Universidad Camilo José Cela

Programa de Doctorado en Medicina Genómica

BIOPSIA LÍQUIDA:
APLICACIÓN DE MÉTODOS ÓPTICOS Y METABÓLICOS PARA LA

DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS ,

PROTEÍNAS Y CÉLULAS EN SANGRE PERIFÉRICA DE PACIENTES CON

CÁNCER

Tesis Doctoral

EDUARDO GARCÍA-RICO FERNÁNDEZ

Directores

Francisco López Muñoz

Ramón Alvarez Puebla

MADRID, 2017
¿Por qué cada uno de los griegos podía erigirse en representante de su tiempo, y
no así el hombre moderno?

Porque al primero le dio forma la naturaleza, que todo lo une, y al segundo el

entendimiento, que todo lo divide

Friedrich Schiller

i
 A los que ya no están, pero nos hacen ser. “Mano fría que aprietas mi corazón”

A Manuel, Eduardo, Manuel, Marina, Miguel, Adrián y Patricia

A Violeta

ii
 AGRADECIMIENTOS

“NO FUERCES LA TRAVESÍA. AS PREFERIBLE QUE DURE MUCHOS AÑOS, QUE SEAS
VIEJO CUANDO FONDEES EN LA ISLA, RICO DE TODO LO QUE HABRÁS GANADO
HACIENDO EL CAMINO. ÍTACA TE HA DADO EL BELLO VIAJE, SIN ELLA NI HABRÍAS
SALIDO. Y SI LA ENCUENTRAS POBRE, NO ES QUE TE HAYA ENGAÑADO. SABIO COMO
TE HABRÁS HECHO, SABRÁS LO QUE SIGNIFICAN LAS ÍTACAS”

ESTA ES UNA TESIS DOCTORAL A SOTAVENTO. YA SÉ ALGO DE LA MAR Y DE LOS

VIENTOS. HE APRENDIDO ALGO DE ESTA SINGLADURA COMPARTIDA CADA DÍA,
COMPUESTA DE LUCHAS, SUEÑOS, FRACASOS Y, SOLO A VECES, ÉXITOS.

SEGÚN CLAUDE BERNÁRD “EL ARTE SOY YO PERO LA CIENCIA SOMOS NOSOTROS”. MI
AGRADECIMIENTO A TODOS LOS QUE HAN FORMADO Y FORMAN MI “PERSONAL”
NOSOTROS. PERO LA CIENCIA TAMBIÉN REQUIERE UN “ELLOS”. SON AQUELLAS
PERSONAS E INSTITUCIONES QUE LE DAN CONFIANZA Y SOPORTE. EN MI CASO, SE
TRATA DEL GRUPO HM Y LAS INSTITUCIONES MENCIONADAS EN LOS ARTÍCULOS AQUÍ
REUNIDOS. PERO ABARCANDO EL YO, EL NOSOTROS Y EL ELLOS, ESTÁIS MIS
COMPAÑEROS DE TRAVESÍA. VOSOTROS SABÉIS QUIENES SOIS, PUES COMPARTIMOS
ÍTACA.

iii
 ÍNDICE DE ACRÓNIMOS
A
F
ATP
Adenosin Triphosphate, 22, 128 FDG
Fluor Desoxi Glucosa, 18

B FISH
Fluorescence In Situ Hybridization, 6, 8,
B HLH ZL 133, 138
Basic Helyx Loop Helyx Zipper Leucine, 62

G
C
GFP
cfDNA Green Fluorescent Protein, 63
Circulating Free DNA, 14
CTCs L
Circulating Tumor Cells, 12, 14, 22, 23, 24,
61, 90, 91, 92, 93, 97, 99, 107, 109, 114, LV

115, 131, 132, 133, 135, 137 Latent Variable, 38, 39, 46, 52, 127

ctDNA
Circulating Tumor DNA, 12, 26 N
nt
D Nucleotide, 27, 28, 29, 31, 32, 33, 34, 35, 37,

DAQ 38, 40, 41, 43, 44, 45, 48, 51, 52, 53

Date Adquisition, 105

DG O
Deoxiglucosa, 128, 212
OXPHOS
DTC
Fsforilación oxidativa, 18
Diseminated Tumor Cells, 12

P
E
PBMC
ECOG
Peripheral Blood Mononuclear Cells, 22, 80,
Eastern Cooperative Oncology Group, 11
99, 108, 118, 119, 120, 121, 124, 137,
EGFR
138
Epithelial Growth Factor Receptor, 9, 11,
PCR
90, 111, 115, 150
Polimerase Chain Reaction, xii, xiii, xiv, 9,
EMT
11, 26, 55, 92, 102, 133, 134, 138, 150
Transición Epitelial-Mesenquimal, 5, 12, 63,
PDMS
101, 115
Polidimetilsiloxano, 103, 104

iv
PET SSCP
Positron Emission Tomography, 18, 19, 91, Single Strand Conformational
115, 127, 148 Polimorphism, 28, 41, 42, 44, 45, 136
PLS-DA ssDNA
Partial Least Squares Discriminant Single Strand DNA, 27, 28, 30, 32, 33, 34,
Analysis, 23, 28, 37, 38, 40, 46, 47, 50, 35, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 46, 47, 48,
52, 135 50, 51, 52, 53

S W
SERS WT
Surface Enhanced Raman Spectroscopy, xii, Wild Type, 49, 51, 52
xiv, 15, 16, 17, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29,
30, 33, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 44, 45, Y
46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 59, 60, 63,
YFP
64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 74, 79,
Yellow Fluorescent Protein, 63
81, 110, 135, 136, 145, 164

v
 ÍNDICE DE TABLAS

TABLA 1: TIPOS DE BIOMARCADORES. .................................................................... 12

TABLA 2: VENTAJAS DE LA BIOPSIA LÍQUIDA .......................................................... 14

TABLA 3: DEFINICIONES ......................................................................................... 16

TABLA 4: SECUENCIAS DE BASES DE ADN DE UNA SOLA CADENA DE 20 Y 141 NT

(TABLA S1) .................................................................................................... 36

TABLA 5: SECUENCIAS DE BASES DE ADN DE CADENA ÚNICA DE 35 NT (TABLA S2)

....................................................................................................................... 37

TABLA 6: TUMORES CON AMPLIFICACIÓN DE C-MYC. ........................................... 63

TABLA 7: CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS Y ESTADO DE PROGRESIÓN DEL CÁNCER EN EL

MOMENTO DE LA EXTRACCIÓN DE SANGRE. .................................................... 98

vi
 ÍNDICE DE FIGURAS

FIGURA 1: PROCESO DE METASTATIZACIÓN ............................................................. 6

FIGURA 2: HETEROGENEIDAD TUMORAL .................................................................. 8

FIGURA 3: HETEROGENEIDAD SUBYACENTE............................................................. 9

FIGURA 4: MOMENTOS DE INTERVENCIÓN.............................................................. 10

FIGURA 5: HETEROGENEIDAD NO DETECTADA POR LAS TÉCNICAS CONVENCIONALES.

....................................................................................................................... 11

FIGURA 6: CURVAS DE SUPERVIVENCIA EN FUNCIÓN DEL NÚMERO DE CTCS ......... 15

FIGURA 7: FUNDAMENTOS DE LOS ESPECTROS RAMAN Y FLUORESCENTE. ............ 17

FIGURA 8: DIFERENCIAS ENTRE LOS ESPECTROS RAMAN Y FLUORESCENTE. .......... 18

FIGURA 9: TOMOGRAFÍA POR EMISIÓN DE POSITRONES (PET). IMAGEN PET DE UN

CÁNCER DE PULMÓN, CON UNA PEQUEÑA ADENOPATÍA MEDIASTÍNICA. ......... 20

FIGURA 10: ESPECTROS SERS OBTENIDOS BAJO DISTINTAS CONCENTRACIONES DE

SAL. ................................................................................................................ 31

FIGURA 11: ESPECTRO DE EXTINCIÓN DE LOS COLOIDES AGNP, ESPECTRO SERS Y

POTENCIAL. .................................................................................................... 32

FIGURA 12 : PLEGAMIENTO DE LA MOLÉCULA DE ADN ......................................... 33

FIGURA 13: SIMULACIÓN DE LA ADSORCIÓN DEL SSDNA DE 141 PB ...................... 34

FIGURA 14: SIMULACIÓN DE LA ADSORCIÓN DE SSDNA DE 20 PB. ......................... 34

FIGURA 15: SECUENCIA DE RAS. ........................................................................... 35

FIGURA 16: RESULTADOS PROMEDIO DE 54 ESPECTROS. ........................................ 38

FIGURA 17: ESPECTROS SERS A 25ºC. .................................................................. 39

FIGURA 18: PLS-DA. CADA ESPECTRO ES UN PUNTO. ............................................ 40

vii
FIGURA 19: VARIABLES LATENTES. ........................................................................ 41

FIGURA 20: ELECTROFORESIS SSCP....................................................................... 43

FIGURA 21: PROMEDIO DE ESPECTROS SERS DE LOS FRAGMENTOS DE ADN WT Y

MUT. ............................................................................................................. 52

FIGURA 22: PREDICCIÓN DE LA PERTENENCIA DE ESPECTROS A UNA CLASE

ESPECÍFICA. .................................................................................................... 53

FIGURA 23: SERS DE FRAGMENTOS DE 141 PB, WT Y MUT. ................................ 54

FIGURA 24: ESPECTROS SERS DE FRAGMENTOS DE 141PB MUT Y WT. ................... 55

FIGURA 25: ANÁLISIS PLS-DA A PARTIR DE LOS DATOS ESPECTRALES DE MUT EN

FRAGMENTOS DE 141 PB. ................................................................................ 55

FIGURA 26: ESPECTROS SERS DE FRAGMENTOS DE 141 PB EN DISTINTAS

CONDICIONES. ................................................................................................. 56

FIGURA 27: ESTRUCTURA DEL CONSTRUCTO. ......................................................... 67

FIGURA 28: ESPECTROS DE LA NANOPARTÍCULA EN SUS DISTINTAS FASES. ............ 68

FIGURA 29: ESPECTROS A DIFERENTES CONCENTRACIONES. ................................... 69

FIGURA 30: FUNCIONALIDAD DEL CONSTRUCTO Y RESPUESTA EN PRESENCIA DE C-

MYC. ............................................................................................................. 71

FIGURA 31: PROTOCOLO EN MUESTRAS REALES. .................................................... 73

FIGURA 32: PREPARACIÓN DE LAS NANOPARTÍCULAS............................................. 81

FIGURA 33: IMÁGENES SEM: ................................................................................. 84

FIGURA 34: ESPECTRO UV TRAS FUNCIONALIZACIÓN. ........................................... 85

FIGURA 35: CHIP OPTOFLUÍDICO. ........................................................................... 96

FIGURA 36: CITOMETRÍA DE FLUJO. ........................................................................ 98

FIGURA 37: SEÑAL EN EL DISPOSITIVO OPTOFLUÍDICO. ........................................... 99

FIGURA 38: RESULTADOS EN PACIENTES. ............................................................. 100

viii
FIGURA 39: RESULTADOS OPTOFLUÍDICOS Y CARACTERÍSTICAS DE LOS PACIENTES.

..................................................................................................................... 101

FIGURA 40: PERFILES DE ABSORCIÓN Y EMISIÓN DE LOS FLUORÓFOROS UTILIZADOS.

..................................................................................................................... 118

FIGURA 41: OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES DE CULTIVO, CONCENTRACIÓN

OXÍGENO Y TIEMPOS. .................................................................................... 119

FIGURA 42: MICROSCOPIA CONFOCAL UNA VEZ OPTIMIZADAS LAS CONDICIONES.120

FIGURA 43: RESULTADOS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO. ...................................... 121

FIGURA 44: CORRELACIÓN ENTRE PROPORCIONES ESPERADAS DE CÉLULAS Y REALES.

FLUORESCENCIA PROMEDIO. ........................................................................ 121

FIGURA 45: EL INCREMENTO DE PUBLICACIONES ACERCA DE BIOMARCADORES ES

CLARAMENTE MÁS RÁPIDO QUE SU TRASLACIÓN CÍNICA. MODIFICADO DE

ELISABETH DRUCKER Y KURT KRAPFENBAUER 2013 ................................. 135

FIGURA 46: APLICACIÓN PRÁCTICA DE LOS HALLAZGOS. ..................................... 140

FIGURA 47: DIAGRAMA DEL PROCESO DE APLICACIÓN CLÍNICA DE LAS TÉCNICAS DE

BIOPSIA LÍQUIDA PROPUESTAS. ..................................................................... 141

ix
 ÍNDICE DE APÉNDICES

APÉNDICE A: AUTORIZACIÓN DEL COMITÉ DE ÉTICA ........................................... 155

APÉNDICE B: CONSIDERACIONES ÉTICO-LEGALES ............................................... 157

APÉNDICE C: CONSENTIMIENTO INFORMADO ....................................................... 159

APÉNDICE D: CARACTERISTICAS DE LAS PUBLICACIONES ORIGINALES ............... 164

APÉNDICE E: ARTÍCULOS ORIGINALES ................................................................. 165

APÉNDICE F: COPIA DE LOS ARTÍCULOS ORIGINALES........................................... 166

APÉNDICE G: PATENTES ....................................................................................... 177

x
 RESUMEN
El examen patológico clásico de los tumores (morfo-histológico) es incapaz de
delinear todas las dimensiones de la enfermedad clínica que son requeridas en la
práctica. Por otro lado, la caracterización molecular de los tumores, aplicada de
forma consistente en oncología clínica, no solo identifica la enfermedad, sino que
añade valor predictivo y pronóstico y tiene el potencial de definir objetivos
terapéuticos específicos. El estudio anátomo patológico convencional comienza
típicamente con la obtención de una muestra de tejido sólido (o citología) mediante
una biopsia invasiva. Posteriormente, la muestra se analiza en el laboratorio por
histo/inmunohistoquímica (HC / IHC). Este procedimiento permite determinar las
características morfológicas y la expresión de biomarcadores en los tejidos
estudiados, alcanzándose así un diagnóstico y un pronóstico. Además de la lentitud
de este proceso, que implica varias fases: preanalítica (fijación, inclusión,
procesamiento y corte), analítica (permeabilización, tinción y visualización) y las
etapas post-analíticas (interpretación y diagnóstico), la biopsia de tejido suele ser
bastante compleja, ya que es dolorosa, potencialmente dañina para el paciente y
costosa. Además, no permite monitorizar la evolución de la enfermedad en tiempo
real y, en algunos casos, ni siquiera es factible su realización. Por lo tanto, el
desarrollo de métodos no invasivos para detectar, caracterizar y monitorizar
tumores es un desafío fundamental en oncología.

La denominada biopsia líquida consiste en la detección y caracterización de células

tumorales circulantes en la sangre, así como los ácidos nucleicos, proteínas o
exosomas asociados a ellas. Ofrece la oportunidad de investigar el tumor primario
y, simultáneamente, la metástasis. A diferencia de las biopsias tradicionales que
requieren una cirugía u otros procedimientos invasivos, la biopsia líquida se realiza
a través de la toma de muestras de sangre. Más importante aún, la biopsia líquida
proporciona una visión dinámica del tumor, ya que puede realizarse en los sucesivos
tiempos de evolución de la enfermedad tumoral, permitiendo una monitorización
seriada de su curso, una definición rápida de sensibilidad o resistencia a los
tratamientos y, finalmente, un diagnóstico precoz de las recaídas. Pero pese a las
ventajas que ofrece este método diagnóstico, aún no hay una tecnología validada
clínicamente. Las dos principales limitaciones de la biopsia líquida para su
validación son:

xi
1-Tecnológica: la complejidad de las tecnologías disponibles, al implicar una alta
especialización y centralización (como la citometría de flujo, la PCR o la
secuenciación.), son muy costosas y por ello no están disponibles en el “punto de
atención al paciente”.

2-Estratégica: la heterogeneidad de los tumores limita los métodos de detección

actuales, basados en dianas predefinidas, limitando la capacidad de detección de la
mayor parte de las poblaciones celulares.

En esta tesis doctoral se proponen, desarrollan y demuestran cuatro nuevos

procedimientos que comparten el objetivo común de intentar superar estas dos
limitaciones:

• La aplicación de la técnica de análisis SERS para la detección de mutaciones

específicas de tumores en ácidos nucleicos circulantes (cfDNA de k-RAS
en cáncer de colon) sin recurrir a PCR ni Secuenciación.
• La aplicación de un dispositivo optofluídico para la detección de células
tumorales de cáncer de mama.
• La detección de células tumorales mediante manipulación del efecto
Warburg, común a más del 80% de los tipos de tumor.
• La detección subrogada de células tumorales mediante el análisis SERS de
la proteína c-MYC, amplificada en prácticamente todos los tipos tumorales.

Dichas tecnologías y estrategias se demuestran teórica y experimentalmente en los

artículos compilados en esta tesis, confirmándose su efectividad en pacientes reales.
Constituyen una prueba de concepto de su utilidad clínica e inician los primeros
ensayos observacionales para su validación clínica.

xii
 ABSTRACT
The classical pathologic examination of tumors (morpho-histological) is unable of
outlining all dimensions of the clinical disease. On the other hand, the molecular
characterization of tumors, consistently applied in clinical oncology, identifies the
disease, adds predictive and prognostic value and determines the presence of
specific therapeutic targets. This class of analyses is typically performed on solid
tissues acquired through invasive biopsy. Posteriorly, the samples are analyzed in
the pathology lab by histo/immunohistochemistry (HC/IHC). This allows to
determine the morphological characteristics and the expression of biomarkers in the
tissues reaching, thus, a diagnostic and prognostic. Besides the slowness of this
process, which involves pre-analytic (fixation, embedding, processing and
sectioning), analytic (permeation, staining and visualization) and post-analytic
steps (interpretation and diagnostic), a tissue biopsy is often quite challenging as it
is costly, painful, or potentially risky for the patient. Further, it cannot track the
disease evolution in real-time and, in some cases, it is not even feasible. Thus, the
development of non-invasive methods to detect, characterize and monitor tumors is
a major challenge in oncology.

Liquid biopsy consists of the detection and characterization of circulating tumor

cells and nucleic acids or proteins associated therewith. It offers the opportunity to
investigate the primary tumor and, simultaneously, the metastasis. Unlike
traditional biopsies that require surgery or other invasive procedures, the liquid
biopsy is done through the collection of blood samples. More importantly, the liquid
biopsy provides a dynamic view of the tumor, as it can be performed in successive
times of disease evolution, allowing serial monitoring of its course, a rapid
definition of sensitivity or resistance to treatments and an early diagnosis of
relapses. Despite the advantages offered by this diagnostic method there is still no
clinically validated technology.

In this thesis by publications has been analyzed the limitations of these

technologies, and two main limitations have been defined:

1 - The complexity of the available technologies that involve high specialization

and centralization, such as flow cytometry, PCR or sequencing, etc., which are very
expensive and are not available at the patient's point of care.

xiii
2- The heterogeneity of tumors that limits current detection methods, based mainly
on predefined targets, limiting the detection of most of the cell populations.

The following approaches are proposed and developed to overcome them:

• The application of the SERS analysis technique for the detection of tumor-
specific mutations in circulating nucleic acids (k-RAS cDNA in colon
cancer) without resorting to PCR or Sequencing
• The application of optofluidic devices for the detection of tumor cells.
• The detection of tumor cells by manipulation of the Warburg effect,
common to more than 70% of tumor types.
• Detection of tumor cells by SERS detection of the c-MYC protein,
amplified in virtually all tumor types.

These strategies are demonstrated theoretically and experimentally, in de articles

compiled in this doctoral thesis, confirming their effectiveness in real patients.

