Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales
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CROMATROGRAFÍA
Luna Velasco – Daniel Felipe a y Reyes Gómez-Laura Valentina b
a Daluna@[Link], Química farmacéutica, 6-QUI-A (1)
b laurreyes@[Link], Química farmacéutica, 6-QUI-A (1)
Keywords AB STR AC T
Polaridad El objetivo principal de la práctica fue conocer acerca de las técnicas de cromatografía basadas en la polaridad de los
Separación compuestos, específicamente la cromatografía de Fase normal. En el laboratorio se llevaron a cabo tres tipos de
Cromatografía cromatografía con el propósito de hacer la separación de una mezcla con dos moléculas: azul de meti leno y el naranja
de metilo, y a su vez se hizo la separación de tres alcaloides presentes en la planta de la ruda. La obtención de estas
sustancias orgánicas se hizo por medio de una extracción acida (alcohólica) debido a que los alcaloides presentan un
carácter alcalino. Para las dos mezclas que se separaron en la práctica, la polaridad y el factor de retraso fueron factores
importantes para poder obtener las mejores condiciones cromatografías con el fin de obtener los resultados esperados
de separación en las distintas cromatografías y a su vez en la identificación de compuestos
1. Introducción serie de puntos de manera vertical a lo largo de la placa. Si los
componentes que se separaron de la mezcla son sustancias que tienen
La cromatografía es una técnica de separación, que se basa en la un determinado color serán claramente visibles, pero si por el
diferente distribución de los componentes de una mezcla, gracias a la contrario no son evidentes, será necesario el uso de un revelador o
presencia de una fase estacionaria y una fase móvil que fluye a través método de visualización.
de la primera. Cada componente tiene un tiempo de paso Esta cromatografía tiene aplicaciones importantes tales como:
característico a través del sistema, llamado tiempo de retención. La 1. Establecer que dos compuestos son idénticos
separación cromatográfica se logra cuando el tiempo de retención del 2. Determinar el solvente apropiado para una separación
analito difiere del resto de componentes de la muestra. cromatográfica de columna
En la cromatografía de partición, la fase estacionaria es una película 3. Para determinar el número de componentes existentes en
liquida adsorbida en la superficie de un soporte inerte, y la fase móvil
una mezcla
puede ser un líquido o un gas; en este sistema la separación depende
de la partición entre las dos fases y los efectos de adsorción entre el 4. Monitorear una separación cromatografíca de columna
soporte inerte y los componentes a separar. En la cromatografía de 5. Verificar la efectividad de una separación cromatografíca de
adsorción, la fase móvil suele ser liquida y la fase estacionaria es columna
sólida, la separación depende de la adsorción selectiva de cada
componente de la mezcla en la superficie del solido que los retiene. La mayor ventaja de esta técnica es que las cantidades necesarias para
(B,S Furniss et al, 1989) realizar el estudio son mínimas, y no se desperdicia el material. (Pavia
Varios tipos de cromatografía son posibles, dependiendo de la et al 1998)
naturaleza de las fases involucradas: solido-liquido, liquido-líquido y
gas-liquido.
• CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA
Es una técnica muy importante para la rápida separación de pequeñas
cantidades de una muestra. Se considera que es la misma
cromatografía en columna, pero a la inversa, ya que el eluyente
desplaza las muestras hacia arriba por acción capilar. Se basa en la
aplicación de la fase estacionaria a un soporte inerte, y la muestra se
asigna como un pequeño punto cerca de la base de dicha placa. Si la
mezcla que se detectó originalmente en la placa se separó, habrá una Imagen 1: muestra de cromatográfica en capa fina (TLC)
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• CROMATOGRAFÍA PREPARATIVA FASES DE LA CROMATOGRAFÍA:
En cromatografía los componentes a separar son distribuidos entre
Esta técnica es muy parecida a la de cromatografía de capa fina, pero dos fases, una que va a permanecer estacionaria y la otra que se va ir
con la particularidad de que las placas donde se pone la mezcla a moviendo en una dirección determinada.
estudiar son mucho más grandes, y necesitan una capa gruesa de • Fase móvil: la fase móvil puede ser un gas, un líquido o un
adsorbente, de esta manera los componentes separados se pueden fluido supercrítico, en la que va disuelta la muestra.
