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ELECTROFORESIS EN ADN HUMANO
Meliza Pérez, Andrea Peñaloza, Lina
Estudiante de Biología1
Grupo D
07 de Octubre 2019
Laboratorio de genética, Facultad de ciencias Básicas, Departamento de biología,
Universidad de Pamplona, Pamplona (Norte de Santander) Colombia.
Objetivos
Conocer los principios básicos de la electroforesis horizontal en geles de agarosa y aplicarlo para
la separación de DNA humano
RESUMEN
En la búsqueda por separar moléculas, se implementó la técnica de electroforesis. Este laboratorio brindó
las condiciones necesarias para realizar una separación de moléculas del DNA. Con la disposición de los
materiales, reactivos y el acompañamiento de la profesora se procedió a preparar gel de agarosa para
servir el ADN para la electroforesis. Se dispuso de los pocillos del gel para introducir la prueba control
en el primer pocillo del gel y ADN con marcador en los pocillos siguientes. Se le aplicó la corriente
eléctrica adecuada (90 voltios, por existir 20 cm entre cada electrodo) y se esperó por 1 hora. Al finalizar
la migración este gel se llevó al transiluminador en el cuarto oscuro para revelar con luz ultravioleta, la
velocidad de migración y así poder estimar el tamaño de los fragmentos de ADN.
PALABRAS CLAVE: Electroforesis en gel, separación de moléculas, densidad DNA, migración DNA,
gel agarosa.
Abstract
In the search to separate molecules, the electrophoresis technique was implemented. This laboratory
provided the necessary conditions to perform a separation of DNA molecules. With the disposition of
the materials, reagents and the accompaniment of the teacher, an agarose gel was prepared to serve the
DNA for electrophoresis. The gel wells were arranged to introduce the control test into the first well of
the gel and labeled DNA in the following wells. The appropriate electric current was applied (90 volts,
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because there is 20 cm between each electrode) and expected for 1 hour. At the end of the migration this
gel was taken to the transilluminator in the dark room to reveal with ultraviolet light, the speed of
migration and thus be able to estimate the size of the DNA fragments.
Keywords: Nucleic acids, DNA, electrophoresis, Agarose.
Introducción cancerígeno. Existen muchos tipos de
electroforesis que se engloban en dos categorías
La electroforesis es utilizada para demostrar la fundamentales:
migración de una molécula influencia, ya sea de - Electroforesis de frente móvil
proteínas o ácidos nucleicos cargada bajo la - Electroforesis de zona
influencia de un campo eléctrico. Muchas Actualmente, sólo se utiliza la electroforesis de
moléculas importantes biológicamente zona, en la cual la muestra se desplaza sobre un
(aminoácidos, péptidos, proteínas, nucleótidos,
soporte sólido, como papel de filtro, celulosa o
ácidos nucleicos…) poseen unos grupos
ionizables que pueden ser cationes o aniones. gel (agarosa, acrilamida…) y los componentes
Estas partes cargadas son las que se van a de la muestra migran en forma de pequeñas
separar dependiendo de su carga al momento de bandas, también llamadas zonas. Los materiales
aplicar un voltaje por medio de los electrodos, más comunes para separar moléculas de ácidos
la electroforesis de ácidos nucleicos se lleva a nucleicos son polímeros como la poliacrilamida
cabo en geles de agarosa y es considerada uno o la agarosa. Es importante la utilización de
de los métodos más sencillos y
marcadores de tamaño conocido porque nos
eficientes para separar fragmentos de
ADN, el cual una de sus características es permitirán calcular los pesos moleculares de las
que tienen carga negativa gracias a su grupo muestras de DNA problema.
fosfato y una vez que es expuesto a un campo
eléctrico y en una solución buffer, migrará En el caso de los geles de agarosa, se le añade
hacia el lado positivo. Después de realizada la bromuro de etidio, sustancia que se intercala
electroforesis los resultados podrán observarse entre las bases del DNA y es fluorescente
utilizando la fluorescencia. El bromuro de cuando se ilumina con luz ultravioleta. Tras la
etidio o el SYBR Safe son los colorantes más electroforesis, se visualiza el gel con una
utilizados ya que se intercalan en la base lámpara de luz UV, y se verán las bandas
de los ácidos nucleicos y emiten
fluorescencia. el uso de este compuesto debe correspondientes a las muestras de DNA
ser manejado con mucho cuidado y con el aplicado y los marcadores de peso molecular.
cumplimiento riguroso de los protocolos El DNA problema que se va a analizar
de bioseguridad de los laboratorios debido mediante electroforesis en gel de agarosa en
a que se considera un agente altamente esta práctica es DNA plasmídico. Los
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plásmidos son moléculas de DNA determinada célula bacteriana puede no tener
extracromosómico, circular y de pequeño ningún plásmido o puede albergar un número
tamaño (entre dos y varios cientos de kilobases) variable de los mismos. Algunas clases de
que se encuentran en muchas especies plásmidos poseen la propiedad conocida como
bacterianas. Se caracterizan porque se replican “replicación relajada”, esto es, están presentes
de manera independiente del DNA en forma de muchas copias por célula, lo que
cromosómico bacteriano, tienen su propio facilita enormemente su aislamiento y
origen de replicación, y no son necesarios para purificación.
la viabilidad general de la célula, pero pueden
contener genes que contribuyan a la
supervivencia en condiciones especiales, como
los que confieren resistencia a antibióticos. Una
METODOLOGIA
MATERIAL: Micropipeta graduable P20, pipeta 10 ml, estufa, cámara de electroforesis, fuente de
poder, peinilla, cabina LUV.