The structure of the thesis is by compilation of publications. The four articles that
configure it share the common objective of defining a liquid biopsy methodology
that exceeds the limitations described and is suitable for future clinical validation.
They constitute a proof of concept that confirms its clinical utility and initiate the
first observational tests for its clinical validation.

xiv
 TABLA DE CONTENIDO

1 INTRODUCCIÓN .........................................................................................1

1.1 EL CÁNCER ...............................................................................................2

1.2 DIAGNÓSTICO DEL CÁNCER ......................................................................7

1.3 BIOMARCADORES ......................................................................................7

1.4 BIOPSIA LÍQUIDA .....................................................................................13

1.5 SERS: SURFACE ENHANCED RAMAN SPECTROSCOPY ............................16

1.6 EFECTO WARBURG .................................................................................19

1.7 OPTOFLUÍDICA ........................................................................................21

2 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ......................................................................23

2.1 HIPÓTESIS DE TRABAJO ...........................................................................24

2.2 OBJETIVO GENERAL ................................................................................25

2.3 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .........................................................................25

3 ESTUDIO I ...................................................................................................27

3.1 CLASIFICACIÓN CONFORMACIONAL DE LAS MUTACIONES PUNTUALES DE

K-RAS MEDIANTE SERS PARA EL DIAGNÓSTICO DEL CÁNCER ...........................27

3.1.1 Resumen ............................................................................................ 28

3.1.2 Introducción ...................................................................................... 28

3.1.3 Objetivos ........................................................................................... 30

3.1.4 Resultados y discusión ...................................................................... 31

3.1.5 Conclusiones ..................................................................................... 44

3.1.6 Información suplementaria ............................................................... 45

xv
 REFERENCIAS ..................................................................................................... 57

4 ESTUDIO II ................................................................................................. 61

4.1 REGLAS SERS DE SELECCIÓN DE SUPERFICIE APLICADAS A LA BIOPSIA

LÍQUIDA PROTEÓMICA EN MUESTRAS REALES: DETECCIÓN EFICIENTE DE LA

ONCOPROTEÍNA C-MYC ..................................................................................... 61

4.1.1 Resumen ............................................................................................. 62

4.1.2 Introducción ...................................................................................... 62

4.1.3 c-MYC ................................................................................................ 64

4.1.4 SERS y reglas de selección ................................................................ 65

4.1.5 Objetivos ............................................................................................ 66

4.1.6 Modelo experimental ......................................................................... 66

4.1.7 Muestras reales ................................................................................. 72

4.1.8 Conclusiones...................................................................................... 74

4.1.9 Información Suplementaria ............................................................... 74

REFERENCIAS ..................................................................................................... 85

5 ESTUDIO III ............................................................................................... 89

5.1 DISPOSITIVO OPTOFLUÍDICO PARA LA CUANTIFICACIÓN DE CÉLULAS

TUMORALES CIRCULANTES EN CÁNCER DE MAMA ............................................ 89

5.1.1 Resumen ............................................................................................. 90

5.1.2 Introducción: biopsia líquida de Células Tumorales Circulantes

(CTCs) 91

5.1.3 Técnicas ............................................................................................. 92

5.1.4 Objetivos ............................................................................................ 93

5.1.5 Resultados y discusión ....................................................................... 93

5.1.6 Conclusiones.................................................................................... 102

xvi
 5.1.7 Información suplementaria ............................................................. 103

REFERENCIAS ....................................................................................................109

6 ESTUDIO IV ..............................................................................................113

6.1 PROCEDIMIENTO METABÓLICO PARA EL RECONOCIMIENTO UNIVERSAL DE

CÉLULAS TUMORALES ......................................................................................113

6.1.1 Resumen .......................................................................................... 114

6.1.2 Introducción .................................................................................... 114

6.1.3 Objetivos ......................................................................................... 116

6.1.4 Resultados y Discusión ................................................................... 116

6.1.5 Conclusiones ................................................................................... 122

6.1.6 Información Suplementaria (Materiales y Métodos) ...................... 122

REFERENCIAS ....................................................................................................126

7 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...............................................................131

7.1 OTROS HALLAZGOS DESTACABLES ........................................................138

7.1.1 Proteína c-MYC como marcador surrogado .................................. 138

7.1.2 La hiperoxia como factor inductor de un incremento de captación de

glucosa en las células tumorales. ............................................................... 139

7.2 PERSPECTIVAS.......................................................................................140

8 CONCLUSIONES GENERALES ............................................................143

9 REFERENCIAS GENERALES ...............................................................147

10 APÉNDICES...............................................................................................153

A: AUTORIZACIÓN DEL COMITÉ DE ÉTICA .........................................155

B: CONSIDERACIONES ÉTICO-LEGALES ...............................................157

xvii
C: CONSENTIMIENTO INFORMADO ........................................................ 159

D: CARACTERÍSTICAS DE LAS PUBLICACIONES ORIGINALES ..... 164

E: ARTÍCULOS ORIGINALES ...................................................................... 165

F: PATENTES ................................................................................................... 177

xviii
xix
xx
 eral

1 INTRODUCCIÓN EL CÁNCER
DIAGNÓSTICO

BIOMARCADORES

BIOPSIA LÍQUIDA

SERS
La presente tesis doctoral está estructurada como EFECTO WARBURG
una compilación de cuatro artículos publicados. Los
OPTOFLUÍDICA
trabajos que en dichos artículos se exponen
obedecen a un objetivo común. Todos ellos están
centrados en la denominada “biopsia líquida”, título de esta tesis. Se propusieron
dos objetivos en relación a este procedimiento: mejorar tecnológicamente los
métodos existentes en la actualidad en cuanto a simplicidad y coste y, por otro lado,
superar una de sus principales limitaciones: la existencia de heterogeneidad
tumoral. En esta introducción se describe el concepto de biopsia líquida, sus
aplicaciones y el estado actual de las estrategias disponibles, así como las
tecnologías existentes para su implementación clínica. Finalmente, se describen los
fundamentos y técnicas adoptadas en los cuatro artículos que configuran esta tesis.
 Biopsia Líquida

1.1 El Cáncer

El cáncer supone un problema sanitario mundial de primer orden. Según la OMS

(Organización Mundial de la Salud) fallecen 8.2 millones de personas cada año por
esta enfermedad, lo cual supone más de 22.000 fallecimientos diarios. Además,
diversas evidencias epidemiológicas muestran una tendencia al empeoramiento de
esta situación, al menos en cuanto a la incidencia de la enfermedad.

Es una enfermedad ocasionada por el fracaso de los controles que regulan la

división y la muerte celular. Este equilibrio, entre división y muerte, es el que
determina en última instancia la estructura y la función de los organismos
pluricelulares y, por tanto, su integridad, identidad y supervivencia.

A lo largo de los últimos 50 años, la teoría y la investigación clínica y experimental

han ido constituyendo un modelo de esta enfermedad que se definiría por la
aparición de múltiples etapas o estadios sucesivos, cada uno de los cuales estaría
caracterizado por la presencia de determinados eventos, habitualmente mutaciones
genómicas somáticas, que se irían acumulando. La presencia de estas mutaciones
en la línea germinal aceleraría el proceso (cánceres hereditarios). La enfermedad,
según este modelo, aparecería tras una compleja secuencia de acontecimientos o
fallos. Por lo tanto, se asume que, independientemente de las distintas
manifestaciones fenomenológicas o funcionales, las diversas expresiones de esta
enfermedad heterogénea descansan en una inestabilidad genómica, es decir, en la
presencia de mutaciones genómicas. Clark en un destacado artículo, considerado
ya “clásico”, define el cáncer de la siguiente manera:

El cáncer consiste en una población de células anormales que muestran

temporalmente un crecimiento/multiplicación en relación con sus vecinas. Dichas
células anormales invaden los tejidos adyacentes, atraviesan la membrana basal y
proliferan también en el mesénquima próximo a su origen, pudiendo metastatizar a
sitios distantes. Es decir, muestran proliferación incontrolada en al menos, tres
localizaciones: el compartimiento original, el mesénquima primario y un
mesénquima distante (Clark 1991)

Neoplasia es una lesión focal, proliferativa, sea tumor benigno, cáncer primario o
metástasis. Es una proliferación clonal, es decir, una lesión originadas en una sola

2 Eduardo García-Rico
 1. Introducción

célula primitiva. Progresión tumoral designa la secuencia de cambios focales que

tienen lugar dentro de las lesiones proliferativas de un sistema neoplásico,
resultando en una serie de entidades cualitativamente diferentes. Las lesiones
pueden progresar de benignas a malignas o a un incremento de malignidad. Vista
como un proceso, la progresión no es obligada, de hecho, pueden describirse
regresiones (en algún caso de melanoma).

Displasia es una proliferación focal de células con crecimiento temporalmente

restringido, que muestran una organización anormal del tejido (diferenciación
aberrante, atipia)

En un segundo artículo el mismo Clark (Clark 1995) añade que el cáncer sería una
“forma aberrante de vida” y describe lo que denomina “paradigma genético”. Según
este, el origen de la enfermedad consistiría en la acumulación de múltiples
alteraciones cromosómicas y mutaciones en proto-oncogenes y genes supresores de
tumor.

En este conjunto de ideas quedaron fijados los conceptos que definen hasta hoy la
enfermedad denominada cáncer, al menos desde un punto de vista biológico, a los
cuales se han ido añadiendo los sucesivos descubrimientos de nuevas mutaciones.
El modelo se es descrito como “darwiniano”. Las mutaciones operarían en un
proceso evolutivo de la enfermedad. Las que generan fenotipos más aptos serian
seleccionadas al dotar a la célula de alguna ventaja proliferativa (Nowell 1976). El
fin (pues es un modelo teleológico) sería la proliferación, ya que es esta
característica la que otorgaría la mayor ventaja selectiva.

Cada componente de esta secuencia evolutiva alteraría una función capital en la

homeostasis de los tejidos y de la vida celular: fracaso en la reparación de
mutaciones, fracaso en la apoptosis, activación o sobrexpresión de oncogenes,
inhibición de genes supresores o, finalmente, alteraciones específicas en el
metabolismo. Con estos fundamentos teóricos se desarrollaron modelos
experimentales de proliferación, crecimiento y selección, principalmente a través
de líneas celulares (Norton 1988). Las estrategias terapéuticas también se ajustaron
a este modelo mediante esquemas de poliquimioterapia contemplando la cinética
tumoral según sus postulados (selección natural, crecimiento Gomperziano,
supervivencia del más apto). Como decimos, el interés se focalizó
fundamentalmente en la idea de proliferación, apareciendo las metástasis como un

Eduardo García-Rico 3
 Biopsia Líquida

fenómeno marginal y peor comprendido. Lo sustancial de este modelo no ha

cambiado hasta muy recientemente, cuando el desarrollo de la biología molecular
amplió las posibilidades no solo de análisis (conocimiento de las distintas vías de
transducción de señal, por ejemplo), sino sobre todo las terapéuticas, con el diseño
de drogas dirigidas directamente a alteraciones moleculares específicas (dianas
terapéuticas) (Vogelstein and Kinzler 2002).

Todos estos conceptos han sido reunidos en el artículo seminal y muy crítico de
Hanajan y Weimberg de 2011 (Hanahan and Weinberg 2011), en el que, además,
se señalan nuevos objetivos así como algunas inconsistencias del modelo clásico.
La inconsistencia fundamental de dicho modelo es la marginación del papel de las
metástasis, ya que, según los datos más recientes, la metástasis no es simplemente
un “lugar de llegada” del proceso de la enfermedad, sino que probablemente
aparece desde el inicio (Spremulli and Dexter 1983). El proceso que denominamos
cáncer implica la adquisición celular o tisular de tres fenotipos: invasivo,
proliferativo y metastásico. En un tumor primario se liberan 106 células/día por gr
de tumor (1 gr de tumor = 109 células).

El 90% de los fallecimientos por cáncer no se deben a la localización u origen

primario del tumor, sino al hecho de que dichos tumores primarios son capaces de
originar metástasis. Incluso estas últimas pueden, a su vez, crear nuevas metástasis.
La importancia de este fenómeno es clara:

• El 30% de los tumores presentan metástasis macroscópicas en el

momento del diagnóstico
• Otro 30% presentan micrometástasis (el límite de la capacidad
radiológica de distinguir un nódulo está en un centímetro (10.000
millones de células en 1 cm3).
• Es un hecho biológico muy temprano en la enfermedad y aumenta
con su curso (la probabilidad de aparición)

Denominamos metástasis a la colonización por parte de las células tumorales de

nuevos tejidos no relacionados necesariamente con el tejido originario. La
producción de dichas metástasis requiere la migración de las células tumorales bien
localmente, lo que se denomina invasión, bien por vía linfática o a través del sistema
circulatorio sanguíneo (diseminación hematológica o hematógena). Por tanto, en
algún momento de la evolución de la enfermedad deberían ser detectables células

4 Eduardo García-Rico
 1. Introducción

tumorales circulantes o material derivado del tumor primario, tal como proteínas,
ácidos nucleicos o exosomas (Figura 1).

La detección analítica de los llamados “marcadores tumorales “, que en general son

glicoproteínas derivadas de un tumor primario o sus metástasis, es una
aproximación tradicional a la metodología que se ha denominado actualmente
“biopsia liquida “. Sin embargo, ninguno de estos marcadores séricos (CEA,
CA125, etc.) ha conseguido mejorar la sensibilidad y la especificidad de las pruebas
radiológicas (excepción hecha del PSA en el caso del adenocarcinoma de próstata).

La biopsia líquida consiste en el aislamiento y / o enumeración, primariamente en

sangre periférica, de células o ácidos nucleicos tumorales con el fin de establecer el
diagnóstico, el pronóstico o incluso la monitorización de la enfermedad tumoral.
Por tanto, se trata de un procedimiento no invasivo que podría, en el futuro,
complementar a las biopsias quirúrgicas tradicionales

Este tipo de biopsia no solo presenta las ventajas de no ser cruenta y de ser
practicables en todo momento, sino que, además, permite superar una de las
características de los tumores que más dificultad está creando actualmente en el
diagnóstico del cáncer. Se trata de la “heterogeneidad tumoral “(Spremulli and
Dexter 1983; Perou et al 2000; Swanton 2012).

Esta heterogeneidad tumoral, es decir, la presencia en los tumores de células tanto

genotípica como fenotípicamente diferentes (aun siendo su origen monoclonal)
posiblemente explique el mecanismo subyacente a la aparición del fenómeno
invasivo y metastásico (Hanahan and Weinberg 2011). Está claro que los tumores
originados en tejidos epiteliales (carcinomas y adenocarcinomas) progresan hacia
distintas formas de desdiferenciación y rediferenciación, dando lugar a distintos
grados de malignidad (Figura 2). En estas transiciones fenotípicas las células
tumorales llegan a adoptar características similares a aquellas propias de las células
mesenquimales embrionarias: movimiento, invasión, migración, deformabilidad,
etc. Este fenómeno, subyacente a la heterogeneidad tumoral, se ha denominado
“Transición Epitelial Mesenquimal” (EMT). Por otra parte, otra evidencia de dicha
heterogeneidad tumoral, en este caso dinámica, se observa al aislar células
tumorales circulantes en distintos momentos evolutivos de la misma enfermedad,
de tal modo que en cada uno de esos momentos se observan características
fenotípicas distintas. Este es el caso de las pacientes con cáncer de mama cuyo

Eduardo García-Rico 5
 Biopsia Líquida

tumor primario no presenta amplificación ni expresión de HER-2, pero cuyas

metástasis detectadas mediante biopsias liquidas sucesivas muestran
ocasionalmente expresión de dicho oncogén. Se trata de un hecho muy relevante,
ya que dichas pacientes, ateniéndose exclusivamente a la biopsia primaria
convencional tal como se procede actualmente en la clínica, no recibirían
tratamiento específico contra HER-2 y, por tanto, estarían mal tratadas.

La heterogeneidad tumoral, como vemos, no solo es espacial, sino que también es

dinámica, tanto desde un punto de vista intratumoral (espacial y temporal) como
desde el punto de vista de la metástasis (primario-metástasis o metástasis-
metástasis). De forma que dicho fenómeno constituye una limitación primordial a
la utilización de las nuevas estrategias terapéuticas basadas en dianas moleculares
(medicina personalizada), tal como se acaba de mencionar en el caso de HER-2.

Figura 1: Proceso de metastatización

A partir del tumor primario se diseminan Células Tumorales Circulantes (CTCs). Tanto estas como
el tumor primario liberan ADN, ARN, exosomas y proteínas

6 Eduardo García-Rico
 1. Introducción

1.2 Diagnóstico del Cáncer

Si bien el enfoque de esta tesis doctoral está dirigido al cáncer en general, la mayor
parte de los experimentos se han realizado en modelos de cáncer de mama y colon,
tanto en líneas celulares como en pacientes.

Las decisiones terapéuticas actuales en el cáncer de mama se basan en:

• El análisis de datos clínicos, como el estado de los ganglios axilares o

tamaño del tumor.
• La histología: tipo histológico, grado nuclear, diferenciación, algún
indicador proliferativo (número de mitosis o Ki67).
• La inmunohistoquímica: receptores estrogénicos (ER), receptores de
progesterona (PR).
• FISH : (fluorescent in situ hybridization) amplificación de HER-2.

Estos parámetros no solo tienen valor pronóstico, sino que también añaden valor
predictivo, es decir, anticipan la probabilidad de responder a tratamientos
determinados. Sin embargo, aunque dicha información establece los indicadores
pronósticos y predictivos básicos, hay distintas situaciones clínicas en las que se
necesita una mayor precisión. En este sentido, se han introducido en los últimos
años dos nuevas aproximaciones: perfil genético (Oncotype-DX ®, Mamaprint ®)
y biopsia liquida: Cellsearch ® (procedimientos aprobados por la FDA)

El desarrollo de estas técnicas ha supuesto, al menos desde un punto de vista teórico,

una nueva taxonomía del cáncer de mama (los denominados por Perou subtipos
intrínsecos ) (Perou et al. 2000). A pesar de ello, la tecnología que supone esta
clasificación es cara y no está disponible para la práctica clínica rutinaria.

1.3 Biomarcadores

En los últimos años se han introducido en la práctica clínica nuevos biomarcadores

que han facilitado la toma de decisiones médicas.

Eduardo García-Rico 7
 Biopsia Líquida

Figura 2: Heterogeneidad tumoral

Una biopsia en la zona HER2- reflejaría una imagen errónea del tumor. Adaptado de Mike Barret,
2013

El diagnóstico de cáncer de mama fue pionero en el uso de biomarcadores

histológicos: grado nuclear, tasa de replicación, grado de necrosis, invasión
linfovascular, presencia de linfocitos, etc.). Muy tempranamente se introdujeron,
además, biomarcadores inmunohistoquímicos: p53 mutado, Ki67, Receptores
Hormonales, HER-2, etc. como se ha mencionado previamente. Y más
recientemente marcadores moleculares: FISH de HER2, o los análisis de expresión
génica múltiple previamente citados (Oncotype© o Mamaprint©).

Como resultado se ha producido no solo una mejoría en la supervivencia de esta

enfermedad, sino además una disminución de los daños relacionados con los
tratamientos (al establecerse criterios muy precisos para estratificar a las pacientes
de cara a uno u otro tratamiento, neoadyuvancia, cirugías limitadas, ganglio
centinela, etc.). El hecho, paradigmático en el diagnóstico del cáncer de mama, es
que subyaciendo a biopsias patológicamente indistinguibles, se han descrito nuevas
características, hasta ahora no visibles, que definen claramente enfermedades
clínicamente distintas. En la Figura 3 vemos un ejemplo idealizado de las
preparaciones histológicas con hematoxilina-eosina de tumores de mama de tres
pacientes diferentes que son anatomopatológicamente indistinguibles. Sin
embargo, la evolución clínica de las tres pacientes es bien diferente, como muestran
las curvas de supervivencia actuarial.

8 Eduardo García-Rico
 1. Introducción

Figura 3: Heterogeneidad subyacente

Tres biopsias aparentemente idénticas de tres pacientes cuya evolución clínica, sin embargo, es
completamente diferente. Adaptado de John A. Martignetti, 2016

A la caracterización de estas propiedades subyacentes se le ha denominado

medicina personalizada o de precisión, y ha podido desarrollarse gracias a las
técnicas de biología molecular, fundamentalmente la PCR (polymerase chain
reaction) y la secuenciación automatizada de ADN.

Pero el papel de estos biomarcadores no se limita al diagnóstico, sino que también

son útiles al identificar nuevas dianas terapéuticas, añadiendo un elemento más de
precisión a los tratamientos (Tabla 1). El hito de esta estrategia lo marco la
introducción del Imatinib (Hoffmann et al. 2017) como tratamiento dirigido a una
diana específica, molecularmente identificada: el producto híbrido del nuevo gen
producto de la translocación BCR-Abl (en la Leucemia Mieloide Crónica) o la
introducción del Trastuzumab (Dall, Koch et al. 2017) en el cáncer de mama con
HER2 amplificado. Estos éxitos se han ido extendiendo a otros tipos tumorales,
destacando el caso del carcinoma no microcítico de pulmón portador de mutaciones
puntuales en EGFR (Rosell et al. 2017; Saxon et al. 2017) o de traslocaciones
EML4-ALK (Zhang, Shiratsuchi et al. 2017), del melanoma con mutaciones en
BRAF (Bruno, Martinuzzi et al. 2017) o del adenocarcinoma colorrectal con
mutaciones en K-RAS o N-RAS (Rodriguez-Salas, Dominguez et al. 2017). En
todos estos, casos no solo se realiza un diagnóstico y pronóstico más preciso, sino

Eduardo García-Rico 9
 Biopsia Líquida

que al disponerse de fármacos dirigidos a las dianas mencionadas, los tratamientos

son mas efectivos (Figura 4).

Figura 4: Momentos de intervención

Distintos papeles de un biomarcador, como la biopsia líquida, en cada momento de la evolución de
una enfermedad tumoral genérica. Se muestra la historia natural habitual de un cáncer. Adaptado
de A, Martignetti 2016

Por otra parte, estos nuevos biomarcadores, sobre todo los genómicos, han
mostrado una complejidad subyacente en cada tumor hasta ahora desconocida. Se
trata de la denominada heterogeneidad inter e intra-tumoral, o la heterogeneidad
genotípica entre tumor primario y metástasis (Spremulli and Dexter 1983). Incluso
se ha observado heterogeneidad temporal, es decir, fluctuaciones poblacionales en
un mismo tumor a lo largo del tiempo (McGranahan and Swanton 2017, Miyamoto,
Ting et al. 2017). Ante estos hechos, las biopsias convencionales se muestran
insuficientes (Brock et al. 2009; Huang et al. 2017) (Figura 5).

10 Eduardo García-Rico
 1. Introducción

Figura 5: Heterogeneidad no detectada por las técnicas convencionales.

Por Western se observa una intensidad decreciente de la banda. La misma muestra por citometría,
en b, refleja la presencia de dos poblaciones. En c la línea continua representa el promedio que oculta
la bifurcación de dos fenotipos. (B) El mismo fenómeno, en a una transición brusca (on-off) en b
una transición con dos poblaciones. El fenómeno queda oculto en Western. Adaptada de Sui Huang,
2009.

En esta figura se puede observar como muchas técnicas moleculares, las basadas en
PCR (amplificación en cadena de polimerasa) o los Western Blot (electroforesis y
transferencia de proteínas) no son capaces de diferenciar la heterogeneidad
intratumoral debido a su propio diseño, basado en análisis promedio o poblacional.
En las técnicas convencionales muchos fenómenos esenciales para entender la
evolución de la enfermedad y su tratamiento, permanecen ocultos, precisándose
nuevas estrategias y tecnologías para detectarlas. En la Figura 5, por ejemplo, se
observan los resultados de un western blot que expresan un incremento progresivo
de señal. Sin embargo, en un estudio citométrico de la misma proteína en

Eduardo García-Rico 11
 Biopsia Líquida

poblaciones celulares se observan fenómenos de clonalidad en el tiempo: aparecen

dos poblaciones celulares no identificables por western.

Tabla 1: Tipos de biomarcadores.

Todas estas categorías pueden ser asumidas por la biopsia líquida. Adapdado de Johnatan D.
(Jonathan 2014).

Tipo de Definición Ejemplo

Biomarcador

Diagnóstico Identifica presencia de enfermedad y su origen Biopsia tradicional

Pronóstico Categorización de los pacientes por su riesgo Mamaprint®, Estado funcional

de progresión/recidiva. Define la historia (ECOG), presencia de ganglios
natural del proceso en axila en Ca. Mama

Predictivo Categorización por probabilidad de responder EGFR en Ca. Pulmón, K-RAS

a un tratamiento en ca. Colon, HER2 en Ca.
Mama, Oncotype®

Farmacodinámico Evaluación dinámica de la respuesta a un Tensión Arterial, Radiología, Dolor

tratamiento determinado

Surrogate Sustituye un endpoint clínico. Son un Supervivencia Global

endpoint subgrupo de los Farmacodinámicos
Supervivencia libre de enfermedad

En otra línea de trabajo, que aporta un concepto nuevo de heterogeneidad funcional

(Alizadeh et al. 2015), se ha demostrado que existen distintas subpoblaciones
celulares dentro del mismo tumor tanto con capacidad metastásica, como no
metastásicas (probablemente la mayoría pertenecen a esta última clase) . La
existencia de las primeras (las metastásicas) fundamenta la hipótesis de las Stem
Cell tumorales (células madre tumorales). Finalmente, otro elemento que se añade
al concepto de heterogeneidad tumoral es la ya mencionada hipótesis de la
transición epitelial-mesenquimal (EMT) en el tumor primario (Gerlinger, Rowan et
al. 2012).