recuperar individualmente. Para realizar dicho proceso, en lugar de • Fase estacionaria: la fase estacionaria o inmiscible con la
aplicar un punto, la mezcla que se va a separar se aplica como una
muestra, se mantiene fija sobre una columna o sobre una
línea aproximadamente a 1 cm del fondo de la pla ca. Después de
realizar todo el procedimiento, se pueden observar las bandas y el superficie sólida y puede ser un sólido o un líquido.
adsorbente contenido en dichas bandas se raspa de la placa y se extrae
con solvente para eliminar el material adsorbido. La filtración elimina Existen diferentes tipos de cromatografía, pero todas se basan en el
el adsorbente y la evaporación del solvente proporciona el mismo fenómeno: permitir que las sustancias que forman una mezcla
componente final que se ha recuperado de la mezcla. entren en contacto con dos fases (estacionaria y móvil). Una de las
fases es la estática (no se mueve) y tenderá a retener las sustancias en
mayor o menor grado, la otra fase que es la fase móvil tenderá a
arrastrarlas. Cada sustancia química tiene distinta tendencia a ser
retenida y arrastrada.
Todos los sólidos pulverizados tienen la capacidad de adsorber en
mayor o menor grado a otras sustancias sobre su superficie, y a su vez
todas las sustancias pueden ser adsorbidas, unas con más facilidad
que otras, este fenómeno de adsorción selectiva es el principio
fundamental de la cromatografía. (Fundamentos de cromatografia,
Imagen 2: placa preparativa con banda de muestra s.f.)
• CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA Eluyentes más comunes
Éter de petróleo Cloroformo
Es una técnica basada tanto en la adsorción como en la solubilidad.
La característica principal para el sólido que va a ser utilizado como n-hexano Cloruro de metilo
fase estacionaria, es que no se debe disolver en la fase liquida Ciclohexano Acetato de etilo
asociada, ya que de esta manera no se daría lugar a la retención de los
componentes que se quieren separar. Los compuestos a separar se Tolueno Acetato
introducen en la parte superior de la columna que esta rellena con la Dietil-eter Iso-propanol
fase estacionaria, hay un flujo continuo del eluyente a través de la
Etanol Metanol
columna, que permite que los eluatos (solutos) sean arrastrados. A
medida que los componentes se separan, se empiezan a formar bandas Ácido acético
móviles, que indican la presencia de cada componente en la mezcla
evaluada, dichas bandas son las que se recolectan para obtener el Tabla 1: Eluyentes más comunes para cromatografía
resultado final. (Pavia et al 1998).
El tiempo que se necesita para hacer fluir un compuesto por la Para elegir el eluyente correcto, se hace primero una cromatografía
columna, se conoce con el nombre de tiempo de retención. Este de capa fina con la muestra que se quiere separar aplicando los
tiempo varía, siendo característico de cada compuesto en unas diferentes eluyentes disponibles, al final se evalúa el RF para
condiciones cromatográficas determinadas, que varían según el encontrar cual es la mejor fase móvil para realizar la separación.
absorbente usado, el disolvente, la presión, el diámetro que tenga la Cromatografía basada en la polaridad:
columna utilizada, entre otras.
Fase móvil
Tipo de Fase
cromatografía estacionaria
Fase normal No polar Polar
Fase reversa Polar No polar
Tabla 2: Cromatografía y sus fases relacionadas con la
polaridad
Imagen 3: funcionamiento de una columna cromatográfica a lo La cromatografía basada en la polaridad de los compuestos es la más
largo de la elución común, y existen dos modos: la cromatografía de Fase normal
(Separación de analitos polares) y de Fase reversa (Separación de
analitos no polares).
