

 VIl. ABSTRACT

Beans are good sources of fiber and protein; however, these

commodities are receiving attention because of their potential nutraceutical

value as sources of secondary metabolites that may help alleviate chronic and

degenerative diseases. The protective effect of beans is associated with its

content of compounds such as phytoalexins and among them quercetin, which

has been reported to show ant mutagenic properties and prevents the formation

of free radicals, which in excess are deleterious to biological molecules. In the

Upper Amazon region of Peru, specifically Tingo Maria, there are extensive

areas of underutilized soils where native beans are grown for food purposes.

However, their biological value has not been investigated fully. This study was

conducted to evaluate the antioxidant activity and quantify the quercetin content

of two native beans Cajanus caján L. (frijol palo) and Phaseolus vulgaris L.

(chaucha) that are part of the food staple of the locals. The investigation was

carried out at the Center for Research on Amazonian Natural Products (CIPNA)

and Biotechnology Laboratory of the National Agrarian University of the Jungle

(UNAS). Tingo Maria is located in the Rupa Rupa District, Leoncio Prado

Province and Huánuco Region of Peru. Quantification of total polyphenols was

performed using the Folin-Ciocalteu method, quercetin content was determined

by the method described by TOKUSOGLU et al., 2003, antioxidant activity

 52

assessed by inhibition of DPPH described by BRAND-WILLIAMS et al., 1995

and peroxyl radicals using the ABTS method. All analyses were performed

using a Genesys 6, UV spectrophotometer. Statistical analysis were carried out

using a complete randomized design and post-analysis were conducted if

P<0.05 using the Tuckey test (lnStat Graphic). Results for polyphenol content

(GAE mg/100g) were: chaucha coating 2747.8±52.8 > frijol palo coating

54.72±0.2> frijol palo cotyledon 38.49±0.5 >chaucha cotyledon 24.18±0.7. The

concentration of quercetin (mg/100g) was: chaucha coating 159.7±9.0, frijol

palo coating 4.29±0.3, chaucha cotyledon 2.71±0.2 and frijol palo cotyledon

2.09±0.1, respectively. The IC5o (mg/ml) for DPPH inhibition were: chaucha

coating 0.032, frijol palo coating 6.3, chaucha cotyledons 20.6 and frijol palo

cotyledon 21.6, respectively. The IC5o (mg/ml) for inhibition of peroxyls were:

chaucha coating 0.0078, frijol palo coating 0.89, chaucha cotyledon 1.89 and

frijol palo cotyledon 1.64, respectively.

KEYWORDS: Cajanus caján L., Phaseolus vulgaris L., quantification,

polyphenols, quercetin, antioxidant activity, Perú.

 VIII. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA

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BENITEZ, D.E. 2006. Vitaminas y oxidorreductasas antioxidantes: defensa

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IX. ANEXOS
Anexo A: Cuantificación de polifenoles totales en frijoles

Cuadro 1 O. Resultados de la curva estándar de polifenoles totales.

Concentraciones (mg AG/ml)

Repeticiones 1,5 1 0,5 0,25 0,125 0,0625

1 1,837 1,289 0,611 0,303 O, 151 0,071

2 1,774 1,213 0,613 0,303 0,144 0,077

3 1,756 1,028 0,599 0,302 0,133 0,081

Promedio 1,789 1,177 0,608 0,303 0,143 0,076

2.000

1.800

1.600 y= 1.188x+0.001
R2 :::: 0.999
E 1.400 ·
e
o
:: 1.200
IV

·~ 1.000
e
IV
e:
o
0.800
111
.e
e( 0.600

0.400

0.200

0.000 +---r---------r----.-----.------.-----.---------r-----,
0.0000 0.2000 0.4000 0.6000 0.8000 1.0000 1.2000 1.4000 1.6000
Concentración de ácido gálico (mg/ml)

Figura 18. Curva estándar para la cuantificación de polifenoles totales.

 64

Cuadro 11. Análisis de variancia del contenido de polifenoles totales en

cáscara y cotiledón de dos especies de frijol.

FV GL se CM F sig

Tratamiento 3 27,5100 9171553 2626,2 **

Error 16 55877 3492,3

Total 19 27,5658

Anexo 8: Cuantificación de quercetina en frijoles

Cuadro 12. Análisis de variancia para el contenido de quercetina.

FV GL se CM F Sig

Tratamiento 3 55,200.00 18404 301,91 ***

Error 8 487,67 60,959

Total 11 55,687.67
 65

Anexo C: Evaluación de la actividad antioxidante en frijoles (radical DPPH y

radical peroxilo).

Cuadro 13. Preparación de soluciones intermedias para evaluar la capacidad

antioxidante de los extractos de frijol por radical DPPH.

concentración Solución stock Etanol Volumen

(!Jg/ml) (!JL) (!JL) (!JL)

600 30 970 1000

2000 100 900 1000

6000 300 700 1000

20000 1000 o 1000

Cuadro 14. Análisis de varianza del extracto etanólico de las especies de frijol

y partes del grano frente al radical DPPH.

FV GL se CM F Sig

Tratamiento 3 3089,2 1029,7 4719 **

Error 32 6,983 0,2182

Total 35 3096,2
 66

Cuadro 15. Preparación de soluciones intermedias para evaluar la capacidad

antioxidante de los extractos de frijol por el radical peroxilo.

Solución Solución stock Etanol Volumen

de trabajo 400mg/ml 70% Final

(IJg/mL) (IJL) (IJL) (IJL)

120 30 970 1000

400 100 900 1000

1200 300 700 1000

4000 1000 o 1000

Cuadro 16. Análisis de varianza del extracto etanólico de las especies de frijol

y partes del grano frente al radical peroxilo.

FV GL se CM F Sig

Tratamiento 3 19,38 6,46 2195,3 **

Error 32 0,0942 0,002943

Total 35 19,474
 X. GLOSARIO

Antivitamina, compuestos que reducen el aprovechamiento de las vitaminas

de los alimentos.

Fitoalexina, se conoce con este término a todas las sustancias formadas como

metabolitos secundarios.

Flavonoide, grupo de más de 800 pigmentos vegetales amarillos,

hidrosolubles, más estables al calor y al pH que las antocianinas, sus

derivados salinos son de color mas intenso, entre los principales se encuentran

los flavonoles y flavonas.

Flavonol, (3-hidroxiflavona) C1 5H1o03, color amarillo que corresponde a una

flavona con un OH en posición 3, lo cual le confiere propiedades únicas que no

tienen las flavonas simples.

Proantocianidinas, grupo de compuestos incoloros en diversas frutas cuya

transformación química durante el procesamiento de los alimentos produce una

antocianidina coloreada, su estructura básica la compone el flavan 3,4-diol en

forma monomérica o bien como dímero o trímero.

Quercetina, C15H 1001, flavonol que se encuentra como aglucón de quercitrina,

la rutina y otros flavonoides, corresponden a la forma de la luteolina.

Sonicar, es la operación por el cual se emiten ondas magnéticas a través de

un medio de transporte que puede ser agua o ~ire y que sirve para liberar las

moléculas de oxígeno atrapados en las células.

Taninos condensados, están formados por moléculas de catequina de

Proantocianidinas y semejantes, no tienen naturaleza de ésteres hidrolizables

sino que sus núcleos están unidos por ligaduras entre átomos de C.