12 Eduardo García-Rico
 1. Introducción

1.4 Biopsia líquida

La práctica médica oncológica tiene que actuar y adoptar decisiones en este ámbito
de complejidad molecular, celular, tisular y clínica, previamente descrito, con el
objetivo de definir con exactitud la situación de un paciente determinado y adoptar
la mejor opción terapéutica para él y en ese momento particular. Para ello, las
fuentes de información del clínico deben ser fiables, sensibles y específicas. Los
tratamientos oncológicos tienen un índice terapéutico muy bajo (ratio dosis
terapéutica/dosis tóxica), por lo que la precisión de la información tiene que ser
muy alta, y, además, debe tener continuidad en el tiempo.

La denominada biopsia líquida, conceptualmente, cumple con todos estos

requisitos. Por ello podría cambiar de forma radical el enfoque diagnóstico y
terapéutico del cáncer, así como la monitorización clínica de esta enfermedad.

Bajo este concepto se reúnen dos enfoques estratégicos distintos: uno dirigido a las
células tumorales circulantes (CTCs –Circulating Tumor Cells-) y el otro dirigido
a los ácidos nucleicos circulantes, generalmente al ADN (cfDNA –circulating free
DNA- o ctDNA –circulating tumor DNA-). Estas células circulantes y sus
“materiales” derivan, o bien del tumor primario o bien de las propias metástasis. En
este último caso se suelen denominar células tumorales diseminadas (DTC). En
muchas ocasiones las biopsias clínicas tradicionales, es decir, la obtención directa
de material tumoral, son impracticables. Esto suele ser habitual, por ejemplo, en el
cáncer de pulmón, principalmente en estadios I o II, es decir, estadios muy iniciales
(Figura 6).

Una segunda ventaja de la biopsia líquida sobre la tradicional es la posibilidad de

determinar el fenotipo tumoral en el tiempo, es decir, la evolución del tumor. Esto
último es esencial cuando se administra un tratamiento, ya que permite monitorizar
su efectividad, así como las posibles resistencias que pudieran aparecer en el curso
del mismo. La detección de estos fenotipos celulares resistentes permite no solo
evitar toxicidades innecesarias, sino también ajustar individualmente el tratamiento
antes de que la enfermedad progrese.

Eduardo García-Rico 13
 Biopsia Líquida

Tabla 2: Ventajas de la biopsia líquida

CARACTERISTICAS BIOPSIA BIOPSIA TISULAR

LÍQUIDA

Invasiva No Si

Idónea para repetir Si No

Estabilidad de la muestra Si Tras procesamiento

Monitorización longitudinal Si No

Coste Bajo (según Alto

técnica)

Tiempo de procesamiento Corto Largo

Tasas de fallo Bajas Altas (según

localización)

Material disponible para post- Amplio Escaso

procesamientos

Dolor/Riesgo No Si

Ingreso Hospitalario No Según

localización/Riesgo

En tercer lugar, la biopsia líquida permite determinar la enfermedad residual

microscópica. Esto es importante en dos situaciones clínicas: en tratamientos
adyuvantes o tras una cirugía con intención radical (denominadas resecciones
tumorales R0) o en la detección temprana de recaídas.

14 Eduardo García-Rico
 1. Introducción

Figura 6: Curvas de supervivencia en función del número de CTCs

Supervivencia libre de enfermedad y global en pacientes con cáncer de pulmón no microcítico
estadio III-IV (A y B) y solo estadio IV (C y D) en función del número de células tumorales
detectadas en sangre (más –azul- o menos de 5 –amarillo-). Adaptado de Mathew G. Krebs, 2011

Finalmente, su papel podría ser esencial en la definición e “end-points” (objetivos

clínicos para evaluar la efectividad de tratamientos, por ejemplo, la supervivencia
global, o la supervivencia libre de enfermedad) o su sustitución (surrogate end-
points) por criterios más precoces y manejables tanto en clínica convencional como
en el desarrollo de nuevos fármacos (ensayos clínicos). La Tabla 2 esquematiza las
ventajas de la biopsia líquida frente a la tisular y en la Tabla 3 se definen algunos
conceptos aplicables a la misma.

En resumen, de los múltiples puntos de vista descritos puede deducirse que el

análisis de las células y del ADN tumoral circulante puede constituirse en
plataforma para superar las limitaciones de los actuales métodos de diagnóstico y
seguimiento del paciente oncológico.

Pero tanto, el ADN como las CTCs tumorales son muy escasas (CTCs: 1/106 o
1/109 , cfDNA: 5-16 ng/mL en sanos, 1157 ng/mL en pacientes con cáncer de colon,

Eduardo García-Rico 15
 Biopsia Líquida

ambas cantidades son promedios) (Schwarzenbach et al. 2008), por lo que la

introducción de nuevas plataformas sensibles y específicas es imprescindible. Las
disponibles en la actualidad son complejas y centralizadas, precisando personal
especializado para su implementación.

Por otro lado, los criterios de selección celular en dichas plataformas deberían ser
lo más universales posible (dirigidas a marcadores o “propiedades” tumorales
genéricas), debido precisamente a la heterogeneidad intrínseca de dichas células.
En cuanto al ADN, el problema principal de su detección es que precisa el
conocimiento previo de la característica que se busca (mutación, translocación, etc.)
que caracteriza al tumor primario, por lo que son precisas tecnologías capaces de
analizar este ADN en las células circulantes.

Tabla 3: Definiciones

Marcador Biológico Un signo físico o de laboratorio que se asocia

a un proceso patológico y que tiene un valor
pronóstico o diagnóstico putativo

Surrogate end-point Un biomarcador que sirva como un sustituto

de un end-point clínicamente significativo y
del cual se espera que prediga el efecto de
una intervención terapéutica.

End-point clínico Una valoración clínicamente significativa de

cómo el paciente, siente y sobrevive

1.5 SERS: Surface Enhanced Raman Spectroscopy

La espectroscopia Raman de dispersión en superficie (SERS, Surface Enhanced

Raman Spectroscopy) es una técnica que combina la espectroscopía láser con las
características (resonancia de plasmones localizada-LSPR) de nanoestructuras
metálicas. Esta interacción láser-plasmón resulta en un aumento de la señal Raman
de los sistemas moleculares cercanos a tales nanoestructuras (Kotanen, Martinez et
al. 2014). El espectro Raman se basa en los fenómenos de dispersión inelástica de
la luz monocromática (generalmente laser) en rango visible, infrarrojo o

16 Eduardo García-Rico
 1. Introducción

ultravioleta. La luz dispersada por el analito está relacionada con los modos
vibracionales que caracterizan su estructura molecular, lo cual es muy específico de
cada material. Los cambios conformacionales de la molécula en estudio ocasionan
espectros específicos. La mejoría que la técnica SERS aporta al Raman puede
alcanzar hasta 14 órdenes de magnitud con respecto a las señales convencionales
de dispersión Raman (RS) de las moléculas. El espectro obtenido es la firma
vibratoria de la molécula, y por lo tanto, contiene toda la información estructural de
dicha molécula en estudio. De este modo, la espectroscopia SERS combina niveles
de detección con especificidad de una sola molécula con una rápida adquisición de
datos sin requisitos especiales o preparación de muestras. Todas estas
características hacen de la SERS una técnica con potencial aplicabilidad en campos
tan diversos como la ciencia de los materiales, la química analítica o la biomedicina.

Cuando una fuente de luz ilumina una molécula interaccionando con la nube
electrónica de sus enlaces, el fotón incidente excita uno de los electrones hasta un
estado virtual (Figura 7) antes de relajarse otra vez a un estado vibracional de menor
energía. La mayoría de los fotones son dispersados elásticamente (radiación
denominada de Rayleigh), es decir con la misma longitud de onda que los fotones
incidentes. Sólo una pequeña fracción de la luz (aproximadamente 1 en 107-108
fotones) es dispersada ópticamente a frecuencias diferentes de la de los fotones
incidentes (efecto Raman). Si el fotón resultante es de inferior frecuencia, entonces
se genera una línea que se denomina Stokes, en el lado rojo del espectro incidente.
En el caso de que la molécula se encontrara ya en un estado vibracional excitado,
los fotones incidentes serán desplazados a frecuencias más elevadas (azul) del
espectro, generando una línea denominada antiStokes

Figura 7: Fundamentos de los espectros Raman y Fluorescente.

Eduardo García-Rico 17
 Biopsia Líquida

Se acepta que al fenómeno SERS contribuyen dos mecanismos: el mecanismo de

intensificación electromagnético (EM) y el mecanismo químico o de transferencia
de carga (TC). El mecanismo EM debe estar presente en toda la experiencia SERS
suficientemente intensa, mientras que el mecanismo CT puede o no participar,
dependiendo de las condiciones.

Desde el punto de vista biológico, la ventaja de esta metodología frente a la

fluorescencia convencional es que no son precisos complejos marcajes y el uso de
anticuerpos intermedios, como en el caso de las inmunohistoquímicas. Por otra
parte, la fluorescencia convencional presenta una banda mucho más ancha que el
espectro SERS, lo cual implica, además, que aparece una gran superposición de
frecuencias entre los distintos fluoróforos, lo que le resta definición y limita las
posibilidades de usar múltiples determinaciones simultáneas. Por último, la señal
de fluorescencia no está estructurada, es continua, por lo que transmite muy poca
información, mientras que el espectro SERS está muy estructurado, constituyendo
una firma molecular muy precisa, incluso de mínimos cambios en la estructura
molecular (Figura 8).

Fluorescencia

Raman

Figura 8: Diferencias entre los espectros Raman y Fluorescente.

18 Eduardo García-Rico
 1. Introducción

Todas estas características, añadido a su simplicidad técnica y bajo coste, son las
que justifican la elección de esta técnica como metodología de dos de los objetivos
propuestos, es decir, la detección de mutaciones características del cáncer de colon
(K-RAS) en ácidos nucleicos circulantes (primer artículo) y la detección de
proteínas específicas (segundo artículo) todo ello en el contexto de estrategias
específicamente diseñadas para las biopsias líquidas.

1.6 Efecto Warburg

Otto Warburg (1883-1970), midiendo el consumo de lactato, glucosa y oxígeno de

los tumores, comprobó que, en relación con las células sanas, las células tumorales
consumían cantidades mayores de glucosa. Y esto ocurría independientemente de
la presencia o no de oxígeno. Al fenómeno se le denomino “glicolisis aerobia” o
fermentación en condiciones de aerobiosis y, posteriormente, efecto Warburg. Este
investigador pensó que, ya que este fenómeno parecía común a todos tipos de
células tumorales, el origen del cáncer estaría en una “lesión” de las mitocondrias
(en las que se produce la respiración celular aeróbica; es decir, el ciclo de Krebs y
la fosforilación oxidativa –OXPHOS-). Posteriormente el fenómeno se describió en
otros tipos celulares no tumorales, pero de rápida proliferación (fibroblastos en los
procesos de cicatrización, por ejemplo). Otro fenómeno específico y universal de
las células tumorales, fue descubierto por Herbert Grace Crabtree (efecto Crabtree)
y consiste en la disminución del consumo de oxígeno con el aporte de glucosa en
dichas células a diferencia de las normales, en las cuales el fenómeno se invierte.
En definitiva, las células malignas se caracterizan por una reprogramación genética
o epigenética de su metabolismo (Ngo et al. 2015, Xu et al. 2015, Danhier et al.
2017, Schwartz et al. 2017).

El efecto Warburg ha sido el fundamento de la tecnología diagnóstica denominada

PET (Tomografía por Emisión de Positrones), técnica radiológica (Figura 9) que
utiliza un contraste consistente en 2-Fluoro-2-Desoxi-D-Glucosa (FDG) (Boellaard
et al. 2015). Las células tumorales incorporan ávidamente y a través de receptores
específicos (GLUT) dicha molécula en contraste con los tejidos normales. Pero pese
a las elevadas tasas de incorporación de glucosa, la fosforilación de la misma impide

Eduardo García-Rico 19
 Biopsia Líquida

que sea liberada al medio (acumulándose en el interior celular) y, además,

interrumpe la glicolisis incrementando aún más la demanda de glucosa. El radical
2-hidroxilo de la molécula de glucosa es necesario para continuar el proceso de
glucólisis, por lo que, al igual que ocurre con la 2-desoxi-D-glucosa, la sustitución
de dicho hidroxilo por hidrógeno en la FDG impide su metabolización en las células
y por ello la FDG-6-fosfato formada no entra en la ruta glicolítica hasta el
decaimientos de la radiactividad (transformándose el átomo de F en H)

Figura 9: Tomografía por Emisión de Positrones (PET). Imagen PET de un cáncer de pulmón, con
una pequeña adenopatía mediastínica.

Como resultado, la distribución de 18F-FDG es un buen reflejo de la distribución

del consumo y fosforilación de glucosa en las células del cuerpo. En el cuarto
artículo de esta tesis, se plantea la hipótesis del uso de este efecto para la detección
de células en el torrente circulatorio. Se diseñó experimentalmente un modelo para
optimizar las condiciones de consumo diferencial de glucosa (deoxiglucosa
marcada con un fluoróforo) en las células malignas y se demostró su efectividad
mediante citometría de flujo (O’Neil et al. 2005, Millon et al. 2011, Chen, Zhang et
al. 2015).

Por otro lado, se explora la hipótesis de manipular el efecto Warburg mediante el

aumento de oxígeno (hiperoxia) en el microambiente celular para incrementar la
captación de glucosa por las células malignas, y se demostró dicho fenómeno.

20 Eduardo García-Rico
 1. Introducción

1.7 Optofluídica

Microfluídica se ha definido, generalmente, como el estudio del flujo de fluidos y

transporte de sustancias en los mismos, en dimensiones entre 100 nm y 100 µm.
Por otra parte, el término “optofluídica” apareció por primera vez en 1985 en un
artículo de Jones (Jones 1985) en el que revisaba el uso de fibras ópticas como
sensores y sistemas, incluyendo el control neumático de microválvulas (Jonathan
2014). Las posibilidades tecnológicas de construir redes de microcanales han hecho
crecer las posibilidades de diseño de dispositivos con uso diagnóstico. El concepto
derivado de esta tecnología es “lab-on-a-chip”, que transmite la idea de
implementar de forma sencilla y portable la complejidad del laboratorio. El
desarrollo de nuevos biomarcadores moleculares en oncología, incluida la biopsia
líquida, encuentra una barrera crítica en los procesos de validación clínica y
reproductibilidad. Esto se debe esencialmente a que las tecnologías disponibles
hasta ahora requieren, por su complejidad, coste y tamaño, personal especializado,
y esto las hace inaccesibles a la práctica clínica general. Es decir, no están próximas
al paciente. Es de destacar que, pese a los enormes esfuerzos de investigación en
ese terreno, solo hay un dispositivo aprobado por la FDA norteamericana (Food and
Drug Administration) para la caracterización de células tumorales circulantes
(CellSearch®).

Con la excepción de unas cuantas unidades centralizadas, la mayoría de las áreas

sanitarias, con recursos generalmente limitados, no cuentan con la infraestructura
necesaria para apoyar tecnologías tan especializadas.

En el segundo artículo de esta tesis doctoral se desarrolla un dispositivo

optofluídico para detectar células tumorales circulantes a partir de una muestra de
sangre. Su efectividad se compara con la citometría de flujo, resultando
equivalentes. En el diseño se utilizan dos marcadores específicos para la detección
de dichas células tumorales, en este caso células de cáncer de mama.

Eduardo García-Rico 21
 eral

2 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS

HIPÓTESIS
OBJETIVO
GENERAL

OBJETIVOS
ESPECÍFICOS

En la introducción se han descrito las limitaciones fundamentales de las biopsias

tradicionales para obtener toda la información que requeriría un diagnóstico de
precisión adecuado a un tratamiento individualizado y, al mismo tiempo, adaptado
a la evolución temporal del cáncer.

La biopsia líquida representa un concepto capaz de superar dichas limitaciones,

pero actualmente aún no está validada clínicamente. La razón es que no se ha
 Biopsia Líquida

implementado aún ninguna tecnología o estrategia reproducible que aborde el

objeto de estudio (células, ADN o proteínas) teniendo en cuenta sus propiedades o
marcadores genéricos en lugar de dianas específicas. La mayoría de las propuestas
precisan de una definición previa del objetivo. Por otro lado, las técnicas
disponibles son complejas y centralizadas, lo que al impedir su uso en el punto de
asistencia oncológico (por ejemplo, hospitales de día) ha bloqueado o dificultado la
posibilidad de realizar ensayos de tamaño suficiente para la validación clínica.

2.1 Hipótesis de Trabajo

1. Las células malignas presentan una tasa de consumo de glucosa más

alto que las células sanas. Esta propiedad debería proporcionar un
método general y específico para detectar células malignas en sangre
periférica mediante glucosa marcada.
2. El metabolismo de las células malignas privilegia las rutas
biosintéticas (glicolisis, síntesis de biomasa) a la producción de
energía (ATP, fosforilación oxidativa) a diferencia de las células
sanas. La introducción de un microambiente hiperóxico debería
incrementar la diferencia entre el consumo de glucosa entre ambos
tipos de células. La confirmación de este hecho, incrementaría la
sensibilidad de una biopsia líquida basada en la hipótesis primera.
3. La espectroscopia SERS y la tecnología optofluídica, por sus
características de bajo coste, simplicidad de manejo y alta
sensibilidad y especificidad, aplicadas a la detección de células
tumorales circulantes (CTCs) y sus productos, representarían una
ventaja frente a los procedimientos convencionales.
4. Dado que las células mononucleares circulantes (PBMC) no están
activadas (están en fase de ciclo celular G0-G1), no presentan
proteínas relacionadas con la activación. Si en un extracto de PBMC
aparecen dichas proteínas (c-MYC), éstas se correlacionarán con la
presencia de células tumorales circulantes (habitualmente en fase
G2-M). La detección de c-MYC sería un marcador de dichas células
(CTCs).

24 Eduardo García-Rico
 2. Hipótesis y Objetivos

5. La presencia de mutaciones en el ADN modifica de forma específica

su conformación espacial en condiciones definidas. La
espectroscopia SERS podría reflejar dichos cambios, siendo
aplicable a la detección de mutaciones en el ADN circulante tumoral
(ctDNA)

2.2 Objetivo General

Desarrollar nuevas estrategias tecnológicas portables, sensibles y específicas

capaces de detectar y caracterizar células tumorales circulantes (CTCs) y proteínas
específicas derivadas de las mismas, orientadas a características universales del
cáncer, así como capaces de detectar ácidos nucleicos (ctADN) portadores de
mutaciones específicas de tumor.

2.3 Objetivos Específicos

1. Desarrollar de un método rápido, simple y sin marcajes, que

combinando la técnica SERS con un análisis discriminante de
mínimos cuadrados (PLS-DA), permita el análisis de fragmentos
de ADN largos con una sensibilidad de una sola base y demostrarlo
en la detección de mutaciones puntuales típicas de cáncer de colon
en el gen K-RAS
2. Detectar la presencia de c-MYC derivado de células tumorales
circulantes mediante la construcción de un receptor capaz de
transducir dicha presencia mediante modificaciones específicas en
un espectro SERS
3. Correlacionar la cuantificación de la proteína c-MYC derivada del
procedimiento anterior, con la presencia de células tumorales, tanto
de líneas celulares como de muestras de sangre real de pacientes
con cáncer, demostrando la posibilidad de detectar dichas células

Eduardo García-Rico 25
 Biopsia Líquida

mediante un procedimiento de discriminación genérico o universal

(amplificación de c-MYC)
4. Diseñar un dispositivo microfluidico de flujo 3D, donde todas las
ópticas estén integradas en el chip, para la cuantificación de
fluorescencia de CTCs en muestras reales de cáncer de mama.
5. Detectar células tumorales circulantes aprovechando la propiedad
universal de las células malignas denominada efecto Warburg.
6. Demostrar la posibilidad de manipular el efecto Warburg mediante
la modificación de la concentración de oxígeno en el microambiente
tumoral y en la muestra de biopsia líquida.

26 Eduardo García-Rico
 3 ESTUDIO I
BIOPSIA LÍQUIDA DE ÁCIDOS NUCLEICOS RESUMEN

INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN

CONCLUSIONES

INFORMACIÓN
SUPLEMENTARIA
3.1 Clasificación Conformacional de las
Mutaciones Puntuales de K-Ras REFERENCIAS
mediante SERS para el Diagnóstico
del Cáncer
 Biopsia Líquida

3.1.1 Resumen

La determinación de la existencia de mutaciones puntuales en los oncogenes RAS

(KRAS, NRAS, HRAS) y menos habitualmente BRAF, es una práctica habitual en
oncología clínica, previa a la elección de tratamiento en enfermedades como el
cáncer colorrectal. De hecho, el tratamiento mismo se basa en el resultado de dicha
determinación. Las técnicas existentes para dicho análisis, basadas en PCR o
secuenciación, requieren una infraestructura compleja, personal especializado y,
habitualmente, su centralización. En este capítulo se presenta el diseño teórico y
experimental de una nueva técnica basada en la tecnología SERS (Surface
Enhanced Raman Spectroscopy) y la correspondiente quimiometría necesaria para
la detección de mutaciones. El procedimiento de análisis se basa en la hipótesis de
que las mutaciones puntuales imponen conformaciones espaciales específicas a la
molécula (transcrito) de K-RAS (141 pares de bases). Los resultados obtenidos
muestran que dicha metodología es capaz de identificar de modo inequívoco la
clasificación de las diferentes mutaciones que habitualmente aparecen en dichos
genes. Además de ser una metodología precisa, añade la ventaja, frente a las
tecnologías existentes, de ser sensible, rápida, directa y barata, por lo que se adecúa
a las necesidades actuales de validación analítica y clínica de las biopsias líquidas
de ctDNA.

3.1.2 Introducción

[Link] Los oncogenes RAS

La familia RAS de proto-oncogenes está formada por tres genes funcionales con
estructura y secuencia similares (H-Ras, N-Ras y K-Ras) (1). En particular, la
proteína de unión a GTP codificada por K-Ras se sitúa en el centro de muchas vías
de transducción de señales, controlando mecanismos de crecimiento y
diferenciación celular (2). Las mutaciones de un solo nucleótido en K-Ras (siendo
los codones 12 y 13 del exón 2 los sitios mutados más frecuentemente, y siendo el
codón 17 del mismo exón mutado infrecuentemente pero también relevante

28 Eduardo García-Rico
 3. Estudio I

clínicamente) (3) producen respuestas altamente oncogénicas con mayor incidencia

en el cáncer colorrectal, pulmonar y en el cáncer de páncreas (4). En el cáncer
colorrectal actualmente se aplican tratamientos específicos ajustados al estado
mutacional de K-RAS y N-RAS (5), siendo obligada su determinación en esta
enfermedad (según las guías del National Comprehensive Cancer Network) en el
momento del diagnóstico. Por lo tanto, la determinación de las mutaciones
puntuales K-RAS y N-RAS es esencial tanto en el diagnóstico, pronóstico y
tratamiento del cáncer colorrectal (5). En el futuro, con tecnologías más accesibles
y generalizables, posiblemente tendrá un papel también en la monitorización de los
tratamientos, en el seguimiento y en el diagnóstico de recidivas.