La cromatografía basada en la polaridad tiene como teoría utilizar un
eluyente y un absorbente que posean polaridades opuestas, ya que, de
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acuerdo con la polaridad, compuestos de polaridades similares se Ejemplo:
atraen y compuestos de polaridades opuestas se repelen. (Roman, Componente 1: Rf = a / D
2013) Componente 2: Rf = b / D
De acuerdo con esto, un solvente apolar como el hexano arrastraría Componente 3: Rf = c / D
con mayor facilidad compuestos apolares en la muestra, como Por medio de este cálculo se pude saber el orden en el que los
cadenas alifáticas o aromáticas. Por otro lado, un solvente polar como compuestas van a salir en una cromatografía en columna dependiendo
el agua o a lcoholes, atraerán con mayor fuerza muestras polares, a su interacción con la fase móvil y la estacionaria. El orden en el que
como ácidos o sales. aparezca cada compuesto se debe a su polaridad, las manchas que se
De igual forma, una fase estacionaria apolar, atraerá encuentran en la parte más baja serán los compuestos con mayor
mayoritariamente compuestos apolares y una Fase estacionaria polar, polaridad y los que se encuentran en la parte de arriba tendrán una
como la silica, atraerá mayoritariamente compuestos polares. menor polaridad, es por eso que en una cromatografía de columna las
Absorbentes más comunes: fracciones menos polares, que son por lo general las que se retienen
• Gel de sílice (80% más utilizado) poco o nada en el absorbente, serán las primeras en salir de la
• Oxido de Aluminio o Alúmina columna, y las sustancias más polares, quedan retenidas por más
tiempo en el absorbente y saldrán de ultimas. (Fundamentos de
• Celulosa (Nativa o microcristalina)
cromatografia, s.f.)
• Poliamidas
Para la selección del absorbente hay que tener en cuenta los siguientes
aspectos:
✓ Polaridad
✓ Tamaño de partícula
✓ Diámetro
✓ Área superficial
✓ Homogeneidad
✓ Pureza
Reveladores más comunes para cromatografía en capa fina:
Los reveladores se utilizan para ver muestras incoloras que
quedaron en la placa, los reveladores más utilizados son:
Luz UV: si la sustancia absorbe luz ultravioleta, se puede usar una
fase estacionaria impregnada con un indicador fluorescente (F254 ó
F366), el subíndice indica la longitud de onda de excitación del Imagen 4: orden de elución de acuerdo a la polaridad de los grupos
indicador utilizado. funcionales
Yodo: Introducir la placa en vapores de yodo. Ruda
H2 SO4 : Se rocía una solución de (agua/H2SO4) 1:1 y de inmediato
calentar con un mechero hasta carbonizar los compuestos. Es una planta herbácea del genero Ruta, se caracteriza por que sus
hojas están divididas por segmentos muy estrechos, su color es verde
RF O FACTOR DE RETRASO pálido y el olor es muy fuerte debido a que en cada segmento se
encuentran glándulas secretoras de esencias. Dentro de la ruda se
El factor de retraso es aquel que mide la movilidad relativa de cada pueden encontrar sustancias tales como: resina, goma, materias
componente con respecto al máximo posible, la distancia recorrida tánicas, y también contiene alcaloides, siendo los más activos los
por el frente de fase móvil. derivados de la acridona. (Lombardo, 2009)
D. Frente de eluyente Alcaloides en la Ruda:
Se llaman alcaloides a aquellos metabolitos secundarios de las plantas
que son sintetizados, generalmente, a partir de aminoácidos. Los
alcaloides son moléculas de origen vegetal, aunque existen proto
(a,b,c) . Muestra alcaloides de origen animal. Los alcaloides se ca racterizan por su
estructura molecular compleja a base de átomos de carbón, hidrógeno,
nitrógeno y oxígeno. Todos los alcaloides son de naturaleza alcalina
Punto de aplicación de ahí su nombre. (Ecured, 2018)
La ruda: Ruta graveolens, contiene diversos metabolitos secundarios
El Rf se calcula por medio de la siguiente formula: como son:
(𝑎)𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 • Quinolona
𝑅𝑓 =
(𝐷)𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑙 𝑒𝑙𝑢𝑦𝑒𝑛𝑡𝑒 • Acridona
• Dictaminina
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• Arborinina una recoleccion en tubos de ensayo de los componentes que se
• Fumarocumarinas diferenciaban por su color particular.