REACTIVOS: Buffer TBE 1 X Agua desionizada Agarosa DNA Buffer de carga:
METODO:
Electroforesis sobre el gel de agarosa
1. Coloque el soporte de gel. Sirva 40 mL de agarosa en el caso del sistema de preparación de geles.
Coloque la peinilla después de servir la agarosa. Si se dispone, utilice preferiblemente los
aditamentos para preparación de los geles que vienen con la cámara de electroforesis.
2. Espere 20 minutos para la solidificación de la agarosa.
3. Agregue 5 mL TBE 1X sobre el gel en los sitios donde esta insertada la peinilla
4. Retire cuidadosamente la peinilla.
5. Agregue buffer a la cámara, TAE o TBE 1 X, hasta cubrir completamente el gel 1 o 2 mm.
6. Agregue a las muestras de DNA ¼ de buffer de carga.
7. Siembre 10 µl de cada muestra de DNA en pozos separados del gel, utilice la micropipeta P20
con las puntas correspondientes. Una de las muestras de DNA corresponde a marcador de ADN
con buffer de carga.
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8. Tape la cámara. Conectar la cámara a la fuente. Encienda la fuente. Coloque en voltaje constante.
Colocar en 10 voltios/cm, según la distancia entre los electrodos de la cámara. Iniciar la
separación o corrida.
9. Deje la electroforesis 30 minutos. Pare la corrida. Apague la fuente.
[Link] el gel en una solución 2 µg/mL de bromuro de etidio, deje por 20 minutos y observe el
gel con una lámpara de luz ultravioleta (LUV). Tenga las precauciones de trabajar con bromuro
de etidio y LUV, es decir, utilice guantes y proteja los ojos con lentes especiales
DISCUSIÓN
Como su nombre lo indica, en la electroforesis en gel participa un gel: un bloque de material similar a
la gelatina. Los geles para separar ADN suelen estar hechos de un polisacárido llamado agarosa, que se
consigue como hojuelas secas pulverizadas. Cuando la agarosa se calienta en una solución
amortiguadora y deja enfriar, se forma un gel sólido ligeramente blando. A nivel molecular, el gel es
una matriz de moléculas de agarosa que se mantienen unidas por puentes de hidrógeno y que forman
pequeños poros.
Una vez que los fragmentos se han separado, podemos examinar el gel y saber el tamaño de las bandas
que se encuentran en él. Cuando un gel se tiñe con un pigmento que se une al ADN y se coloca bajo luz
UV, los fragmentos de ADN brillarán, lo cual nos permite ver el ADN presente en distintos lugares a lo
largo del gel.
Al comparar una banda en una muestra con el marcador de peso molecular, podemos determinar su
tamaño aproximado. Por ejemplo, la banda brillante del gel anterior tiene un tamaño aproximado
de 1000 pares de bases (pb). Imagen
El desplazamiento de los ácidos nucleicos se debe a la carga eléctrica tomada por estos según el pH
presente en la solución del gel. Los geles (poliacrilamida o la agarosa) se colocan en la cubeta de
electroforesis, sumergidos en un tampón de pH alrededor de 8. De esta forma, las moléculas de ADN
sometidas a electroforesis se desplazarán al
polo positivo ya que a pH superiores a 5 poseen carga negativa.
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CONCLUSIÓN.
La electroforesis en el gel de agarosa es una de las técnicas más adecuadas para la visualización
de ADN ya que además de ser de fácil preparación, el colorante usado permitió de manera
satisfactoria la observación al someterse a luz Ultravioleta ya que estos se insertan entre las
pares de bases que conforman el ácido nucleico.
Una preparación inadecuada del gel de agarosa, o una mala extracción de en caso de la práctica
ADN hace que la resolución de las bandas sea más difícil de observar y analizar.
ANEXOS
- Que factores afectan la velocidad de migración del ADN.
Los extremos del fragmento de DNA tienen más facilidad para moverse y cambiar de dirección que la
parte central, de modo que la estructura lineal puede combarse, adoptando forma de horquilla, por lo
que puede “engancharse” en las fibras del gel, dificultando su migración. Este fenómeno es muy acusado
en fragmentos de tamaño intermedio, y es la causa del fenómeno conocido como inversión de banda,
por la cual la estructura del tamaño intermedio migra más lentamente que otros mayores. Este
fenómeno es más acusado a elevadas concentraciones de agarosa y bajos voltajes.
- Por qué se utiliza luz UV para visualizar el ADN.
La luz ultravioleta ( Luz UV) cuando se expone a la luz UV, los electrones en el anillo aromático
de la molécula de etidio se activan, lo que conduce a la liberación de energía (luz) como el retorno
electrones a estado fundamental para la lectura y visualización del DNA.
- Cómo funciona el bromuro de etidio en la visualización de ácidos nucleicos.
Como un agente intercalante usado comúnmente como aclarador de ácidos nucleicos. Este efecto
es debido al aumento de la hidrofobia del medio, y no a la rigidificación del anillo bencénico, no
estando éste entre pares de bases del ADN. Como el bromuro de etidio se intercala en el ADN,
esta sustancia tiene un poderoso efecto mutágeno y, posiblemente puede
ser cancerígeno o teratógeno.
BIBLIOGRAFIA
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