[Link] Análisis de mutaciones puntuales mediante SERS (Surface Enhanced

Raman Spectroscopy)

Durante los últimos años, la caracterización de ácidos nucleicos (ANs) mediante la

técnica sin marcaje denominada SERS ha evolucionado rápidamente (6). Sin
embargo, la detección de mutaciones puntuales ha estado hasta ahora limitada a
pequeños fragmentos (secuencias menores de 25 nucleótidos, 25 nt) (6). En estos
fragmentos cortos, los cambios introducidos en el espectro SERS de ácidos
nucleicos por la sustitución de una sola base están principalmente relacionados con
el incremento relativo de intensidad de las características vibracionales adscritas a
la nueva base en relación con las asociadas a la base eliminada (6). Sin embargo,
para grandes fragmentos de ANs esta clase de cambios vibracionales, introducidos
en el espectro SERS por una sola mutación afectando a una sola base, es
indetectable. Afortunadamente, el espectro SERS de ANs no es la suma meramente
ponderada de las contribuciones individuales de cada subunidad estructural (7).

El hecho de que la composición de las bases juegue el papel principal en la

definición del perfil vibratorio el AN, estará indicando, además, que las estructuras
secundarias y terciarias que resultan del enlace de hidrógeno, apilamiento de anillos
y plegado de cadena, estarían también confiriendo una segunda capa de
diferenciación espectral característica. En condiciones no desnaturalizantes,
fragmentos de ADN de cadena sencilla (ssDNA) pueden doblarse en geometrías
conformacionales de tres dimensiones (3D) únicas, moldeadas por interacciones

Eduardo García-Rico 29
 Biopsia Líquida

intramoleculares y delineadas por la secuencia de la nucleobase específica de la

molécula considerada (8).

Llamativamente, incluso las sustituciones de una sola base pueden producir

cambios en la estructura secundaria que pueden llegar a ser detectables mediante
técnicas de monitorización de la movilidad diferencial de fragmentos de ADN en
electroforesis en gel no desnaturalizante (9). Precisamente esta característica sentó
las bases para el desarrollo de la técnica conocida como polimorfismos de
conformación de una sola hebra (SSCP), ampliamente utilizado en biología
molecular como tecnología de análisis mutacional (9-10). La longitud de la cadena
sencilla (ssDNA) juega un papel clave en la sensibilidad de la técnica de SSCP para
discriminar el cambio de una sola base, siendo aproximadamente entre 100 a 600-
nt (nucleótidos) el rango de tamaño óptimo (10). De hecho, mientras que la
sustitución de una sola base tiene menor probabilidad de perturbar
significativamente el estado de plegamiento general en una cadena (ssDNA)
excesivamente larga, por su parte, los fragmentos demasiado pequeños muestran
una capacidad reducida para formar estructuras estables y reproducibles (11).

3.1.3 Objetivos

En este trabajo, se explota el concepto de SSCP para desarrollar un método rápido,

simple y sin marcajes, que combina la técnica SERS con un análisis discriminante
de mínimos cuadrados (PLS-DA), para discriminar fragmentos de ADN largos con
una sensibilidad de una sola base . Este enfoque de SERS sin marcaje, basado en el
cambio conformacional del ADN inducido por una mutación puntual en lugar de
en la composición de base, supera las limitaciones intrínsecas de los métodos
directos de SERS que se habían notificado previamente por lo que se limitaban a
la detección de mutaciones puntuales en cadenas muy cortas, limitando de este
modo su utilidad en la práctica biológica o clínica real.

Este trabajo se plantea probar el potencial de esta técnica mediante el uso

experimental de fragmentos largos (141-nt) del gen K-Ras (12) conteniendo las
diferentes mutaciones puntuales clínicamente relevantes y, por otro lado apoyar los
resultados experimentales con modelos teóricos (13).

30 Eduardo García-Rico
 3. Estudio I

Figura 10: Espectros SERS obtenidos bajo distintas concentraciones de sal.

Figura 1: Espectros SERS de los fragmentos de ssADN de 141 nt (WT141) a baja y alta concentración
de sal.

3.1.4 Resultados y discusión

El denominado ssDNA largo consiste en una cadena lineal de nucleótidos de

diámetro delgado y alta flexibilidad que, en condiciones fisiológicas, normalmente
forma dominios apilados intercalados con otros dominios de configuración aleatoria
espiral (14). Sin embargo, en una solución baja en sal (≤ 2 mM NaCl), las
repulsiones electrostáticas dominantes entre los fosfatos cargados negativamente de
la columna vertebral de la molécula evitan en gran medida que las nucleobases de
ssDNA, con secuencia relativamente aleatoria, se aproximen y se emparejen
mediante enlaces de hidrógeno (15).

Eduardo García-Rico 31
 Biopsia Líquida

Esta reorganización estructural se refleja claramente en el espectro de SERS de una

hebra 141-nt (tipo salvaje, WT141) (Figura 10). Este fue obtenido mediante la
adición de cantidades equimolares de ssADN, bien disuelto en agua Milli-Q o en
PBS 0,1 M, a un coloide constituido por AgNP @ Sp (Figura S1).

Figura 11: Espectro de extinción de los coloides AgNP, espectro SERS y Potencial.
Figura S1: (Información Suplementaria) (A) Espectro de extinción de los coloides AgNP @ Sp
(LSPR centrado a aproximadamente 393 nm). (B) Antecedentes El espectro SERS de AgNP @ Sp
agregado con MgSO-4 solución acuosa 0,1 M (MgSO-4 actúa como un electrolito "pasivo" que
promueve la agregación de nanopartículas sin adsorber sobre la superficie metálica) (14)-
informacion suplementaria-La característica intensa en ca. 241 cm-1 se asigna a υ (AgCl). (C) ζ
diagrama de distribución potencial de AgNP @ Sp (el potencial corresponde a 41,0 ± 1,5 mV). El
pH coloidal a granel es ~ 6. (D) micrografía TEM representativa de los coloides AgNP @ Sp
preparados evaporando aprox. 100 μl de dispersión coloidal diluida sobre rejillas de cobre
recubiertas con formvar. (E) Histograma de diámetros de nanopartículas (22,5 ± 5,0 nm).

Estos incluyen, entre otros, el desplazamiento hacia el rojo de los modos de

"estiramiento" del carbonilo a aproximadamente 1650 cm-1, lo cual es informativo
de la formación de enlaces de hidrógeno de Watson-Crick, así como el
desplazamiento al azul de los modos de "respiración" en anillo (ring stretching
vibration) a aproximadamente. 680, 730 y 790 cm -1 (correspondientes a los
residuos de guanina, adenina y citosina + timina, respectivamente) que están
asociados con el apilamiento de bases (6). Por lo tanto, cuando se disuelven
fragmentos de ssDNA en la solución salina AgNP @ Sp (NaCl) <1 mM, dichos
fragmentos se configuran inicialmente en formas alargadas (15), tras lo cual son

32 Eduardo García-Rico
 3. Estudio I

adsorbidos en las nanoesferas catiónicas de la solución, formando una envoltura en

torno a las mismas. Estas actúan como agentes de compactación (17).

Figura 12 : Plegamiento de la molécula de ADN

Figura 2 Dinámica molecular del proceso de plegamiento de la molécula de ADN sobre la
nanopartícula (WT141) a baja concentración de sal. Se representa la energía electrostática frente al
tiempo en tres condiciones geométricas iniciales.

El tamaño relativo de la cadena en relación con el tamaño de la nanopartícula debe

jugar un papel importante en la determinación de la conformación final del ADN
sobre el objeto en 3D. Esto se refleja bien en las simulaciones de dinámica
molecular (MD) de la unión de largos segmentos 141-nt y cortos 20-nt a
nanopartículas catiónicas de aproximadamente 23 nm de diámetro. La Figura 12
muestra la energía electrostática de los sistemas de cadena 141-nt / AgNP @ SP a
baja concentración de sal en función del tiempo.

Se estudiaron un total de seis geometrías de partida, que se diferenciaban por la

posición de la nanopartícula con respecto al eje de la secuencia de una sola cadena
(desplazamiento 0 - 250 Å desde el centro hasta el final). Como puede verse, la
energía electrostática disminuye rápidamente en el tiempo con un decaimiento
aproximadamente exponencial para todas las geometrías investigadas. Las
configuraciones representativas extraídas de una trayectoria demuestran que la
meseta energética corresponde a estados en los que toda la hebra única se envuelve
completamente sobre la superficie de la nanoesfera. Este comportamiento debe ser
comparado con simulaciones equivalentes realizadas con una alta concentración de
sal (Figura S3),

Eduardo García-Rico 33
 Biopsia Líquida

Figura 13: Simulación de la adsorción del ssDNA de 141 pb

Figura S3: Simulación dinámica molecular del proceso de adsorción y envoltura de ssDNA 141-nt
a alta concentración de sal. La diferencia en la energía electrostática se representa en función del
tiempo para tres geometrías de arranque diferentes. La simulación correspondiente a un
desplazamiento de 0 Å se repitió tres veces (curvas rojizas).

mostrando que, en este caso, se requieren tiempos mucho más largos para converger
la energía. En un caso (offset = 200 Å), el proceso de envoltura no se completó en
el tiempo total de simulación (10 μs), reflejando en este caso un proceso de
adsorción sustancialmente menos eficiente. Por el contrario, el proceso de unión de
ssDNA de 20-nt a baja concentración de sal resultó ser sencillo, con las hebras
cortas rápidamente relajándose sobre la superficie inmediatamente después de
establecer interacciones favorables con las cargas positivas superficiales (Figura
S4).

Figura 14: Simulación de la adsorción de ssDNA de 20 pb.

Figura S4: Simulación de dinámica molecular del proceso de adsorción y envoltura de ssDNA20-nt
a baja concentración de sal. Se informan configuraciones representativas para el número de
ejecución 3.

34 Eduardo García-Rico
 3. Estudio I

Se realizó una clasificación de fragmentos de ssADN con distintas mutaciones

puntuales coincidentes con las descritas en la práctica clínica mediante SERS
directo (sin marcajes).

Figura 15: Secuencia de RAS.

Figura S5: Secuencia de RAS. En el azul, el fragmento 141-nt portador de los puntos de
mutación en los codones 12, 13 y 17 (G12, G13 y S17, respectivamente) que se investigó por
SERS.

El procedimiento se realizó en fragmentos de 141-nt ssDNA , correspondientes al

tamaño del transcrito, que se extiende desde el final de intrón 1 a exón 2 del
cromosoma 12 (Figura S5).

Todas las secuencias de 141 nt se diseñaron considerando los sitios de

reconocimiento para diferentes enzimas endonucleasas de restricción, tales como
CviAII y Hpy166II. Los puntos de mutación se seleccionaron de acuerdo con las
guías clínicas (18). La primera muestra (WT141) corresponde a la secuencia de tipo
salvaje mientras que los cuatro restantes (MTx141, donde x = 1 a 4) contienen de
una a tres mutaciones diseminadas en los codones 12, 13 y 17 (Tabla S1).

Por otra parte, se analizaron de la misma forma dos conjuntos de fragmentos de

ADNss homólogos más cortos (20-nt y 35-nt), incluyendo la región del codón 12-
17 (Tabla S1 y Tabla S2) para evaluar el impacto de la longitud de la hebra sobre
la capacidad de discriminar sustituciones de bases.

Eduardo García-Rico 35
 Biopsia Líquida

Tabla 4: Secuencias de bases de ADN de una sola cadena de 20 y 141 nt (Tabla S1)

ssDNA Base sequence (5`-3`)

WT20 T GGT GGC GTA GGC AAG AGT G

MT120 T GAT GGC GTA GGC AAG AGT G

MT220 T GAT GAC GTA GGC AAG AGT G

MT320 T GAT GGC GTA GGC AAG AAT G

MT420 T GAT GAC GTA GGC AAG AAT G

WT141 ┌┌┌┌┌┌T GGT GGC GTA GGC AAG AGT G┐┐┐┐┐┐

MT1141 ┌┌┌┌┌┌T GAT GGC GTA GGC AAG AGT G┐┐┐┐┐┐

MT2141 ┌┌┌┌┌┌T GAT GAC GTA GGC AAG AGT G┐┐┐┐┐┐

MT3141 ┌┌┌┌┌┌T GAT GGC GTA GGC AAG AAT G┐┐┐┐┐┐

MT4141 ┌┌┌┌┌┌T GAT GAC GTA GGC AAG AAT G┐┐┐┐┐┐

MT5141 ┌┌┌┌┌┌ T TGT GGC GTA GGC AAG AGT G ┐┐┐┐┐┐

MT6141 ┌┌┌┌┌┌ T CGT GGC GTA GGC AAG AGT G ┐┐┐┐┐┐

86 nt C12 C13 C17 35 nt

36 Eduardo García-Rico
 3. Estudio I

Tabla 5: Secuencias de bases de ADN de cadena única de 35 nt (Tabla S2)

ssDNA Base sequence (5`-3`)

WT35 CT GGT GGC GTA GGC AAG AGT GCC TTG ACG ATA CAG

MT135 CT GAT GGC GTA GGC AAG AGT GCC TTG ACG ATA CAG

MT235 CT GTT GGC GTA GGC AAG AGT GCC TTG ACG ATA CAG

MT335 CT GGT GAC GTA GGC AAG AGT GCC TTG ACG ATA CAG

MT435 CT AGT GGC GTA GGC AAG AGT GCC TTG ACG ATA CAG

MT535 CT TGT GGC GTA GGC AAG AGT GCC TTG ACG ATA CAG

MT635 CT CGT GGC GTA GGC AAG AGT GCC TTG ACG ATA CAG

MT735 CT GCT GGC GTA GGC AAG AGT GCC TTG ACG ATA CAG

MT835 CT GGT GGC GTA GGC AAG AAT GCC TTG ACG ATA CAG

En particular, la interacción electrostática eficiente entre el esqueleto de fosfato

cargado negativamente del ADN y los ligandos de espermina, unidos a la superficie
metálica, permite la rápida agregación de nanopartículas en agrupaciones estables
y altamente SERS-activas en suspensión, dando lugar a espectros SERS intensos,
bien definidos y reproducibles, independientemente de la longitud de la cadena (6,
16).

La Figura 16 muestra los espectros de SERS resultantes de muestras de ssDNA de

20-nt. Los espectros fueron corregidos en la línea base y normalizados a la banda
de extensión de fosfato a aproximadamente 1089 cm-1, que es en gran parte
insensible al apilamiento de la base o a la temperatura (19).

Eduardo García-Rico 37
 Biopsia Líquida

Figura 16: Resultados promedio de 54 espectros.

Figura S6: SERS de WT20 y los espectros de SERS MT120-WT20, MT220-WT20, MT320-WT20
y MT420-WT20 restablecidos digitalmente. Antes de la resta, todos los espectros se normalizaron a
la banda νPO2- a aprox. 1089 cm -1. Los espectros ilustrados se obtienen promediando 54 espectros
de 18 réplicas independientes por muestra (3 mediciones por cada réplica). La concentración de
ADN se mantuvo constante a 2 μg por 100 μl de coloides. La figura incluye una asignación tentativa
vibratoria de las principales bandas SERS de WT20 en AgNP @ Sp coloides sobre la base de
nuestros trabajos anteriores (1, 16) y los datos presentados en la literatura (17).

Las firmas (patrones) SERS de estos fragmentos cortos presentan diferencias

evidentes, que están dominadas en su mayor parte por alteraciones de las
intensidades relativas atribuibles a la composición de base heterogénea. La
comparación directa de los datos SERS a través de la espectroscopia SERS de
diferencia (Figura S6) ayuda a visualizar estos cambios, generando espectros de
diferencia SERS que contienen características positivas y negativas,
respectivamente asociadas con las nucleobases introducidas y reemplazadas.

La identificación de la sensibilidad de una sola base se logra tal como se ha descrito

previamente en la literatura (6). Sin embargo, la capacidad de discriminación del

38 Eduardo García-Rico
 3. Estudio I

SERS directo se evidencia claramente cuando se realiza un análisis discriminante

de mínimos cuadrados (PLS-DA), método de clasificación bien establecido y
estadísticamente robusto, sobre los conjuntos de datos generados por SERS, a partir
de las muestras de ssDNA de 20 nt. De hecho, las predicciones de clase calculadas
por el modelo supervisado por PLS-DA y que abarcan 54 espectros por muestra
(Figura S7) muestran que no sólo los grupos de muestras de ssDNA de 20-nt con
diferente composición base (WT20, MT120, MT220 y MT420) se pueden
distinguir con sensibilidad y especificidad del 100%, pero también para fragmentos
que difieren sólo en la secuencia de bases (MT320 y MT420). En este último caso,
las diferencias espectrales son más sutiles que para muestras con diferente
composición base; sin embargo, PLS-DA asigna las muestras en dos clases
estadísticamente cerradas pero aún diferenciables. Esto es consistente con los
estudios Raman normales que mostraron cómo la secuencia de la base
potencialmente puede añadir una capa adicional de diferenciación espectral entre
las firmas Raman de ADN con idéntica composición de base, pero diferente
estructura primaria (7).

Figura 17: Espectros SERS a 25ºC.

Figura 3: Espectro SERS de fragmentos de A) 20 nt y B) 141 nt de ssADN. Se trata del promedio
de 54 espectros de 18 réplicas por muestra (tres medidas por réplica). Ambas soluciones a 25 grados
C.

Eduardo García-Rico 39
 Biopsia Líquida

Figura 18: PLS-DA. Cada espectro es un punto.

Figura S7: PLS-DA gráfico de las variables latentes (LV) de los primeros tres LV obtenidos a partir de SERS
datos espectrales de 20 nt ssDNA muestras (54 repeticiones por muestra). Cada espectro está representado
por un punto de datos.

La extensión del ssDNA de 20-nt a 35-nt produjo resultados muy diferentes. La

desaparición del polimorfismo de una sola base sobre dicha longitud de cadena
suprime la capacidad del método SERS directo para detectar la sustitución de la
base, independientemente del tipo y posición de la mutación (Figura S8). Por
consiguiente, el modelo PLS-DA ya no clasifica las muestras en clases
estadísticamente diferentes (Figura S8B). Llamativamente, cuando las mutaciones
puntuales se incluyen en fragmentos de 141 nt, el espectro SERS revela de forma
consistente perfiles vibratorios bien distinguibles (Figura S9), proporcionando
potencia discriminatoria total y con sensibilidad de base única (Figura S7 y S8).

40 Eduardo García-Rico
 3. Estudio I

Figura 19: Variables latentes.

Figura S8: Se representan las tres primeras variables latentes (LV). Cada espectro es denotado por
un punto en una elipse que representa el 95% de confianza.

Eduardo García-Rico 41
 Biopsia Líquida

Surge una banda de mediana intensidad a aproximadamente 644 cm-1, que se ha

atribuido al estirado de anillo A + G débilmente acoplado con vibraciones de
desoxirribosa (19). Esta banda es típica de una conformación C3'-endo / anti-
nucleósido, un marcador espectral asociado a una forma A del ADN, (8). Esta, sin
embargo, todavía coexiste con la intensa banda de "respiración" (breathing-ring) de
anillo G a aproximadamente ~ 684 cm -1, característica de la conformación C2'-
endo / anti de la columna vertebral de la forma B (10, 22). Este dato muestra la
existencia de una transición desde la geometría de la columna vertebral
regularmente ordenada de tipo B, tal como se revela en el ssDNA corto de 20-nt y
35-nt (Figura 3 y Figura S8A), a un conjunto más amplio de diferentes
conformaciones para 141-nt fragmentos. Un cambio similar en la conformación del
ADN se pudo objetivar en los estudios Raman de empaquetamiento viral del
bacteriófago ΦX174 a partir de su genoma de cadena sencilla en solución libre de
proteínas (19). Del mismo modo, podemos sugerir que las restricciones geométricas
impuestas por la interacción con nanopartículas catiónicas pueden reducir el grado
de orden de la estructura secundaria en el ADNs largo. Por otra parte, de manera
diferente a lo observado para las hebras cortas, los cambios espectrales en el análisis
SERS de los fragmentos de ssADN de 141-nt ssDNA no se muestran únicamente
como alteraciones en las intensidades relativas de bandas, sino también como
importantes variaciones de pico, anillos de estiramiento C + T a aproximadamente
1180 cm-1 y otras variaciones asociadas a carboxilo (aproximadamente centrado
en 1640 cm-1).

También se realizó un análisis PLS-DA en estos espectros que condujeron a la

clasificación de los cinco diferentes fragmentos.

Para definir el impacto de la sustitución de una sola base en los fragmentos ssADN
largos (141 nt ) se procedió al análisis directo mediante SERS de distintas variantes
en el codón 12 (específicamente GàA, GàT y GàC, Figura S10). Del mismo modo,
se utilizó el análisis PLS-DA para establecer diferencias estadísticamente
significativas entre los espectros SERS. Para dichas secuencias con una sola base
de sustitución, los resultados mostraron un 100% de sensibilidad y especificidad
(Figura S11). El resultado del análisis vibratorio es consistente con la imagen
proporcionada por las simulaciones MD. En esta, los filamentos cortos se extienden
sobre la nanopartícula de una manera lineal, percibiendo la superficie metálica
como casi plana. Bajo este escenario, las diferencias conformacionales entre las

42 Eduardo García-Rico
 3. Estudio I

hebras se minimizan y la discriminación entre sus perfiles SERS correspondientes

se basa en gran medida en las contribuciones ponderadas de las nucleobases
individuales. De manera diferente, cuando la longitud del ssDNA se agranda hasta
el punto en el que se fuerza al fragmento a doblarse alrededor del nanobjeto, en ese
punto se pierde la homogeneidad geométrica de la hebra, lo cual se refleja en los
cambios en los espectros SERS dichos fragmentos.

Como control, se realizó un análisis de polimorfismo de conformación de una sola

hebra (SSCP) con los fragmentos de 141 nt (Figura S12).

Figura 20: Electroforesis SSCP.