• Flavonoides
• Cumarinas
• Graveolina
• Soforinas
Extracción de metabolitos secundarios:
Para la extracción de los alcaloides hay que tener en cuenta que los
vegetales contienen generalmente cantidades apreciables de grasa que
pueden impedir el desarrollo de los procesos de extracción, debido a
que producen emulsiones, por lo tanto, es útil hacer un desengrase de
la planta con solventes como hexano o éter de petróleo. Para esto el
desengrasado se puede hacer por soxhlet con un solvente orgánico
apolar para poder extraer la parte lipídica del material vegetal.
(Condor, 2008)
Imagen 6: procedimiento de la tecnica de cromatografia en
Por otro lado, hay que tener en cuenta que los alcaloides son columna
compuestos de carácter básico, su solubilidad en los diferentes
solventes varía en función del pH. Posteriormente se realizó la cromatografía en columna, utilizando
como fase móvil diclorometano, y manteniendo la misma fase
• En forma de base, son solubles en solventes orgánicos no estacionaria, después de recolectar las muestras y adicionarlas a una
polares como benceno, éter etílico, cloroformo, placa fina, se llevó a una lámpara UV para que de esta manera se
diclorometano y acetato de etilo. lograran detectar los alcaloides que no se evidenciaban a simple vista.
• En forma de sales, son solubles en solventes polares como Para la cromatografía preparativa se realiza el mismo procedimiento
el agua, soluciones ácidas e hidroalcohólicas. que para cromatografía de capa fina, con la diferencia de que en este
caso la placa es mucho mas grande.
2. SECCIÓN EXPERIMENTAL
3. Resultados y discusión
Para la primera practica de cromatografía se realizó la técnica de capa
fina y columna con dos muestras: azul de metileno y naranja de
metilo.
En la cromatografía de capa fina se hizo uso de tres solventes, entre
los cuales se encontraba: hexano, diclorometano y acetato de etilo. En
las tres placas se adiciono una pequeña cantidad de la muestra y se
observó con cual eluyente la muestra corría mejor.
Imagen 5: Demostraciòn de la cromatografia en capa fina
Para el procedimiento de cromatografia en columna, se preparo una Foto 1: Cromatografía en columna con la mezcla de azul de
“papilla” la cual estaba formada de silica (fase estacionaria) y etanol metileno y naranja de metilo en etanol
(fase movil), esta se introdujo en la columna que contenia un poco del
solvente con el fin de evitar la formacion de burbujas. Posteriormente, Para la cromatografía en columna se escogió como mejor solvente el
se abrio la llave de la columna cromatografica para que se liberara la etanol ya que es muy polar, debido a que tiene un grupo hidroxilo,
mayoria de etanol, (siempre teniendo en cuenta que la silica nunca se que puede generar mejores interacciones con el analito o la muestra a
puede dejar secar), y ya con estas condiciones se hizo la adicion de estudiar.
muestra y empezo el proceso de separaciòn. Finalmente, ser realizo
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Al adicionar un compuesto orgánico a la fase estacionaria, este se la que el naranja de metilo a pesar de ser mas polar, es liberado en
adherirá a las partículas de la silica gra cias a las fuerzas primer lugar es porque la fase movil tambien influye enormemente en
intermoleculares que se generan. Los compuestos no polares se unen el proceso de separacion de los componentes buscados.