Figura S12: Análisis de fragmentos 141 nt ssDNA WT141, MT1141, MT2141, MT3141, y MT4141
en diferentes condiciones experimentales. (A) 60 ng / μl de ADN tratado térmicamente, 3 horas a
150 V; (B) 40 ng / μl de ADN tratado térmicamente, 3 horas a 150 V; (C) 20 ng / μl de ADN tratado
térmicamente, 3 horas a 150 V; y (D) 20 ng / μl de ADN no tratado térmicamente, 10 minutos a 34
V y las siguientes 6 horas a 62 V.

La electroforesis SSCP de las cadenas de ADN es extremadamente sensible a un

gran conjunto de parámetros experimentales que se optimizan rutinariamente de
una manera empírica (9-10). En consecuencia, se llevaron a cabo varias medidas de
SSCP en diferentes condiciones, lo que permitió finalmente resolver dobles y triples
puntos de mutación, pero no sustituciones de una sola base (Figura 11D).

Aunque no se puede descartar que un proceso de optimización más extendido

permitiría la identificación de un conjunto específico de condiciones

Eduardo García-Rico 43
 Biopsia Líquida

experimentales más adecuadas para la discriminación exitosa de SSCP de todas las

secuencias investigadas, los resultados que aquí se presentan demuestran
claramente que la eficacia del método propuesto (SERS) para diferenciar las
mutaciones puntuales es mucho más simple y reproducible. Para definir esta última,
se analizó la posible dependencia de la sensibilidad discriminativa del método
SERS de variables experimentales clave. Específicamente, y dado que el agente
de compactación (nanopartículas) y la fuerza iónica son parámetros fijos en los
experimentos SERS descritos, se seleccionó la temperatura (T), como la variable
experimental ya que T es bien conocido por afectar a la estructura ordenada de largo
ssDNA (21). Los espectros de SERS ilustrados en la Figura 3B y estadísticamente
clasificados en la Figura 19 se obtuvieron mezclando partes alícuotas de soluciones
de ssDNA y coloides a 25º C. Por otra parte, cuando las soluciones de ssDNA
fueron previamente tratadas térmicamente a 60º C durante 15 minutos y luego
directamente añadidas a los coloides catiónicos (mantenidos a 25º C), se observó
una disminución general de la eficacia de la discriminación (22). En consecuencia,
la sensibilidad se recupera en gran medida cuando los fragmentos tratados
térmicamente se mezclan con coloides a 4º C. De hecho, es esperable que las bajas
temperaturas favorezcan la compactación eficiente del fragmento de ADN (21)
sobre la superficie metálica. En cualquier caso, vale la pena destacar que los perfiles
espectrales SERS no sufrieron alteraciones importantes sobre tales cambios de
temperatura grandes (Figura S13). Esto indica que la interacción electrostática de
la cadena flexible ssDNA con nanopartículas catiónicas sigue siendo la principal
fuerza motriz que conduce a la estructura final de mayor orden, por lo tanto
proporcionando al método SERS una alta robustez frente a la variabilidad intrínseca
de condiciones de prueba normales.

3.1.5 Conclusiones

En este trabajo se ha desarrollado una nueva estrategia basada en la técnica SERS

sin marcaje para la detección de mutaciones puntuales en grandes fragmentos de
ADN. Esta metodología recoge el concepto en el que también se basa la técnica de
polimorfismo de conformación de una sola hebra (SSCP), explotando los grandes

44 Eduardo García-Rico
 3. Estudio I

cambios conformacionales que las sustituciones de una sola y múltiples bases

imponen a las cadenas largas de una sola cadena.

El potencial de esta técnica sensible, rápida, directa y barata para el diagnóstico se

demostró en la clasificación inequívoca de mutaciones clínicamente relevantes en
el oncogén K-RAS. Es preciso validar, tanto experimental como clínicamente en
ensayos prospectivos, su aplicación clínica como biopsia líquida. En la actualidad
aún no hay ninguna tecnología validada.

3.1.6 Información suplementaria

[Link] Materiales

Todos los materiales se han seleccionado de la más alta pureza disponible y

obtenida de Sigma Aldrich (St. Louis, Estados Unidos). Se compraron
oligonucleótidos de ssDNA 20-nt y 35-nt purificados por HPLC de Eurofins
Genomics (Esbjerg, Dinamarca). El ADN de 141 nt purificado por HPLC se
adquirió de ATDBio (Southampton, RU). Se prepararon disoluciones madre de 200
μM de cada fragmento de ssDNA disolviéndolas en agua Mili-Q (18,2 MΩ.cm a 25
° C) y se almacenaron a -20 ° C.

[Link] Preparación de Nanopartículas de Plata Cargadas Positivamente (AgNP

@ Sp)

Se sintetizaron nanopartículas de plata revestida con espermina (AgNP @ Sp)

según descripciones previas (1). 20 μL de una solución de AgNO3 0,5 M y 7 μl de
una solución de tetrahidrocloruro de espermina 0,1 M se añadieron progresivamente
a 10 ml de agua Milli-Q. A continuación, se añadieron rápidamente 250 μl de una
solución 0,01 M de NaBH4 recién preparada bajo agitación vigorosa a la mezcla.
El medio de reacción viró rápidamente a amarillo profundo, indicando la formación
de nanopartículas de plata. La mezcla se agitó suavemente durante otros 5 minutos

Eduardo García-Rico 45
 Biopsia Líquida

antes de almacenarse durante la noche en la oscuridad. El sedimento visible en la

parte inferior del vial fue eliminado de la muestra. Los coloides AgNP @ Sp así
preparados proporcionan normalmente una respuesta plasmónica con una excelente
reproducibilidad de lote a lote (sólo pueden requerirse ajustes menores de la
concentración total de nanopartículas). Es importante destacar que los viales de
vidrio utilizados para la reacción y el almacenamiento de las partículas se
recubrieron previamente con polietilenimina (PEI, promedio de Mw
aproximadamente 25.000), mediante inmersión en una solución acuosa de PEI al
0,4% v / v (durante la noche), seguido de lavados con agua fresca Mili-Q y secado
con N2. El PEI infiere una carga positiva a las superficies de vidrio que impide la
deposición de las nanopartículas de plata catiónicas. La concentración final de
nanopartículas (aproximadamente 1,0 nM) se calculó de acuerdo con la ley de
Lambert-Beer usando un coeficiente de extinción de 54,8 x 108 M-1 cm-1 obtenido
de la bibliografía (2).

[Link] Mediciones SERS

Las muestras de SERS se prepararon mezclando 150 μl de AgNP @ Sp 1,0 nM

con diferentes alícuotas de ssDNA a concentraciones fijas (0,31, 0,54 y 4,37 mg /
ml respectivamente para 20, 35 y 141 m), hasta una concentración final de ssDNA
de 0,02 mg / ml para todas las secuencias. Las soluciones acuosas de secuencias de
141 nt se calentaron a 60 ° C durante 15 minutos antes de su adición a los coloides.
Mediante este suave tratamiento, se facilita la extensión de la cadena y el ADNss
tiende a una conformación más lineal, tal como se describió previamente (3). En el
caso de muestras preparadas utilizando AgNP @ Sp frıo, los coloides se
mantuvieron durante 1 h en el frigorífico (4 grados C) antes de la adición de
secuencias de 141 nt(4). Todas las muestras se dejaron equilibrar al menos 3 horas
antes de efectuarse las mediciones SERS (5) las bandas SERS muestran algún
grado de fluctuaciones en términos de intensidades relativas en torno a los primeros
60 min tras la adición de ADN a los coloides) Se realizaron 18 réplicas y se midió
tres veces cada una(es decir, se adquirieron 54 espectros por muestra de ssDNA).
Se ensayaron múltiples lotes de nanopartículas, obteniéndose resultados
consistentes y reproducibles.

46 Eduardo García-Rico
 3. Estudio I

[Link] Análisis SSCP

La técnica denominada "polimorfismo de conformación de una sola hebra" (SSCP)

se aplicó, como control, a la detección de los polimorfismos genéticos en las
secuencias 141-nt mutantes de ADN (MT1 - MT4). Las condiciones para la
electroforesis SSCP deben determinarse experimentalmente (ad hoc) en
condiciones rigurosamente controladas ya que muchos factores pueden influir en
su sensibilidad y su optimización es altamente empírica (6). Se preparó un gel al
8% de acrilamida / bis (formato de gel de 8,6 x 6,7 x 0,1 cm) según publicaciones
previas (7). Brevemente, se mezclaron 2,6 ml de solución de acrilamida al 40% /
bis (37,5: 1), 1,3 ml de TBE 10x, 0,91 ml de glicerol al 100%, 8 ml de agua Milli-
Q, 130 μl de persulfato de amonio al 10% y 13 μL de TEMED El gel se dejó
polimerizar durante aproximadamente 3 horas. En el caso de los tres primeros
conjuntos de medidas (Figura S11A-C), el ADN se desnaturalizó previamente a
95ºC durante 7 minutos y luego se puso en hielo durante unos 5 minutos. Para el
último experimento (Figura S11D), el ADN no fue tratado térmicamente. A
continuación, se mezclaron 5 μl de ADN mutante (60, 40 y 20 ng / μl) con 10 μl de
una solución que contenía formamida al 95% y EDTA 20 mM (pH = 8). Se repitió
el mismo protocolo para el ADN de tipo salvaje y se sometió a electroforesis con 1
× TBE a 4ºC durante 3 y 6 horas, a 150 y 62 V, respectivamente. Una vez
completada la ejecución, el gel se tiñó con SyBr Gold (Molecular Probes - dilución
1: 10,000) en solución tampón TBE 1X durante aproximadamente 20 minutos. La
visualización y las fotografías de los resultados de tinción se tomaron colocando el
gel dentro del transiluminador UV.

[Link] Instrumentación

Para las mediciones SERS se utilizó un microscopio confocal Renishaw InVia

Reflex equipado con un láser de 532 nm. El láser se centró en la muestra coloidal
en suspensión utilizando una lente macro (longitud focal de 30 mm, potencia del
láser en la muestra de 6,9 mW). Todos los espectros de SERS mostrados en las

Eduardo García-Rico 47
 Biopsia Líquida

figuras se obtuvieron promediando las respuestas de SERS de 3 réplicas diferentes

por cada muestra (20 acumulaciones, tiempo de exposición de 10 s). Los espectros
UV-vis se registraron utilizando un espectrofotómetro UV-visible Thermo
Scientific Evolution 201. Las imágenes TEM se adquirieron con un microscopio
electrónico de transmisión JEOL JEM-1011. Las muestras TEM (microscopía de
transmisión) se prepararon por secado de 100 μl de suspensión de coloides sobre
redes de cobre de 200 mallas recubiertas con carbón Formvar. Las mediciones del
potencial ζ (estabilidad de la dispersión coloidal) se realizaron con un Nano
Zetasizer Malvern. Las imágenes digitales del gel de electroforesis se tomaron con
una cámara Chemi XL1.4 (Syngene, Cambridge, UK).

[Link] Métodos computacionales

La regresión de mínimos cuadrados parciales es un procedimiento que se utiliza

para encontrar las relaciones fundamentales entre dos matrices (X e Y), es decir, un
enfoque de variable latente para modelar la estructura de covarianza en estos dos
espacios. Un modelo de PLS trata de encontrar el sentido multidimensional en el
espacio de X que explica la dirección de la máxima varianza multidimensional en
el espacio Y. El Análisis de Componentes Principales (PCA) y el Análisis de
Mínimos Cuadrados Parciales (PLS-DA) fueron llevados a cabo mediante el PLS
Toolbox (Eigenvector Research, Inc., Wenatchee, WA) para MATLAB
(Mathworks, Inc., Natick MA). Ambos PCA y PLS-DA, fueron precedidos por un
paso de preprocesamiento que incluyó Smoothing (SavGol, Filter Width 7),
substracción de la línea de base (ordenadores cuadrados ponderados automáticos,
orden 3), normalización (media MSC) y centrado medio. Todos los espectros se
analizaron en el intervalo de 400-1700 cm -1.

[Link] Análisis de los datos

El análisis multivalente de los datos espectrales SERS para todas las secuencias de
ssDNA se realizó por primera vez por PCA, técnica de clasificación no supervisada.
PCA permite reducir el número de variables en un número menor de características

48 Eduardo García-Rico
 3. Estudio I

clave no correlacionadas conocidas como Componentes Principales (PCs) (8). Estas

PCs representan la mayor diferencia de todo el conjunto de datos y por lo tanto el
primer PC implica la mayor varianza de los datos, el segundo implica la varianza
máxima restante y progresivamente. La máxima diferencia entre las clases de datos
se obtuvo mediante la rotación de los componentes PCA. A continuación, se utilizó
PLS-DA para mejorar aún más las diferencias entre las clases ssDNA. Esta
herramienta de clasificación supervisada se basa en el método de regresión PLS,
donde los conjuntos de variables observadas se modelan mediante variables latentes
(LV). Como el PCA, implica una reducción dimensional de las variables, aunque
en este caso existe un conocimiento previo de los datos. Todos los modelos de PLS-
DA fueron validados por el método de Venetian Blinds (w / 10 divisiones y 1
muestra por división) (9), generalmente utilizado si hay un gran número de objetos
aleatoriamente distribuidos. La calidad y la robustez de los modelos PLS-DA se
evaluaron mediante valores R2 (el coeficiente de determinación R 2 se define como
una proporción "explicada" de la varianza "total" de la variable dependiente) que
oscilaron entre 0.7-0.9 en PLS-DA, así como PCA (valores cercanos a 1 que indica
un buen grado de ajuste). La sensibilidad y la especificidad de los espectros de
SERS clasificados se midieron como sigue;

• Sensibilidad = N muestras asignadas a una clase / muestras verdaderas

pertenecientes a la clase.
• Especificidad = N muestras no clasificadas como pertenecientes a la clase /
N muestras que verdaderamente no pertenecen a la clase.

[Link] Simulaciones de dinámica molecular

El propósito de las simulaciones de dinámica molecular (MD) fue investigar la

adsorción de ADN monocatenario en una nanopartícula cargada positivamente. El
campo de fuerza SIRAH se utilizó para modelar una secuencia de ssDNA
completamente flexible a través de una representación de grano grueso (CG) y
electrostática (10). Se modeló una nanopartícula hueca de aproximadamente 20 nm
de diámetro, ordenándose uniformemente los sitios de interacción ligeramente
repulsivos en la superficie de la esfera (capa interna, ε = 0,2 kcal mol-1, r0 / 2 = 3

Eduardo García-Rico 49
 Biopsia Líquida

Å), mientras que las moléculas de espermina adsorbidas se aproximaron a través de

una distribución móvil de perlas positivamente cargadas (capa externa, ε = 0,2 kcal
mol-1, r0 / 2 = 2,5 Å). La densidad de carga superficial se escogió de tal manera que
se ajustara a un potencial ζ de +40 mV a una concentración de sal monovalente de
0,15 M ya una temperatura de 298 K (1 grupo cargado por 4,52 nm2). La masa
asignada a las perlas de nanopartículas fue de 323,6040 para partículas no cargadas,
imitando una cartografía CG de tres a una (es decir, tres veces la masa de un átomo
de plata) y 50,5875 para partículas cargadas (es decir, una cuarta parte de la masa
de una molécula de espermina). Para asegurar que se conservara una forma esférica
durante las simulaciones, la capa interna de la nanopartícula se mantuvo fija,
mientras que a la capa externa se permitió una flexibilidad radial completa.

Esta configuración de doble capa facilitó la adecuada valoración de los cambios

dinámicos en la distribución de la carga local, los cuales son esenciales para
comprender correctamente las interacciones electrostáticas entre nanopartículas
catiónicas y grupos de fosfato del ADN. Este marco experimental es similar al
descrito por otros autores.

Para las simulaciones dinámicas se utilizó el programa Amber14 (12). Para la

descripción del solvente (13) se empleó modelo de Born-generalizado, y las
concentraciones de sal se valoraron mediante el procedimiento de Debye-Huckel.
La dinámica de Langevin se realizó a la temperatura de 298 K, utilizando un
coeficiente de fricción de 50 ps-1, que imita la frecuencia de colisión de agua. Las
ecuaciones de los movimientos se integraron cada 20 fs (11,12).

Se comenzó con un modelo de la secuencia de ssDNA de 141 nt, inicialmente en

una conformación helicoidal y a una distancia de 50 Å de la superficie de una
nanopartícula situada en el centro de la secuencia (sistema WT141 / AgNP @ SP,
offset = 0 Å). Entonces, se construyeron cinco configuraciones alternativas del
mismo sistema, desplazando el centro de la nanopartícula a lo largo del eje ssDNA
con un tamaño de paso de 50 Å, dando lugar a desplazamientos que van desde 50 a
250 Å. Todas las seis geometrías de partida se simularon con baja concentración de
sal, mientras que sólo las configuraciones correspondientes a un desplazamiento de
0 (tres simulaciones independientes replicadas), 100 y 200 Å se simularon con alta
concentración de sal. Todas las simulaciones se continuaron hasta que el ssDNA
envolvió de forma completa la nanopartícula y en un tiempo de simulación total de

50 Eduardo García-Rico
 3. Estudio I

10 μs. El proceso de adsorción de ssDNA corto (sistema 20-nts / AgNP @ SP) se

estudió, en cambio, colocando 18 fragmentos a una distancia comprendida entre 50
y 200 Å de la nanopartícula en orientaciones y posiciones aleatorias (Figuras 2 y
S2-S3).

[Link] Reproductibilidad de los espectros SERS

La reproducibilidad espectral es un factor clave para determinar la aplicación

exitosa de SERS (sin marcajes) en el análisis de ADN. Se sabe que los coloides
agregados de nanopartículas producen grupos con una actividad SERS alta, pero
con un control limitado sobre su geometría final, tamaño y distribución. Si bien esta
falta de control sobre las características geométricas del conjunto de agregados
afecta a la intensidad absoluta SERS, el impacto sobre el perfil espectral final puede
minimizarse mediante la utilización de promedios (15). Este es el caso del presente
estudio, donde los espectros de SERS son adquiridos interrogando suspensiones
coloidales con una lente de distancia de trabajo larga, adoptando una disposición
experimental donde un gran número de racimos mediados por ADN, bajo
movimiento continuo browniano dentro del volumen de dispersión del objetivo, son
examinados simultáneamente por el láser. Una segunda característica clave que
contribuye a la alta reproducibilidad espectral se basa en el hecho de que el ADN
actúa como un agente de agregación de nanopartículas individuales, así como un
agente estabilizador muy eficaz de los clústeres así formados. De hecho, como se
muestra en los espectros de extinción correspondientes, al alcanzar el equilibrio de
agregación, los coloides agrupados muestran una estabilidad impresionante durante
un largo tiempo con cambios espectrales mínimos. Esto es particularmente
importante, ya que permite medir la muestra en el equilibrio.

Eduardo García-Rico 51
 Biopsia Líquida

Figura 21: Promedio de espectros SERS de los fragmentos de ADN WT y MUT.

Figura S6: SERS de WT20 y los espectros de SERS MT120-WT20, MT220-WT20, MT320-WT20
y MT420-WT20 restablecidos digitalmente. Antes de la resta, todos los espectros se normalizaron a
la banda νPO2- a aprox. 1089 cm-1. Los espectros ilustrados se obtienen promediando 54 espectros
de 18 réplicas independientes por muestra (3 mediciones por cada réplica). La concentración de
ADN se mantuvo constante a 2 μg por 100 μl de coloides. La figura incluye una asignación tentativa
vibratoria de las principales bandas SERS de WT20 en AgNP @ Sp coloides sobre la base de
nuestros trabajos anteriores (1,16) y los datos presentados en la literatura (17).

52 Eduardo García-Rico
 3. Estudio I

Figura 22: Predicción de la pertenencia de espectros a una clase específica.

FiguraS8: (A) espectros de SERS de ssDNA de 35-mer. Todos los espectros se normalizaron a la
banda νPO2- a aprox. 1089 cm-1. Los espectros ilustrados se obtienen haciendo un promedio de 15
espectros DNA. La concentración se mantuvo constante a 2 μ g por 100 μ l de coloides. (B) Análisis
de datos espectrales por PLS-DA y predicha. Cada gráfico predice si una muestra (15 espectros
SERS) pertenece o no a la clase especificada. La línea roja horizontal corresponde al nivel de umbral
de predicción de clase calculado.

Eduardo García-Rico 53
 Biopsia Líquida

Figura 23: SERS de fragmentos de 141 pb, WT y MUT.

FiguraS9: SERS de ssDNA 141 nt (WT, MT1-4). Las mediciones se realizaron mediante la
adición de una alícuota de la solución de ssDNA a los coloides a 25ºC. La concentración de ADN
se mantuvo constante a 2 μg por 100 μl de coloides.

54 Eduardo García-Rico
 3. Estudio I

Figura 24: Espectros SERS de fragmentos de 141pb mut y wt.

Figura S10: espectros SERS de ssDNA 141-nt (WT, MT1, MT5 y MT6). Las mediciones se
realizaron mediante la adición de una alícuota de la solución de ssDNA a los coloides a 25ºC. La
concentración de ADN se mantuvo constante a 2 μg por 100 μl de coloides. Las mutaciones
puntuales en el codón 12 se destacan en rojo.

Figura 25: Análisis PLS-DA a partir de los datos espectrales de MUT en fragmentos de 141 pb.
Figura S11: PLS-DA gráfico de las puntuaciones de la variable latente (LV) obtenido a partir de
datos espectrales SERS de secuencias WT141 y 141-nt que contienen una única mutación en el
codón 12: MT1141 (G → A), MT5141 (G → T) y MT6141 (G → DO). Los gráficos de puntuación
se representan por las tres primeras variables latentes (LV) y cada espectro se denotan por un punto
de datos dentro de elipses de confianza del 95%, su posición es característica para cada característica
del espectro. Los espectros SERS analizados se adquirieron a partir de muestras preparadas
mezclando una alícuota de solución de ssDNA a coloides a 25ºC. Se obtuvieron 54 reproducciones
por muestra en total.

Eduardo García-Rico 55
 Biopsia Líquida

Figura 26: Espectros SERS de fragmentos de 141 pb en distintas condiciones.

Figura S13: Espectro SERS de 141-nt ssDNA. Todos los espectros se normalizaron a la banda νPO2-
a aprox. 1089 cm-1. El análisis de SERS se realizó en diferentes condiciones experimentales: (a) no
se añadió solución de ssDNA tratado térmicamente a coloides a temperatura ambiente, (b) se añadió
solución de ssDNA a 60ºC a coloides a temperatura ambiente, y (c) se añadió solución de ssDNA a
60ºC A coloides a 4ºC. Los espectros ilustrados se obtienen promediando 54 espectros de 18 réplicas
independientes por muestra (3 mediciones por cada réplica). La concentración de ADN se mantuvo
constante a 2 μg por 100 μl de coloides.

56 Eduardo García-Rico
 3. Estudio I

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Roe, A. Roitberg, C. Sagui, R. Salomon-Ferrer, G. Seabra, C.L.
Simmerling, W. Smith, J. Swails, R.C. Walker, J. Wang, R.M. Wolf, X. Wu,
P. A. Kollman, University of California, San Francisco. 2014.

13 (a) A. W. Götz, M. J. Williamson, D. Xu, D. Poole, S. Le Grand, R. C.

Walker, J. Chem. Theory Comput. 2012, 8, 1542-1555; (b) A. Onufriev, D.
Bashford, D. A. Case, J. Phys. Chem. B 2000, 104, 3712-3720.

14 E. Papadopoulou, S. E. J. Bell, Angew. Chem.-Int. Edit. 2011, 50, 9058-

9061.

Eduardo García-Rico 59
 Biopsia Líquida

15 R. Aroca, Surface-enhanced Vibrational Spectroscopy, John Wiley & Sons,

Chichester, 2006.

16 (a) J. Morla-Folch, H.-n. Xie, R. A. Alvarez-Puebla, L. Guerrini, ACS Nano

2016, 10, 2834-2842; (b) A. Torres-Nunez, K. Faulds, D. Graham, R. A.
Alvarez-Puebla, L. Guerrini, Analyst 2016; (c) L. Guerrini, Ž. Krpetić, D.
van Lierop, R. A. Alvarez-Puebla, D. Graham, Angew. Chem.-Int. Edit.
2015, 54, 1144-1148; (d) J. Morla-Folch, H.-n. Xie, P. Gisbert-Quilis, S.
Gómez-de Pedro, N. Pazos-Perez, R. A. Alvarez-Puebla, L. Guerrini,
Angew. Chem.-Int. Edit. 2015, 54, 13650-13654.

17 (a) E. Taillandier, J. Liquier, M. Ghomi, J. Mol. Struct. 1989, 214, 185-

211; (b) J. M. Benevides, S. A. Overman, G. J. Thomas, J. Raman Spectrosc.
2005, 36, 279-299; (c) J. M. Benevides, A. H. J. Wang, G. A. Van der Marel,
J. H. Van Boom, G. J. Thomas, Biochemistry 1989, 28, 304-310; (d) L.
Movileanu, J. M. Benevides, G. J. Thomas, Biopolymers 2002, 63, 181-194;
(e) H. Deng, V. A. Bloomfield, J. M. Benevides, G. J. Thomas, Biopolymers
1999, 50, 656-666; (f) P. Y. Turpin, L. Chinsky, A. Laigle, B. Jolles, J. Mol.
Struct. 1989, 214, 43-70.

60 Eduardo García-Rico
 eral

4 ESTUDIO II
BIOPSIA LÍQUIDA DE PROTEÍNAS
RESUMEN
INTRODUCCIÓN
C-MYC

SERS Y REGLAS DE
SELECCIÓN

OBJETIVOS

MODELO EXPERIMENTAL
4.1 Reglas SERS de Selección de
MUESTRAS REALES
Superficie aplicadas a la
Biopsia Líquida Proteómica en CONCLUSIONES
Muestras Reales: Detección
INFORMACIÓN
eficiente de la Oncoproteína c-
SUPLEMENTARIA
MYC
REFERENCIAS
 Biopsia Líquida

4.1.1 Resumen

Los biomarcadores de cáncer basados en el estudio de sangre periférica, ya sean

proteínas, ácidos nucleicos o las propias células tumorales (biopsia líquida), ofrecen
herramientas extremadamente valiosas para el diagnóstico no invasivo y la
monitorización de tumores. La proteína c-MYC, un factor de transcripción que ha
mostrado estar desregulado en más del 70% de los cánceres humanos, puede ser un
buen candidato para ser utilizado como una sólida firma proteómica para el cáncer.
En primer lugar, por su universalidad y en segundo lugar por ser, su expresión
alterada, independiente de las modificaciones fenotípicas de las células tumorales.
Por otro lado, podría comportarse como un objetivo subrogado de la propia
presencia de células tumorales en sangre periférica, cuando estas son muy escasas.
En este sentido, este trabajo se plantea una nueva estrategia para la detección
indirecta de células tumorales mediante una tecnología rápida, altamente específica
y sensible basada en un ensayo SERS (Surface Enhanced Raman Scattering) para
la cuantificación de la proteína c-MYC en muestras de sangre real. El esquema de
detección se basa en el uso de materiales plasmónicos híbridos específicamente
diseñados y su funcionalización biológica mediante un receptor peptídico selectivo
de cMYC que hace la función de transductor. Se utiliza la propiedad característica
de la proteína c-MYC que consiste en heterodimerizarse con la proteína MAX a
través de una corta región de reconocimiento mutuo. Esta secuencia, propia de
MAX, es la que se utiliza como receptor de c-MYC (péptido receptor). Los eventos
secundarios al reconocimiento de péptido / c-MYC se traducen en alteraciones
medibles del espectro SERS asociado con la orientación molecular del transductor,
de acuerdo con las denominadas reglas de selección superficial. La eficacia del
sensor se demuestra en líneas celulares, donantes sanos y un paciente con cáncer.

4.1.2 Introducción

Las decisiones terapéuticas en oncología se basan clásicamente en la

caracterización clínica de la enfermedad, es decir, el diagnóstico y estadiaje clínico,
y en la caracterización histológica o anátomo-patológica. Actualmente, sin

62 Eduardo García-Rico
 4. Estudio II

embargo, cada vez tiene más peso en dichas decisiones, la caracterización

molecular de los tumores. Son casos paradigmáticos de esto el cáncer de mama,
donde la determinación del estado de amplificación de HER2/neu es obligado, o en
el caso del adenocarcinoma de colon, donde también es obligado el análisis
molecular de los genes K-RAS y N-RAS, como hemos descrito en el capítulo
anterior. Tradicionalmente, estos análisis, incluidos los moleculares, se realizan
sobre tejidos sólidos obtenidos a través de una biopsia invasiva en el momento del
diagnóstico. Sin embargo, las biopsias de tejido son habitualmente difíciles, ya que
son costosas, dolorosas o potencialmente arriesgadas para el paciente.

Así, el desarrollo de métodos no invasivos para detectar y monitorizar tumores es

una necesidad básica en oncología. Los biomarcadores sanguíneos (biopsia líquida)
(1) tienen un potencial considerable para el diagnóstico y la monitorización del
cáncer. Dichas biopsias se basan en la detección de células tumorales circulantes
(CTCs) (2), y ácidos nucleicos tumorales circulantes (3). La detección de proteínas
circulantes relacionadas con los tumores ya se realiza desde hace muchos años. Se
tata habitualmente de glicoproteínas u otra moléculas, los denominados
"marcadores tumorales", bien producidos por los tumores o bien producidos por
otros tejidos como respuesta a la presencia de tumores (CEA, CA125, etc.). Son
marcadores muy poco sensibles y específicos, por lo que su uso no puede ser nunca
independiente del contexto, y no son diagnósticos. Sin embargo, los patrones de
expresión de proteínas intracelulares en las células tumorales circulantes, así como
en las fracciones de células mononucleares de sangre periférica (linfocitos
relacionados o no con la enfermedad) siguen siendo un aspecto en gran parte
inexplorado (1).

Tabla 6: Tumores con amplificación de c-MYC.

Amplificación de MYC

Linfomas no Hoddgkin (y no Burkitt)

Cáncer de mama

Cáncer de Próstata

Eduardo García-Rico 63
 Biopsia Líquida

Cáncer Gastrointestinal

Melanoma

Mieloma Múltiple

Leucemia Mieloide

Neuroblastoma

Carcinoma de pulmón Microcítico y no Microcítico

4.1.3 c-MYC

La proteína c-MYC es un factor de transcripción tipo cremallera de leucina

constituido por una estructura en hélice-bucle-hélice (B HLH ZL) codificado por el
correspondiente gen c-MYC, que desempeña un papel principal en la coordinación
entre el metabolismo y el ciclo celular. Se ha demostrado que su expresión (proteína
y tránscrito) esta elevadas o desreguladas en hasta el 70% de los cánceres humanos,
en general sin alteraciones genómicas estructurales, si bien si puede asociarse a
translocaciones. Este es el caso de la translocación 8-14 que coloca al gen bajo el
control de un promotor muy activo en los linfocitos (4). Se encuentra
sobreexpresión con distintos significados, ya que no siempre la sobreexpresión se
asocia a mal pronóstico o peor comportamiento tumoral. Es el caso del
“adenocarcinoma de colon”, en el cual la sobreexpresión de MYC se asocia a buen
pronóstico. MYC (sus formas L, N o C) se encuentran amplificadas en los tumores
más frecuentes (mama, colon y pulmón) (Tabla 5).

A diferencia de otros proto-oncogenes cuya actividad depende de mutaciones,

truncamientos o fusiones, la oncogenicidad del gen c-MYC suele ser secundaria a
la pérdida de su control transcripcional que conduce, consecuentemente, a la
sobreexpresión y acumulación de la proteína c-MYC (5). Por otra parte, dicha
proteína no está asociada a la expresión de ningún programa fenotípico o funcional
definido, sino que actúa como un "amplificador universal" de genes que ya están
siendo expresados, al incrementar la transcripción en todos los promotores ya
activos (6).

64 Eduardo García-Rico
 4. Estudio II

Por lo tanto, la evaluación de la concentración de esta proteína en extractos de

células de la sangre podría mostrar niveles elevados si en la misma hubiera células
tumorales con c-MYC sobreexpresado en sangre, pudiendo utilizarse de este modo
la cuantificación de c-MYC como criterio (subrogado) para el diagnóstico y la
monitorización de dichas células. Es destacable, además, que la expresión
amplificada de c-MYC se asocia a la “transición epitelial mesenquimal (EMT)
característica que hace a las células tumorales circulantes indetectables por los
procedimientos habituales de detección de marcadores epiteliales.

4.1.4 SERS y reglas de selección

La identificación y cuantificación de proteínas en la sangre se realiza normalmente

usando técnicas inmunológicas estándar tales como Western Blot (WB) o el ELISA.
Aunque robustos, estos métodos son tediosos, largos, caros y, en el caso del WB,
tienen baja sensibilidad.

En los últimos años, la espectroscopia de dispersión Raman amplificada por

superficie (SERS) (7) está suponiendo una excelente alternativa para la detección,
cuantificación y caracterización de biopolímeros. Las intensidades características
del espectro Raman de una determinada molécula son modificadas cuando dicha
molécula se aproxima a una superficie metálica. Estas modificaciones son
conocidas como reglas de selección de superficie.

SERS se ha empleado directamente para la cuantificación ultrasensible de proteínas

priónicas, proteínas fluorescentes amarilla y verde (GFP, YFP) y otras (8-11). La
mayoría de estas determinaciones se realizaron en soluciones de laboratorio, ya que
el análisis de marcadores de proteínas en muestras reales es extremadamente difícil.
Esto se debe tanto a la complejidad intrínseca de las muestras reales, que comprende
una miríada de componentes, como a la baja concentración (~ pg / mL) o a la mala
sección transversal SERS (cross section) (12) de las dianas.

Una posible solución se basa en la funcionalización de materiales plasmónicos con

especies químicas (quimiorreceptores) que posean una elevada sección transversal
de SERS, que, a su vez, mostrasen una alta afinidad de unión y especificidad para

Eduardo García-Rico 65
 Biopsia Líquida

la proteína diana.(12). Así, según este enfoque, la detección se determinaría por los
cambios espectroscópicos en el espectro SERS del quimiorreceptor al unirse con el
blanco (13). A esta estrategia pueden responder moléculas como los "aptámeros",
"anticuerpos" o péptidos, que harían la función de "quimioreceptores" con alta
especificidad. (14). Sin embargo, estas moléculas se caracterizan a menudo por
una bajísima actividad SERS lo cual limita su utilidad para la ultra detección directa
requerida.

Este problema puede ser solventado mediante la modificación del receptor

macromolecular, añadiéndole un motivo terminal con una sección transversal SERS
elevada y que, al mismo tiempo, tenga afinidad por la superficie plasmónica para
mediar la interacción entre el receptor y el sustrato metálico (14).

4.1.5 Objetivos

1- Detectar la presencia de c-MYC mediante la construcción de un receptor

capaz de transducir dicha presencia por las modificaciones específicas que
dicha presencia induciría en su espectro SERS
2- Correlacionar la cuantificación de c-MYC derivada del procedimiento
anterior, con la presencia de células tumorales, tanto de líneas celulares
como de muestras de sangre real de pacientes con cáncer.

4.1.6 Modelo experimental

Se diseñó y preparó un péptido conjugado SERS-activo denominado MB-H capaz

de unirse a c-MYC (proteína) con alta afinidad y selectividad. Por otro lado, se
sintetizaron nanoesferas de silicio homogéneamente recubiertas con nanopartículas
de plata (SiO2 @ Ag), que posteriormente fueron biofuncionalizadas con el
quimiorreceptor (SiO2 @ Ag @ MB-H1). Este "constructo" constituye el sistema
que posteriormente fue utilizado con éxito para la cuantificación de la proteína c-

66 Eduardo García-Rico
 4. Estudio II

MYC, primero en laboratorio, con muestras sintéticas y líneas celulares,

posteriormente con muestras reales de paciente con cáncer y donantes sanos.

Figura 27: Estructura del constructo.

Figura S-Final: Estructura del péptido MB-H1 con su unión a la superficie de la nanopartícula
(SiO2@Ag@) mediante MMB. c-MYC aparece en verde dimerizandose con el péptido.

El quimiorreceptor orgánico se basa en un doble péptido mutante (Ser520 → Ala,

Phe522 → Ala) derivado de la hélice 1 (H1) de la región hélice-bucle-hélice de la
proteína c-MYC (515-NELKRAFAALRDQI-528, H1) (S6A), el cual es sabido que
interactúa con alta afinidad y selectividad con c-MYC (15). Para construir la sonda
SERS, se unió ortogonalmente una unidad de 4-mercaptobenzoilo (MB) al grupo
amino lateral de un residuo de Lys (Lisina) en el extremo C-terminal del péptido
H1 (S6A). Dicha modificación no parece alterar la tendencia intrínseca del péptico
a estructurase helicoidalmente, ni sus propiedades de unión a c-MYC. La síntesis
del péptido-conjugado MB-H1 se describe en materiales y métodos (Información
Suplementaria). Las nanopartículas de plata con recubrimiento de citrato (AgNPs)
de aproximadamente 65 nm de diámetro (Figuras S5A y B) se depositaron

Eduardo García-Rico 67
 Biopsia Líquida

electrostáticamente sobre microesferas (perlas o "beads") de sílice de 8 μm de

diámetro (SiO2 @ Ag). Anteriormente, las microesferas de sílice cargadas
negativamente se recubrieron secuencialmente con polielectrolitos
(polietilenimina, PEI, positivo), ácido poliacrílico (PAA, negativo) y de nuevo PEI,
utilizando el protocolo de ensamblaje capa por capa (LbL) (figuras S5C- E) (16).
El espectro Ultra Violeta-Visible de los AgNPs preparados (Figura 1-A) mostró una
resonancia plasmónica de superficie definida a 449 nm.

Figura 28: Espectros de la nanopartícula en sus distintas fases.

Figura 1: (A) Espectro UV-vis de la solución AgNps (rojo), agregados en superficie (naranja) y
anclados a superficie de perlas de vidrio (azul). (B) Espectro SERS de MB-H1 de no agregados
(rojo) y agregados de AgNps (naranja) sobre láminas de vidrio, y sobre SiO2@Ag (azul. (C)
Intensidades SERS correspondientes a la altura de los de los picos a 1075 cm -1..

La deposición de nanopartículas sobre un soporte sólido da como resultado la

aparición de una señal característica, intensa y amplía a una longitud de onda larga,
que es un indicador del acoplamiento entre partículas. La huella digital de SERS de
MB-H1 sobre las SiO2 @ Ag se muestra en la Figura 1B (curva azul).
Notablemente, las SiO2 @ Ag ofrecen una amplia área superficial, una estrecha
interacción adsorbente-adsorbato y una alta densidad de puntos calientes
electromagnéticos, combinando así los beneficios de los coloides y las películas,
superando las importantes limitaciones de ambos. Como controles negativos se
utilizaron nanopartículas de plata (AgNP) sobre láminas de vidrio, además de
microesferas (perlas). Cuando estas no se agregaron, no mostraron señal SERS

68 Eduardo García-Rico
 4. Estudio II

apreciable (Figura S6B). Sin embargo, cuando se agregaron, la señal SERS de los
agregados sobre película o microesferas (perlas) fue idéntica, aunque con una
mayor desviación estándar en la primera (Figura 1 B, C).

El tamaño grande de las nanoesferas permite su fácil localización con un objetivo

de bajo aumento (por ejemplo, × 5) para el escaneo posterior, ya con un objetivo de
mayor resolución (por ejemplo, × 50 o x 100) (Figura 2A). Además, por su tamaño,
se puede reducir drásticamente la cantidad de material plasmónico necesaria para
la detección, lo que, a su vez, mejora la sensibilidad aumentando el número de
moléculas en relación con el de nanopartículas. Esto se ejemplifica en las Figura 2
B, C, que muestran que el SERS de MB-H1 puede discriminar cantidades hasta por
debajo de 10 pM para una concentración de partículas de 2400 perlas / ml, mientras
que cantidades de SiO2 Ag aún más más bajas (240 perlas / ml) permiten la
detección por debajo de 1 pM.

Figura 29: Espectros a diferentes concentraciones.

Figura 2: (A) Imágenes ópticas a baja (x5) y alta (x50) magnificación de las perlas desde alícuotas
de 100 µL de una suspensión con concentración de 2400 (paneles altos) y 240 (paneles bajos)
perlas/mL. (B) Espectro SERS de MB-H1 a diferentes concentraciones sobre SiO2@Ag (2400
perlas/mL y (resaltado) 240 perlas/mL. (C) Sus correspondientes intensidades a 1075 cm -1.

En principio, la captura de la proteína c-MYC por el complejo MB-H1 unido a

perlas de SiO2 @ Ag podría dar lugar a un gran conjunto de perturbaciones en el
espectro SERS del motivo mercaptobenzoil (MB), que irían desde cambios sutiles

Eduardo García-Rico 69
 Biopsia Líquida

de sus características vibratorias hasta la aparición de nuevos picos. Para la

interpretación de tales variaciones, se adquirieron previamente los espectros Raman
y SERS del motivo sin péptido H1 (4-mercapto-N-metilbenzamida o MMB) y los
de MB-H1 antes y después de la reacción con c-MYC (Figura 3A). Los espectros
SERS de MMB y MB-H1 muestran patrones vibratorios similares, pero con algunas
diferencias en intensidades relativas. Este resultado apunta hacia un ligero cambio
de la orientación molecular del grupo mercaptobenceno sobre la superficie de la
plata cuando se acopla con una molécula más grande tal como H1, en pleno acuerdo
con las reglas de selección de superficie (17). Esta perturbación se amplifica cuando
tiene lugar la unión del complejo con la proteína c-MYC, que es proporcionalmente
muy grande.

Con el fin de identificar los modos de vibración del motivo mercaptobenceno más
sensibles a las reorientaciones geométricas que este último experimenta en relación
con la superficie, es decir, para identificar a partir del espectro SERS los cambios
geométricos que tienen lugar en la molécula en las distintas condiciones
experimentales, se realizaron cálculos mediante la DFT (Density Functional
Theory-). Se trata de un método computacional que simplifica la complejidad de
los cálculos cuánticos clásicos basados en la función de onda. La DFT obtiene sus
predicciones a partir de la densidad tridimensional de las nubes de electrones, pues
teóricamente estas son las que definirán la geometría de la molécula (18)
(Figura3A). Se definen grupos puntuales (en geometría y cristalografía) a grupos
de simetrías que mantienen constante por lo menos un punto fijo. Los resultados
indican que MMB pertenece al grupo puntual C1 de simetría, lo que implica que no
es planar. Sin embargo, y derivado de la interacción Plata/Tiol (unión de la
molécula) (19) se puede asumir una orientación perpendicular sobre el metal (Ag)
(20). Por otra parte, el campo eléctrico de superficie, E, presenta únicamente un
componente normal (dirección Z en la Figura 3B) (21). Con base en estas
consideraciones, el modo vibracional es proporcional al cuadrado del producto
escalar del campo eléctrico y del momento dipolar derivado de dicho modo
vibracional (22). Este escenario define, en teoría, dos grados de libertad para los
cambios de orientación del anillo fenilo como consecuencia de sus interacciones
con otras moléculas (θ y χ Figura 3B). El espectro Raman teórico de MMB
muestra buena correlación con el experimental, lo que permite una asignación
segura de los modos observados.

70 Eduardo García-Rico
 4. Estudio II

Figura 30: Funcionalidad del constructo y respuesta en presencia de c-MYC.

Figura 3: (A) Espectro Raman teórico y experimental de los espectros MMB y SERS de MMB,
MB-H1 y MB-H1 en presencia de c-MYC, sobre SiO2 Ag. También se muestra la ampliación de las
ventanas espectrales entre 730-800 y 990-1050. (B) Modelo utilizado en la estimación de la
orientación molecular. La orientación absoluta de la molécula sobre la superficie y la orientación
relativa del anillo sobre la superficie están representadas por los ejes XYZ y xyz, respectivamente.
(C) Asignación de modo vibratorio como se describe en los cálculos de DFT (valor teórico entre
paréntesis).

Así, dicho espectro de MBB, muestra una intensidad baja de los modos fuera del
-1
plano, es decir, en relación con el plano del anillo, a 756 y 997 cm de MBB,
indicando una orientación perpendicular del anillo frente a la superficie. La adición
de H1 a MMB aumenta ligeramente la intensidad de estos modos, pero, y esto es lo
destacable, este efecto se hace más notable cuando MB-H1 interactúa con c-MYC
como consecuencia del tamaño masivo (57 kDa) de este último. De hecho, la
presencia de estas intensificaciones en las bandas fuera del plano alcanzan el mismo
nivel que la denominada "respiración del anillo" (1075cm -1) indicando una
reorientación más plana del anillo en relación con la superficie. Datos también
confirmados por el modo de estiramiento N-C a 1022 cm - 1 cuya señal es mínima
en MB - H1 y elevada tras la unión con c - MYC.

Por otra parte, la utilización de esta metodología para la cuantificación de c-MYC

debe partir del hecho de que el espectro SERS puede resultar tanto de la ocupación
de todos los receptores disponibles (MB-H1) como solo de la ocupación de algunos,
cuando estos exceden a la cantidad de c-MYC presente. En este último caso,
contribuyen al espectro los dos estados: el ocupado y el no ocupado por c-MYC.
Así, más que monitorizar las intensidades absolutas de las características bajo
observación, la cuantificación de c-MYC se realizó mediante la ratio de

Eduardo García-Rico 71
 Biopsia Líquida

-1
deformación CCH fuera del plano (Intensidad a 756 cm ) y el "anillo de
respiración" sobre el plano (1075 cm -1).