a la silica usando solo las fuerzas de Van der Waals. Por el contrario,
si los compuestos son polares, se generarán fuerzas tipo dipolo- Como en la practica de laboratorio se agrego agua adicionalmente del
dipolo, las cuales implican una relación directa y mucho más fuerte. etanol, esto hizo que la fase movil en terminos generales asumiera un
Debido a que las dos muestras estudiadas no tienden a hacer carácter mucho mas polar. Los disolventes polares disuelven los
demasiado polares, se dice que están involucradas con la silica a compuestos polares más eficazmente que los disolventes no polares,
través de las fuerzas de Van der Waals ya que son débiles, y su unión por esta razon hubo tanta interaccion entre la fase movil y el naranja
solo se hace fuerte debido a que tienen pesos moleculares de metilo, haciendo que este fluyera mas rapido por la silica y se
extremadamente altos. recolectara antes que el azul de metileno. Para un mismo compuesto,
un aumento en la polaridad de la fase móvil hace que se desplace con
Estructura del azul de metileno (C16H 18N3ClS) más facilidad por la fase estacionaria. Las moléculas de la muestra
(soluto) se adsorben a los centros polares de la fase estacionaria y a
medida que se produce la elución, van siendo desplazadas por las
moléculas de dicho disolvente que constituye la fase móvil. La
retención del soluto se puede justificar por la competencia que se
establece entre ese soluto y el eluyente para llegar a adsorberse a los
centros polares de la silica. (Velez, s.f)
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA
Los solventes con los que se hicieron las placas fueron:
diclorometano, hexano: acetato de etilo- 9:1, hexano: acetato de etilo-
Estructura del naranja de metilo (C14H 14N3NaO3S) 5:5, para escoger el mejor solvente fue necesario utilizar un revelador
en este caso la luz UV, debido a que la mayoría de los alcaloides son
casi siempre incoloros, entonces para lograr ver cuánto corrió la
muestra se pasaron las placas a una cámara de luz UV y se evaluaron
en las longitudes de onda de 254 y 366 nm, y se encontró que el
solvente que corrió mejor la muestra fue el diclorometano. (Rojas,
2009)
Hexano: acetato de etilo- 9:1: Tuvo un Rf de 0,62, y en la cámara de
luz UV se observó que el solvente logro correr la muestra y separar
dos componentes, también el solvente logro que la primera mancha
tuviera una distancia no muy grande a comparación del
diclorometano, pero sí hizo correr bien dos sustancias.
Diclorometano: para el caso del diclorometano su Rf fue de 0,68. En
la cámara de luz UV se observó que el solvente si hizo correr la
Los grupos funcionales que estan señalados con lineas rojas son muestra, y a su vez se encontraron manchas con distintos colores a lo
aquellos que le dan la polaridad a toda la molecula, en el naranja de largo de la placa.
metilo el grupo SO3 al tener doble enlace a O tanto arriba como abajo
Hexano: acetato de etilo- 5:5: Tuvo un Rf de 0,89. En la cámara de
hace que las cargas se anulen, pero el tercer O como es un atomo muy
luz UV se observó como este solvente hizo correr mejor la muestra
electronegativo hace que la molecula sea màs polar. El azul de
en comparación a los otros 2 solventes.
metileno es menos polar debido a que el numero de carbonos con el
que cuenta la molecula es mayor y los grupos funcionales no van a
Todos los solventes corrieron la muestra y la separaron. Para estecaso
interactuar tan fuerte con otras especies. Por lo tanto el azul de se tenían tres sustancias con distintas polaridades, por lo tanto, el
metileno es mas polar que el naranja de metilo. (Pavia et al 1998).
hexano no podría ser la mejor opción debido a que este es útil en el
caso que se necesite separar un compuesto que no sea muy polar. En
La separación se basa en la cantidad de equilibrios que experimentan
cambio, para el caso del diclorometano es un solvente que presenta
los solutos entre las fases estacionaria y movil. Las sustancias menos
una polaridad, lo cual es útil para que exista una buena separación de
polares avanzan más rápido que las sustancias más polares ya que
sustancias y una buena velocidad de salida en la columna. Como en
estas no quedan retenidas con la silica que es pola r. Pero no solo
influye la polaridad del analito en relacion con la silica, sino tambien este caso lo que se va a separar son alcaloides y los compuestos
orgánicos son apolares entonces el solvente correrá la muestra, pero
la interaccion que hay con el eluyente que se esta utilizando. (Pavia
se demorara mucho, en cambio el diclorometano que es menos polar
et al 1998).
tendrá una mejor afinidad con los compuestos orgánicos y los podrá
Analizando lo anterior se supondria que el azul de metileno tendria
separar mejor.
que bajar mas ra pido que el naranja de metilo, ya que es menos polar
y no tiene tanto tiempo de retencion con la silica a lo largo de la
columna, pero esto no sucede de esta manera. La razon principal por
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Gracias a esta cromatografía de placa se pudo concluir que el solvente • En cromatografía de columna las sustancias que primero
más apto para la separación de los alcaloides en la cromatografía de salen de la columna son las sustancias apolares y las ultimas
capa fina era el diclorometano. en salir son las sustancias con una mayor polaridad.