4.1.7 Muestras reales

La eficacia del sensor se demostró con líneas de células tumorales y muestras

humanas reales. Para validar los resultados se utilizó un ELISA para la proteína c-
MYC . El estudio fue presentado y aprobado por el Comité de Ética e Investigación
con Medicamentos del Grupo HM Hospitales y todos los participantes firmaron un
formulario de consentimiento informado por escrito.

La figura 4A muestra un esquema del protocolo seguido para la cuantificación de

c-MYC, tanto por el método ELISA y como por SERS. Se obtuvieron muestras de
sangre de dos donantes sanos y un paciente diagnosticado de adenocarcinoma
ovárico (estadio IV) con alta carga tumoral. La paciente estaba en progresión en el
momento de la recolección de la muestra. La presencia del tumor se confirmó
histológicamente de acuerdo con los procedimientos habituales. Cada muestra de
sangre periférica (8 ml) se procesó en las siguientes 24 h después de la extracción
para obtener las células mononucleares mediante un proceso de separación por
gradiente de densidad (Ficoll). Las células mononucleares recogidas de las muestras
de sangre, así como las de una línea celular tumoral epitelial (MCF7) se lisaron y
se centrifugaron. Posteriormente se extrajeron los sobrenadantes y, para ELISA, se
valoró la cantidad de proteína total mediante el método de Bradford. Los niveles de
c-MYC se determinaron a continuación con un kit ELISA de c-MYC total humano.
En el caso de SERS, SiO2 @ Ag @ MB-H1 (240 perlas funcionalizadas con 100
pM de MB-H1, que es equivalente a una concentración de 2,5 x 105 moléculas por
perla) se añadieron directamente a cada uno de los sobrenadantes hasta una
concentración final de 200 perlas / ml. Después se añadieron alícuotas de 100 μl
sobre placas de vidrio y las perlas se analizaron mediante SERS antes de la
evaporación del disolvente.

La Figura 4B muestra el espectro SERS para ambos procedimientos de

cuantificación con cantidades crecientes de c-MYC (en líneas finas punteadas), y
para las muestras humanas reales (en líneas gruesas sólidas). Las curvas de
calibración correspondientes obtenidas para cada método se presentan en la Figura

72 Eduardo García-Rico
 4. Estudio II

4C. En particular, en la validación del procedimiento frente al estándar (ELISA),

tanto ELISA como SERS muestran coeficientes de correlación adecuados con
límites de detección de c-MYC análogos, aunque existe una desviación estándar
ligeramente mayor para el método óptico. Sin embargo, los resultados de SERS se
obtienen en cuestión de minutos, en comparación con las preparaciones de 4-5 h
requeridas para ELISA.

Figura 31: Protocolo en muestras reales.

Figura 4: (A) Protocolo para el aislamiento de células mononucleares en muestras de sangre humana
de un paciente de cáncer y varios donantes sanos. (B) Espectros de SERS de SiO2 @ Ag @ MB-H1
en presencia de concentraciones decrecientes de c-MYC (líneas punteadas finas) y de muestras
reales (líneas sólidas gruesas). (C) Curvas de calibración para ELISA (rojo) y pare el sensor sensor
óptico experimental (azul). (D) Resultados obtenidos para una línea de células tumorales epiteliales
(MCF7), y muestras extraídas de un paciente con cáncer (CP) y dos donantes sanos (HD1 y HD2).
ELISA en rojo, y sensor óptico en azul. Concentración de c-MYC por millón de células.

Con las muestras reales se obtienen resultados similares con ambos procedimientos
(Figura 4D). Finalmente, la línea MFC7 produce valores mucho más altos que la
muestra real, probablemente porque en ese caso todas las células del cultivo son
cancerosas, donde en las muestras reales sólo una pequeña fracción son células
tumorales.

Eduardo García-Rico 73
 Biopsia Líquida

4.1.8 Conclusiones

En resumen, hemos desarrollado un ensayo rápido, altamente específico y sensible

basado en SERS para la determinación de c-MYC en muestras de sangre real. La
proteína c-MYC evaluada no es una proteína plasmática circulante. Se trata de una
proteína nuclear, cuyo origen son las células circulantes mononucleares, entre las
que se incluyen monocitos, linfocitos y células tumorales circulantes. Las primeras,
normalmente células inactivadas, no presentan sobre-expresión de c-MYC, motivo
que explica que los controles sanos muestren cifras bajas de esta proteína, mientras
que los pacientes con alta carga tumoral y, consecuentemente, un elevado número
de células tumorales circulantes, sí presentarían amplificación de c-MYC.

El sistema de detección se basa en el uso de materiales híbridos específicamente

diseñados, que consisten en micropartículas de sílice más bien recubiertas
homogéneamente con nanopartículas de plata que interactúan. Las superficies
metálicas se funcionalizan con un péptido de unión a c-MYC modificado con una
antena de 4-mercapto-N-metilbenzamida (MB-H1) que transduce los eventos
específicos de reconocimiento de c-MYC en una alteración medible de la señal
SERS de MB- H1. La deconvolución de la huella vibratoria del quimiorreceptor ha
permitido identificar los modos vibratorios característicos afectados por la unión
del complejo a c-MYC. La magnitud de tales cambios espectrales se correlacionó
cuantitativamente con el contenido de c-MYC en medios biológicos complejos, es
decir, en muestras reales.

4.1.9 Información Suplementaria

[Link] Materiales.

Todos los reactivos de síntesis de péptidos y derivados de aminoácidos se

adquirieron de GL Biochem (Shanghai), Novabiochem o Iris Biotech Gmbh. Se
adquirieron aminoácidos como aminoácidos protegidos Fmoc con el esquema de
protección de cadena lateral estándar: Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-

74 Eduardo García-Rico
 4. Estudio II

Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Asn (Trt) Fmoc-Glu (tBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-
OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp (tBu) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH y Fmoc-Lys Alloc)
-OH. DMF y TFA se adquirieron de Scharlau, CH2Cl2 de Panreac y CH3CN de
Merck. Citrato trisódico dihidratado (≥ 99,5%), ácido L-ascórbico (≥ 99,0%),
nitrato de plata (≥99,9999%), sulfato de magnesio (99,5%), polietilenimina
ramificada (PEI, 25000) y el resto de los reactivos De Sigma-Aldrich. Se
adquirieron perlas de sílice de 7,75 μm de diámetro a partir de Microparticles
GmbH. El c-MYC recombinante humano se adquirió en Creative BioMart. Todos
los disolventes estaban secos y de grado de síntesis, a menos que se especificara
específicamente, y todos los reactivos se usaron sin purificación adicional. Se usó
agua Milli-Q (18 MΩ cm-1) en todas las soluciones acuosas, y todos los cristales se
limpiaron con agua regia antes de los experimentos.

[Link] Instrumentación.

Las reacciones se controlaron mediante RP-HPLC con una LC / MS Agilent serie

1100 utilizando una columna analítica Eclipse XDB-C18 (4,6 x 150 mm, 5 μm).
Los compuestos se detectaron por absorción de UV (220 y 270 nm). Las
condiciones estándar para RP-HPLC analítico consistían en un régimen isocrático
durante los primeros 5 min, seguido por un gradiente lineal de 5 a 95% de disolvente
B durante 30 min a un caudal de 1 ml / min (A: agua con 0,1 % TFA, B: acetonitrilo
con TFA al 0,1%).

La purificación por HPLC de fase inversa se realizó en una serie Agilent 1100
equipada con un sistema de bomba binaria y un detector UV-vis, usando una
columna semimaborativa Phenomenex Luna C18 100A (250 x 21,2 mm, 10 μm).
La purificación se llevó a cabo usando un régimen isocrático durante los primeros
5 min a 5% de disolvente B y luego gradientes lineales de 5% a 75% de disolvente
B durante 30 min a un caudal de 3 ml / min (A: agua con 0,1 % TFA, B: acetonitrilo
con TFA al 0,1%). Las fracciones que contenían los productos se liofilizaron y su
identidad se confirmó mediante ESI-MS.

Los espectros UV-vis se registraron utilizando un espectrofotómetro UV-vis

Thermo Scientific Evolution 201. La concentración de péptidos se calculó mediante

Eduardo García-Rico 75
 Biopsia Líquida

la ley de Lambert-Beer, utilizando un coeficiente de extinción de 11862 M-1 cm-1

a 310 nm. La concentración de plata para AgNPs se calculó utilizando el coeficiente
de extinción de 6,61 x 10 10 M -1 cm - 1 (1-3).

Las micrografías electrónicas se registraron con microscopía electrónica de

transmisión (JEOL JEM-1011 operando a 80 kV) y una microscopía electrónica de
barrido ambiental (JEOL 6400) para la caracterización estructural de las muestras.

Los experimentos de SERS se realizaron usando un microscopio confocal

Renishaw InVia Reflex equipado con una rejilla de 1200 ranuras mm-1 para las
longitudes de onda NIR, óptica de filtro de paso de banda adicional y una cámara
2D-CCD. Todos los espectros se adquirieron utilizando 785 nm de láser de
excitación, mediante el enfoque del láser en la muestra con objetivos 5x o 50x.

[Link] Procedimientos generales de síntesis de péptidos

[Link].1 H1
Se sintetizó como amida C-terminal (escala de 0,05 mmol usando la resina Rink
Amide-ChemMatrix de Biotage: 0,46 mmol / g) en un sintetizador de péptido PS3
(Protein Technologies) siguiendo protocolos estándar de síntesis en fase sólida
Fmoc. Los acoplamientos formadores de enlaces peptídicos se llevaron a cabo
durante 50 minutos usando hexafluorofosfato de N, N, N ', N'-tetrametil-O- (1H-
benzotriazol-1-il) uronio (HBTU, 8 equiv), N, N-diisopropiletilamina (DIEA, 8,8
equiv.) en DMF (2,5 ml) y 8 equivalentes de los aminoácidos. Cada aminoácido se
incubó durante 2 min en la mezcla de acoplamiento antes de ser añadido a la resina.
Después de lavar con DMF, la desprotección del grupo protector Fmoc temporal se
realizó tratando la resina con piperidina al 20% en solución de DMF durante 15
min.

[Link].2 Rotura y desprotección del péptido unido a resina

El péptido unido a resina secado bajo argón (aproximadamente 0,025 mmol) se
colocó en un tubo falcon de 50 ml y se suspendió en 2 ml del cóctel de escisión
(100 μl de CH2Cl2, 50 μl de agua, 50 μl de triisopropilsilano (TIS) y TFA a 2 ml),
y la mezcla resultante se agitó durante 3 h. La resina se filtró y el filtrado de TFA

76 Eduardo García-Rico
 4. Estudio II

se concentró bajo una corriente de argón hasta un volumen de aproximadamente 1

ml, que después se añadió a éter dietílico enfriado con hielo (20 ml). Después de 10
min, el precipitado se centrifugó y se lavó de nuevo con 10 ml de éter enfriado con
hielo. El residuo sólido se secó bajo argón, se volvió a disolver en CH3CN / H2O
1: 1 (1 ml) y se purificó mediante HPLC de fase inversa semi - preparativa. Las
fracciones recogidas posteriormente se liofilizaron y se almacenaron a -20ºC.

[Link].3 Síntesis de ácido 4,4'-disulfanodiildibenzoico

Se disolvió ácido 4 - mercaptobenzoico (20 mg, 0,13 mmol) en EtOH (1,3 ml), se
añadió gota a gota una solución saturada de I2 en EtOH hasta que apareció un
precipitado. La solución se centrifugó y el precipitado se disolvió en DMSO. El
producto se precipitó de nuevo en EtOH, se centrifugó y se secó a alto vacío. El
ácido 4,4'-disulfanodiildibenzoico fue identificado como el producto deseado por
ESI-MS (15 mg, 75% de rendimiento). ESI - MS [MNa + ] calculado para
C14HO4S2 = 329,36, encontrado = 329,0.

[Link].4 Síntesis de 4,4 '- disulfanodiilbis (N - metilbenzamida)

Se disolvieron 250 mg de ácido 4,4'-disulfanodiildibenzoico (0,82 mmol) en DMF.

A continuación, se añadieron HBTU (744 mg, 1,96 mmol), DIEA (838 \ µL, 4,9
mmol) y metilamina sobre la solución anterior y la mezcla se agitó a temperatura
ambiente durante 2 horas. Después de confirmar la obtención del producto deseado

Eduardo García-Rico 77
 Biopsia Líquida

por análisis HPLC-MS, se evaporó DMF a vacío. A continuación, el producto bruto

de reacción se purificó directamente mediante cromatografía preparativa de fase
inversa (15 - 75% de MeOH, TFA al 0,1% / H2O, TFA al 0,1%, 30 min) y las
fracciones apropiadas se recogieron y liofilizaron para proporcionar el producto
deseado como un sólido blanco (52 mg, 0,16 mmol, 19% de rendimiento). ESI -
MS [MH+] calculado para C16H16N2O2S2 = 333,07, encontrado 333,1 [MH] +,
355,0 [MNa] +, 665,1 [M2H] +.

[Link].5 Síntesis de 4-mercapto-N-metilbenzamida

Para la síntesis de 4-mercapto-N-metilbenzamida, se disolvieron 8 mg de 4,4'-

disulfanodiilbis (N-metilbenzamida) (0,024 mmol) en 1 ml de una solución 0,2 M
de clorhidrato de tris (2-carboxietil) fosfina TCEP) en Tris-HCl 20 mM pH 7,5:
CH3CN (1: 1). La mezcla se agitó a ta durante 1 h. El crudo se purificó después
mediante HPLC de fase inversa semi-preparativa y las fracciones apropiadas se
recogieron y se liofilizaron para proporcionar el producto deseado en forma de un
sólido blanco (3 mg, 0,018 mmol, rendimiento 75%).

[Link].6 Síntesis de péptidos MB-H1

Para la síntesis del péptido conjugado con 4-mercaptobenzamida se utilizó una
estrategia de Fmoc SPPS modificada con un esquema de protección de grupo
extendido. El residuo de Lys se introduce como un derivado protegido con Alloc,
que permite su desprotección selectiva de la cadena lateral (catálisis de Pd) y
derivatización con ácido 4,4'-disulfanodiildibenzoico en la fase sólida como se
muestra a continuación:

78 Eduardo García-Rico
 4. Estudio II

[Link] Acetilación del extremo N-terminal del péptido y desprotección de la

cadena lateral Lys (Alloc) protegida ortogonalmente

Una vez que el péptido se ensambló completamente en la fase sólida, el grupo Fmoc
se desprotegió, y después se acetiló la amina N-terminal. Para este fin, se trataron
0,05 mmol de la resina con 3 ml de una solución de Ac2O al 20% en DMF / DIEA
0,195 M en DMF (2:1) durante 20 min. Después de la acetilación N-terminal, la
cadena lateral del residuo Lys (Alloc) se desprotegió selectivamente para fijación
específica.

[Link].1 Síntesis y funcionalización de perlas de sio2 @ ag

-Síntesis de nanopartículas de plata esféricas estabilizadas con citrato

Se produjeron nanopartículas esféricas de plata de aproximadamente 65 nm de

diámetro mediante una modificación del protocolo previamente comunicado (1,2)

Eduardo García-Rico 79
 Biopsia Líquida

En resumen, 250 ml de agua Milli-Q se calentaron a reflujo bajo fuerte agitación

magnética. Una vez que hierve enérgicamente, se añadió una mezcla que contenía
ácido ascórbico (250 μl, 0,1 M) y citrato trisódico (3,41 ml, 0,1 M). Después de 1
minuto, se inyectó una solución que contenía AgNO3 (744 μl, 0,1 M) y MgSO4
(559 μl, 0,1 M), previamente incubada durante 5 min a temperatura ambiente, en el
recipiente de reacción bajo agitación vigorosa. Se continuó la ebullición y agitación
durante 30 minutos para asegurar la reducción de los precursores. Durante este
tiempo, el color de la solución cambió rápidamente de incoloro a amarillo, y
gradualmente en naranja oscuro.

-Perlas de sílice revestidas con polielectrolitos

La conocida técnica capa por capa (LbL) (4) se usó para recubrir las perlas de SiO2
con 3 capas alternas de PEI, PAA y PEI proporcionando una carga neta positiva
sobre la superficie de la partícula. Para conseguir esto, se añadieron gota a gota 0,5
ml de una solución de perlas de SiO2 (50 mg / ml) a 25 ml de una solución acuosa
de PEI (2 mg / ml) previamente sonicada durante 30 min. La mezcla se agitó
vigorosamente durante 2 h y luego se centrifugó dos veces (3190 rcf -relative
centrifugal force-, 20 min) y se redispersó con agua Milli-Q para eliminar el exceso
de polielectrolito (4). Se aplicó el mismo procedimiento para las otras 2 capas de
poli (ácido acrílico) (PAA) e PEI, utilizando 2 mg / ml de PAA, 6 mM de NaCl y 2
mg / ml de PEI.

[Link].2 Montaje de nanopartículas de plata sobre perlas de sílice.

Los AgNPs se limpiaron por centrifugación (5400 rpm, 20 min) y se redispersaron
en agua Milli-Q, hasta una [Ag0] final = 2,3 x 10-4 M. Este ciclo de lavado permite
eliminar el exceso de citrato que dificulta parcialmente la adhesión de AgNPs sobre
perlas de sílice, preservando al mismo tiempo la estabilidad coloidal global. Las
perlas de sílice envueltas en polielectrólito se recubrieron con AgNPs añadiendo
gota a gota, bajo sonicación, 800 μl de la solución de perlas de sílice en un matraz
que contenía una solución de AgNPs (133 ml, [Ag0] = 0,23 mM). A continuación,
la mezcla se sometió a vórtex durante 30 s y se dejó en sedimentación durante la
noche. Después de esto, la muestra se centrifugó 3 veces (550 rcf, 5 min) y se
redispersó en 2 ml de agua Milli-Q para conseguir una concentración final de perlas
de SiO2 de 1 mg / ml.

80 Eduardo García-Rico
 4. Estudio II

[Link].3 Conjugación de MB – H1 con perlas de sio2@ag.

Distintas soluciones 5 ml de de MB-H1 (200, 20, 2 nM, 200, 20 y 2 pM,
respectivamente) en Tris-HCl 10 mM pH7,5, NaCl 100 mM fueron añadidas sobre
alícuotas de 5 ml de una solución de perlas 20 μg / SiO2@ AgNPs en Tris HCl 10
mM, pH 7,5, NaCl a 100 mM y las mezclas resultantes se incubaron durante la
noche a temperatura ambiente. A la mañana siguiente, se calculó la concentración
final de las soluciones de SiO2Ag de las soluciones (aproximadamente 2,4 x 104
perlas / ml) con un hemocitómetro.

-Muestras para caracterización SERS

Las nanopartículas de plata (20 μL 10-6 M en plata) fueron recubiertas por

centrifugación sobre un portaobjetos de vidrio a baja concentración de partículas.
Además, se agregaron en una película gotas de una solución concentrada (10 μL
10-3 M en plata) y se secaron al aire.

Figura 32: Preparación de las nanopartículas.

Figura S5: (A) Imagen TEM y (B) distribución de tamaños de los AgNPs según se prepararon. (C
y D) SEM y (E) imágenes TEM de AgNPs recubriendo perlas de sílice de 8 μm. (F) espectros de
UV-Vis de SiO2 y SiO2 @Ag (0,2 mg / ml) y el correspondiente espectro.

Eduardo García-Rico 81
 Biopsia Líquida

[Link].4 Preparación de muestras celulares y humanas

-Cultivo de líneas celulares MCF-7

Se utilizó la línea celular de cáncer MCF-7 como un control positivo de la expresión

de c-MYC. Las células MCF-7 se mantuvieron en medio EMEM suplementado con
suero bovino fetal al 10% e insulina humana al 0,1% y se incubaron a 37ºC, CO2
al 5% en una atmósfera humidificada.

-Muestras humanas.

Las muestras fueron proporcionadas por una paciente diagnosticada de un

adenocarcinoma de ovario en estadio IV, en progresión en el momento de la
donación de la muestra. La presencia de la enfermedad se confirmó
histológicamente de acuerdo con normas habituales.

-Extracción de células mononucleares de sangre periférica.

Se obtuvieron muestras de sangre de donantes sanos y se procesaron en las

siguientes 24h. 8 ml de sangre de cada donante se diluyeron 1:2 con solución salina
equilibrada de Hank (HBSS) y se dispusieron cuidadosamente en una capa de 15
ml de Ficoll-Paque Plus (de Ge Healthcare LifeSciences). Las muestras se
centrifugaron durante 40 minutos a 400 g para separar las poblaciones celulares. Se
recogieron las células mononucleares (PBMC) y se lavaron con 1x PBS y
finalmente se cultivaron en medio RPMI suplementado con suero bovino fetal al
10% a 37ºC, CO2 al 5% en una atmósfera humidificada.

-Extracción de proteínas.

Las PBMC y MCF-7 se contaron de forma similar y se recogieron en un matraz

utilizando tripsina al 0,25% de EDTA y se centrifugaron a 170 g durante 5 min. Los
sedimentos de células se suspendieron en 0,2 ml de tampón de lisis, conteniendo
HEPES 50 mM, NaCl 0,5 M, MgCl2 1,5 mM, EDTA 1 mM, glicerol al 10% v / v,

82 Eduardo García-Rico
 4. Estudio II

Triton X - 100 al 1% y 0,01 ml de cóctel inhibidor de proteasas de Sigma-Aldrich).

El paso de lisis se llevó a cabo durante 1 h a 4ºC, haciendo girar los tubos cada 15
min para separar las membranas celulares. Los lisados se centrifugaron a 13.000 g
durante 10 min a 4 ° C y los sobrenadantes que contenían proteína se mantuvieron
a -80 ° C hasta su uso.

[Link].5 Cuantificación de la proteína total y c-MYC

La concentración de proteínas de los lisados se cuantificó con el ensayo de proteína
de Bradford. Los niveles de oncoproteína c-MYC humana se determinaron con un
kit de ensayo inmunoabsorbente (ELISA) ligado a enzima c-MYC humano total (de
LifeSciences). Las muestras se diluyeron 1:10 - 1: 100 y se incubaron durante 3 h
con un anticuerpo anti-c-MYC primario, seguido de una incubación de 30 minutos
con un anticuerpo marcado con HRP secundario. Se añadió substrato de HRP
durante 30 minutos y se midió la absorbancia con un lector de placas Multimode
Tristar 2S. Todos los patrones y lisados se ensayaron por triplicado y las
concentraciones de proteínas se extrapolaron a partir de las curvas de calibración.