Nota: Los Cálculos mencionados anteriormente están reportados • En cromatografía de capa fina las manchas que están más
como anexos. arriba o cerca al frente del eluyente son las sustancias menos
polares y las manchas que se encuentran en la parte inferior
CROMATOGRAFIA PREPARATIVA pertenecen a sustancias con una polaridad alta.
• El revelador de luz UV permite identificar los alcaloides,
pero esto depende de su estructura, naturaleza, tipo y
posición de los sustituyentes. Hay grupos de alcaloides que
careciendo de cromóforos, no absorben en esta región, como
es el caso de la mayoría de los alcaloides derivados de
aminoácidos alifáticos y algunos derivados del metabolismo
terpénico. En forma general, los alcaloides que tienen
átomos con electrones solitarios, dobles o triples enlaces
aislados (grupos cromóforos) absorben con cierta intensidad
en la región de 200 a 280 nm.
REFERENCIAS
Condor, C. (2008). ALCALOIDES Y COMPUESTOS
4. CONCLUSIONES NITROGENADOS. Universidad de antioquia, 3-19.
• Hay una relación directamente proporcional entre la Ecured. (16 de octubre de 2018). Alcaloide. Obtenido de
polaridad y las fuerzas intermoleculares, ya que entre más [Link]
polar sea la molécula, tendera a formar dipolos u otro tipo
Ferrer-Serrano, A. (2016). Separation and Classification of Alkaloids
de interacción fuertes con otras especies
Present in the Leaves and Flowers of the Specie Spilanthes
• La retención de un soluto depende de la polaridad del
urens Jacq. Scielo, 5-10.
compuesto a eluir, de la naturaleza tanto del adsorbente
como del eluyente Fundamentos de cromatografia. (s.f.). Obtenido de
• El número de moléculas que permanecen adsorbidas en las [Link]
partículas sólidas depende tanto de la molécula particular
involucrada como del poder de disolución del disolvente Hewitt, P. G. (2004). Física conceptual (9 Ed ed.). México: Pearson.
con el que el adsorbente debe competir.
[Link], J. (2004). Química Orgánica. Pearson Educación.
• Para cualquier material adsorbido, se puede prever un
equilibrio de distribución entre el material adsorbente y el Montgomery, D. (2002). diseño y análisis de experimentos (segunda ed.).
solvente México: Limusa Wiley.
• Un alcaloide es un metabolito secundario que está presente
en las plantas. Las aminas son básicas y debido a su Rojas, L. C. (2009). Preliminary phytochemical analysis of Cupatá
alcalinidad algunas aminas complejas de origen natural se (Strychnos schultesiana. Scielo, 166-169.
les denomina alcaloides por lo tanto los alcaloides tienen un
Roman, E. (29 de Noviembre de 2013). Cromatografía líquida: HPLC –
carácter alcalino, y por lo general son sintetizados de forma
High Performance Liquid Chromatography. Obtenido de
natural a partir de los aminoácidos.
[Link]
• Se concluyó que el mejor solvente para la separación de los [Link]
alcaloides era el diclorometano quien presentaba una mayor
polaridad y a su vez logro arrastrar a una mayor distancia la Serway, R. A., & Jewett, J. W. (2005). Física para ciencias e ingeniería
muestra y separar los alcaloides en la cromatografía de capa (Vol. 6). Thomson.
fina y de columna.
• El valor del Rf es inverso a la polaridad, lo que quiere decir Steel, R., & Torrie, J. (1985). Bioestadística: Principios y procedimientos
(Primera ed.). Bogotá: McGraw-Hill.
que, si el valor del Rf es alto, la polaridad del componente
es baja y si el Rf es un valor pequeño, la polaridad del
compuesto es muy alta.
6
Universidad de Ciencias Ambientales y Aplicadas
Velez, K (s.f). ORGANICA PRACTICA 5. CROMATOGRAFIA DE
CAPA FINA Y COLUMNA (Universidad Nacional de Colombia sede
Medellín)
MATERIAL COMPLEMENTARIO