[Link].6 Caracterización SERS de las perlas y cuantificación de c-MYC

Para la caracterización de SERS de las perlas recubiertas, las soluciones que
contenían 2400 perlas por mililitro se funcionalizaron con cantidades decrecientes
de MB-H1 (de 100 nM a 1 pM). Después de 1 h de tiempo suficiente para asegurar
la reacción completa del tiol de MB-H1 con la plata, se moldeó una alícuota de cada
una en un portaobjetos de vidrio. Antes del secado, las perlas se localizaron con un
objetivo 5x utilizando, posteriormente, un objetivo 50x para enfocar el láser durante
1s. Para cada cuenta, se recogieron 10 mediciones. Para cada muestra se midieron
10 perlas. En particular, el tiempo se incrementó a 10 s en las muestras de 10 y 1
pM en MB-H1. Se repitió el mismo protocolo, pero disminuyendo la concentración
de perlas a 240 perlas / ml. En particular, se repitió el mismo protocolo para 24
perlas / ml. Sin embargo, la dificultad de encontrar las perlas impidió su realización.

Primero, se generó una curva de calibración usando los mismos estándares que para
ELISA. En resumen, se añadieron 100 μl de una solución de perlas de
SiO2@Ag@MB-H1 (100 μM de MB-H1) por ml de muestra, alcanzando una

Eduardo García-Rico 83
 Biopsia Líquida

concentración final de perlas de 200 perlas / ml. Después de esperar 1 h para

asegurar la interacción entre H1 y c-MYC, se colocaron alícuotas de 100 μl de la
muestra sobre un portaobjetos de vidrio. Luego, antes del secado, las perlas se
localizaron con un x5 y se mapearon con el microscopio Raman, usando un objetivo
x50 y una línea láser NIR. Se registraron 10 espectros de 10 segundos para cada
cuenta (con un láser de potencia en la muestra de 2,5 mW). Para cada muestra, se
midieron entre 10 y 15 perlas. Cada experimento se replicó tres veces. Se siguió el
mismo protocolo para las muestras humanas.

[Link].7 Cálculos teóricos.

Los cálculos de la teoría funcional de densidad funcional (DFT) de B3LYP se
realizaron utilizando un conjunto de programas Gaussianos 09. B01 con el conjunto
de bases 6-311G (p, d) (5)

Figura 33: Imágenes SEM:

Figura S6: Imágenes SEM de (A) películas agregadas (fundidas y secadas al aire) y (B) no agregadas
(revestidas por centrifugación) de AgNPs.

84 Eduardo García-Rico
 4. Estudio II

Figura 34: Espectro UV tras funcionalización.

Figura S7: Espectro UV-Vis de AgNPs antes y después de la funcionalización con MB-H1. Los
AgNPs se centrifugaron (5400 rpm, 20 min) y se redispersaron en agua Milli-Q, hasta una
concentración final de [NP] aprox. 85 pM. A continuación, se colocaron dos alícuotas de 100 μl de
coloides en diferentes Eppendorfs y se mezclaron con: (a) 3 μl de tampón Tris (Tris-HCl 10 mM pH
7,5, NaCl 100 mM); (b) 3 μl de solución MB-H1 1,57 mM en tampón Tris. Nos referimos a la
primera muestra como "AgNPs" y la segunda como "AgNPs + MB-H1". El volumen de soluciones
tamponadas añadidas a los coloides se mantuvo lo suficientemente bajo como para evitar la
agregación de nanopartículas inducida por la sal. Se observa un desplazamiento al rojo de 6 nm del
LSPR tras la funcionalización de los AgNP con el quimiorreceptor MB-H1.

Referencias

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86 Eduardo García-Rico
 4. Estudio II

G. A.; Nakatsuji, H.; Caricato, M.; Li, X.; Hratchian, H. P.; Izmaylov, A.
F.; Bloino, J.; Zheng, G.; Sonnenberg, J. L.; Hada, M.; Ehara, M.; Toyota,
K.; Fukuda, R.; Hasegawa, J.; Ishida, M.; Nakajima, T.; Honda, Y.; Kitao,
O.; Nakai, H.; Vreven, T.; Montgomery, J. A.; Peralta, J. E.; Ogliaro, F.;
Bearpark, M.; Heyd, J. J.; Brothers, E.; Kudin, K. N.; Staroverov, V. N.;
Kobayashi, R.; Normand, J.; Raghavachari, K.; Rendell, A.; Burant, J. C.;
Iyengar, S. S.; Tomasi, J.; Cossi, M.; Rega, N.; Millam, J. M.; Klene, M.;
Knox, J. E.; Cross, J. B.; Bakken, V.; Adamo, C.; Jaramillo, J.; Gomperts,
R.; Stratmann, R. E.; Yazyev, O.; Austin, A. J.; Cammi, R.; Pomelli, C.;
Ochterski, J. W.; Martin, R. L.; Morokuma, K.; Zakrzewski, V. G.; Voth,
G. A.; Salvador, P.; Dannenberg, J. J.; Dapprich, S.; Daniels, A. D.;
Farkas; Foresman, J. B.; Ortiz, J. V.; Cioslowski, J.; Fox, D. J.
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Cheeseman, J. R.; Scalmani, G.; Barone, V.; Mennucci, B.; Petersson, G.
A.; Nakatsuji, H.; Caricato, M.; Li, X.; Hratchian, H. P.; Izmaylov, A. F.;

Eduardo García-Rico 87
 Biopsia Líquida

Bloino, J.; Zheng, G.; Sonnenberg, J. L.; Hada, M.; Ehara, M.; Toyota, K.;
Fukuda, R.; Hasegawa, J.; Ishida, M.; Nakajima, T.; Honda, Y.; Kitao, O.;
Nakai, H.; Vreven, T.; Montgomery, J. A.; Peralta, J. E.; Ogliaro, F.;
Bearpark, M.; Heyd, J. J.; Brothers, E.; Kudin, K. N.; Staroverov, V. N.;
Kobayashi, R.; Normand, J.; Raghavachari, K.; Rendell, A.; Burant, J. C.;
Iyengar, S. S.; Tomasi, J.; Cossi, M.; Rega, N.; Millam, J. M.; Klene, M.;
Knox, J. E.; Cross, J. B.; Bakken, V.; Adamo, C.; Jaramillo, J.; Gomperts,
R.; Stratmann, R. E.; Yazyev, O.; Austin, A. J.; Cammi, R.; Pomelli, C.;
Ochterski, J. W.; Martin, R. L.; Morokuma, K.; Zakrzewski, V. G.; Voth,
G. A.; Salvador, P.; Dannenberg, J. J.; Dapprich, S.; Daniels, A. D.; Farkas;
Foresman, J. B.; Ortiz, J. V.; Cioslowski, J.; Fox, D. J. Wallingford CT,
2009.

88 Eduardo García-Rico
 5 ESTUDIO III
BIOPSIA LÍQUIDA DE CÉLULAS: OPTOFLUÍDICA
RESUMEN

INTRODUCCIÓN
TÉCNICAS

OBJETIVOS
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN

CONCLUSIONES
5.1 Dispositivo Optofluídico para la
INFORMACIÓN
Cuantificación de Células SUPLEMENTARIA
Tumorales Circulantes en Cáncer
de Mama REFERENCIAS
 Biopsia Líquida

5.1.1 Resumen

Los pacientes con cáncer metastásico requieren una monitorización continua

durante los tratamientos, dado que el índice terapéutico de estos es muy bajo (es
decir, la relación entre el beneficio y la toxicidad es muy estrecha). Por ello, cuanto
antes conozcamos una posible resistencia, antes se modificará la estrategia
terapéutica. El ajuste del tratamiento a la medicación depende del conocimiento
preciso del estado de la enfermedad. Es sabido que en la evolución de los tumores
aparece una gran heterogeneidad celular, tanto fenotípica como genética
(inestabilidad genética y aparición de mutaciones). Por otro lado, en los
tratamientos neoadyuvantes, por ejemplo, en cáncer de mama o cáncer de pulmón,
se sabe que aun lográndose respuestas completas patológicas hay pacientes que
recaen y otros no. El definir al terminar el tratamiento dicho grado de respuesta nos
permite tener un criterio pronóstico para la toma de decisiones. En los tratamientos
adyuvantes la situación es similar. La detección, cuantificación y caracterización de
las denominadas células tumorales circulantes (CTCs) puede cumplir todos estos
objetivos, además de facilitar un diagnóstico precoz de las recaídas o cambios
moleculares, tanto genéticos como fenotípicos, que de otra forma son indetectables
o cuya detección requiere procedimientos invasivos. Finalmente, hay algunos tipos
de cáncer cuya localización primaria los hace muchas veces inaccesibles. Es el caso
del carcinoma microcítico y no microcítico de pulmón. Muchas veces las biopsias,
cuando son posibles, son tan escasas que no permiten realizar los estudios de
biología molecular que requiere el tratamiento de esta enfermedad (mutaciones en
EGFR, translocación ALK-EML4), Estas pueden aparecer en el curso de la
evolución. La repetición de biopsias es muy invasiva y no siempre factible. En
este trabajo, se diseña y demuestra la efectividad de un dispositivo microfluídico
capaz de focalizar un microflujo en 3D, y en el cual todas las ópticas están
integradas en el chip, permitiendo la cuantificación de fluorescencia de CTCs en
muestras reales, con una implementación técnica que permite su uso en una consulta
u hospital de día. Para probar el rendimiento del chip, se seleccionaron dos objetivos
de membrana celular; la molécula de adhesión de células epiteliales, EpCAM, y el
receptor tirosina-quinasa, HER2/neu (EGFR2). La eficacia de la plataforma se
demuestra en líneas celulares y en una variedad de donantes sanos y pacientes con

90 Eduardo García-Rico
 5. Estudio III

cáncer de mama metastásico: los resultados se comparan con los de las herramientas
de diagnóstico convencionales y la citometría de flujo.

5.1.2 Introducción: biopsia líquida de Células Tumorales Circulantes

(CTCs)

El pronóstico y la evaluación del tratamiento del cáncer de mama se establecen en

el momento del diagnóstico mediante el estudio anátomo-patológico,
inmunohistoquímica y biología molecular después de practicarse una biopsia,
generalmente con aguja gruesa (BAG) o extracción de muestras quirúrgicas. Sin
embargo, en el cáncer metastásico (estadios IV), el conocimiento del estado de
salud actual del paciente en diferentes momentos de la evolución de la enfermedad
es crucial para la eficacia del tratamiento (1,2). Las biopsias sólidas de metástasis
no pueden considerarse una herramienta de monitorización, ya que son altamente
invasivas. Por lo tanto, la evaluación de la progresión de la enfermedad se logra con
frecuencia únicamente mediante técnicas de imagen (resonancia magnética,
tomografía computarizada –TC- y tomografía por emisión de positrones –PET-) y
los denominados marcadores tumorales serológicos. Estos últimos son muy poco
sensibles y específicos. En este escenario, la posibilidad de monitorizar la evolución
maligna mediante extracción sanguínea simple y poco invasiva con un dispositivo
de bajo costo podría permitir el concepto de atención oncológica en el punto de
asistencia (point of care), donde todos los pacientes pueden ser adecuadamente
seleccionados en un momento oportuno, a bajo costo y sin depender de un centro
de referencia. Cabe destacar que las células tumorales circulantes (CTC) se han
vinculado a aspectos clave de la detección precoz, el diagnóstico, el pronóstico y la
monitorización del cáncer (3). En los últimos años, se han propuesto varios métodos
para la detección de CTC en sangre (es decir, biopsia líquida), mostrando valores
diagnósticos y de pronóstico variables (4,5).

Eduardo García-Rico 91
 Biopsia Líquida

5.1.3 Técnicas

[Link] No microfluídicas

Actualmente, la mayoría de estos métodos se basan en el uso de los anticuerpos de

la molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM) para capturar los CTC y su
posterior caracterización con inmuno-tinción o mediante retrotranscripción y
reacción en cadena de la polimerasa de transcritos específicos del tipo tumoral
estudiado (RT-PCR) (6-9). Otros métodos emplean las diferencias intrínsecas en
forma, tamaño y / o densidad de las células tumorales en comparación con las
células circulantes normales para recolectar y después enumerar las CTC, usando
filtros (10, 11), superficies activadas (12-14) o partículas (11, 14 -16). En cuanto a
la identificación directa de CTCs en la muestra sin enriquecimiento celular, se han
propuesto varias alternativas basadas principalmente en cartometría de flujo (17),
en fluorescencia (18) o en ultrasonidos (19,20). Sin embargo, estos enfoques
requieren costosas técnicas instrumentales que dificultan la aplicación generalizada
en la práctica clínica diaria en un centro convencional de atención oncológica.

[Link] Microfluídicas

El concepto “microfluidico” incluye un conjunto de distintas herramientas que

comprenden métodos para la manipulación precisa de fluidos a pequeñas escalas de
longitud (μm a mm). Ciertas propiedades de las tecnologías microfluídicas, como
el procesamiento rápido de muestras y el control preciso de los fluidos en el
proceso, han convertido estos dispositivos en candidatos atractivos para reemplazar
los enfoques experimentales tradicionales en la investigación médica y biológica,
así como en el diagnóstico (21). La microfluídica aporta una perspectiva
completamente nueva y una excelente manera práctica de manipular células (22-
24). Los dispositivos de microchip pueden prepararse fácilmente, utilizando
herramientas estándar de microfabricación, lo que reduce el coste y simplifica la
comercialización. Además, las plataformas microfluídicas pueden ser fácilmente
integradas con técnicas ópticas (25), incluyendo los procedimientos elásticos (26)

92 Eduardo García-Rico
 5. Estudio III

e inelásticos (27,28), los que bloquean la luz (22) o los métodos fluorescentes (21).
Esta tecnología permite que los dispositivos sean portátiles y sencillos, operativos
en ambientes ambulatorios o al lado del paciente, sin la necesidad de grandes
equipos y / o personal especializado específico.

5.1.4 Objetivos

En este trabajo pretende diseñar un dispositivo de microfluidos de flujo 3D, donde

todas las ópticas están integradas en el chip, para la cuantificación de fluorescencia
de CTCs en muestras reales.

Probar su efectividad mediante un diseño diagnóstico específico para cáncer de

mama

5.1.5 Resultados y discusión

La molécula de adhesión de células epiteliales, EpCAM (29), y el receptor de

membrana tirosina- quinasa HER2/neu (30), se seleccionaron como dianas de
membrana celular para reconocer células tumorales de cáncer de mama HER2
positivo (31-33). El cáncer de mama representa hasta el 30% del total de cánceres.
Entre estos, el 20% expresan HER2 al diagnóstico (aparece amplificado). Aunque
parece que este estatus al diagnóstico puede cambiar en el curso de la enfermedad,
es decir, pasar de HER2 negativo a HER2 positivo. Además, su diagnóstico correcto
es esencial 30, ya que diferentes características biológicas de la enfermedad
requieren tratamientos específicos y diferenciados basados en anticuerpos
monoclonales o inhibidores de la tirosina quinasa (TKI) dirigidos al receptor HER2
o su vía de transducción de señales (trastuzumab, pertuzumab, TDM1 o lapatinib)
(34-37). Teniendo en cuenta que para dicho tipo de tumores hay un tratamiento
específico, es esencial conocer si se produce dicho cambio, ya que podríamos estar
privando a las pacientes de un tratamiento efectivo.

Eduardo García-Rico 93
 Biopsia Líquida

La efectividad de la plataforma optofluídica aquí propuesta se demostró en líneas

celulares, así como para una variedad de donantes sanos y pacientes con cáncer de
mama metastásico. Los resultados se compararon con los de las herramientas de
diagnóstico convencionales y con los obtenidos por citometría de flujo.

[Link] Chip optofluídico

El chip microfluídico (Figura 1A) comprende un canal de enfoque de flujo 3D para

la alineación de células individuales y varias fibras ópticas integradas para
excitación y recolección. La muestra se inyecta en uno de los canales mientras,
simultáneamente, se bombea un flujo de vaina a través de canales adyacentes. La
vaina y los flujos de muestra no se mezclan, sino que limitan la muestra a la región
central del canal (Figura 1B) debido a las escalas de tiempo bajas y la magnitud de
la tasa de difusión implicada en un experimento típico. Dos zonas de interrogación,
colocadas con una separación de 1 mm, se implementan en el chip. Cada una de
ellas comprende:

• una fibra de bombeo (473 nm), que está orientada

perpendicularmente al canal microfluídico y enfocada en la muestra
restringida, y
• una fibra de captura de fluorescencia (para capturar la emisión de
fluorescencia roja o verde).

Las fibras de recogida están orientadas a un ángulo de 45° C con respecto a la fuente
de excitación para evitar la recogida de la luz de la fuente de bombeo. Las fibras de
modo único se seleccionan para la excitación de 473 nm, para producir un volumen
de interrogación del orden del tamaño de las células (Figura 1C). La recolección de
la emisión de fluorescencia se realiza mediante dos fibras ópticas multimodo de
abertura 62,5 μm de alta apertura numérica (NA = 0,275), tanto para la
fluorescencia roja como la verde. Esto permite obtener una señal de fluorescencia
ininterrumpida de las células a medida que fluyen a través de la longitud del
volumen de bombeo. Cabe señalar que pueden añadirse más canales de excitación
y detección fácilmente a lo largo de toda la longitud del dispositivo microfluídico.

94 Eduardo García-Rico
 5. Estudio III

[Link] Registro de la señal de fluorescencia y emparejamiento de picos.

Para probar el rendimiento del dispositivo se seleccionaron dos líneas celulares:

• AU-565, HER2 positivo / EpCAM positivo, y

• RAMOS, HER2 negativo / EpCAM negativo.

Por consiguiente, para identificar las células positivas se emplearon anticuerpos

anti-HER2 y anti-EpCAM, marcados con isotiocianato de fluoresceína (FITC) y
peridinina-clorofilproteína cianina-5.5 (PerCP/Cy5.5), respectivamente. Estos
“reporters” fluorescentes fueron elegidos en base a sus propiedades de absorción en
el rango espectral azul (Figura 36D), que encajan perfectamente con la longitud de
onda de excitación de fibras ópticas (473 nm) y sus bandas de emisión están bien
separadas en el rango visible (verde, 532 nm, Para FICT, y rojo, 676 nm, para PerCP
/ Cy5.5). Microscopía confocal de barrido láser (Figura 36E) confirma la tinción
eficiente de AU-565 células, donde HER2-FITC se presenta en verde y EpCAM-
PerCP/Cy5.5 en rojo. La capacidad del chip optofluídico para detectar células
teñidas con fluorescencia, incluso a baja concentración, se ensayó inicialmente en
muestras que consistían en AU-565 (+) mezclado con células RAMOS (-) en
diferentes proporciones (1: 1, 1:10, 1:100 y 1:1000 positivo: negativo). Para la
comparación con el estándar se llevó a cabo la citometría de flujo en paralelo en las
mismas muestras. La Figura 2A muestra un registro corto de las señales de
fluorescencia obtenidas para una muestra con relación de células positivas 1:10
negativas. Las señales rojas corresponden a los marcadores epiteliales de superficie
celular (EpCAM) mientras que el verde se asigna al HER2. La figura muestra la
intensidad normalizada de ambas señales fluorescentes. Sin embargo, vale la pena
señalar que la emisión verde es mayor que la roja debido al mayor rendimiento
cuántico de FICT en comparación con PerCP / Cy5.5. En particular, la Figura 2A
muestra tres tipos de eventos positivos:

• único verde,
• único rojo
• doble verde + rojo.

Debido a la falta de correlación entre los eventos aparentemente aleatorios, el

reconocimiento efectivo de las células AU-565 debería estar asociado sólo con la

Eduardo García-Rico 95
 Biopsia Líquida

redundancia de señal (es decir, eventos positivos simultáneos verdes y rojos (Figura
2B), ya que ambas zonas de interrogación son copias exactas.

Desde el punto de vista experimental, los dos eventos fluorescentes positivos

pueden asociarse a la misma célula, controlando el desplazamiento de tiempo entre
los canales rojo y verde a través de mediciones de correlación (Figura 2C).
Específicamente, tras la adquisición de una señal verde positiva, se seleccionan los
picos rojos más cercanos y se compara su tiempo transcurrido. Si la distancia
temporal entre ambos picos encaja con el desplazamiento temporal adecuado
correspondiente al tiempo de recorrido de las células que fluyen entre las dos áreas
de detección, los dos eventos fluorescentes se consideran correlacionados.
Posteriormente, los resultados para una muestra dada pueden representarse como
una función de las respectivas intensidades verde y roja. Las Figuras 2 D y E
muestran los resultados obtenidos midiendo una muestra de relación celular
positiva 1: 1000 (positivo: negativo) con el chip optofluídico y con el citómetro de
flujo,

Figura 35: Chip Optofluídico.

Figura 1: (A) Imagen SEM del chip optofluídico. (B y C) Confinamiento de la muestra en la región
central del canal. Una trayectoria de luz azul (C) es visible solamente cuando una célula intersecta
la viga de bombeo. Propiedades de absorción y emisión de los colorantes utilizados para etiquetar
los anticuerpos y su rendimiento en la membrana celular. (D) Absorción y perfiles de emisión de
anticuerpos anti-HER2-FITC (verde) y anti-EpCAM-PerCP / Cy5.5 (rojo). (E) Imágenes de
microscopía confocal de barrido láser de células AU-565 teñidas con anticuerpos conjugados anti-
HER2-FITC (verde) y anticuerpos conjugados con EpCAM-PerCP / Cy5.5 (rojo). Los núcleos se
tiñeron con DAPI (azul). Barra de escala 10 mm.

respectivamente. La citometría de flujo revela un recuento de 43 células AU-565

(que expresan receptores EpCAM y HER2) y 21163 células totales, evidenciando
una relación de 2,04: 1000 (se pueden atribuir errores experimentales a pequeñas
desviaciones de los valores teóricos). Por otro lado, al detectar con el chip

96 Eduardo García-Rico
 5. Estudio III

optofluídico, se identificaron 54 células malignas y 22765 células normales. Esto

corresponde a una relación de 2,37: 1000, que está en buen acuerdo con los
resultados observados para la citometría estándar. Cabe señalar que el dispositivo
optofluídico produce un número considerablemente mayor de eventos verdes que
la citometría de flujo, ya que, con un bombeo de 473 nm, la auto-fluorescencia
celular inespecífica, que tiene lugar principalmente en la parte verde del espectro,
se superpone con la emisión de fluorescencia de las células marcadas con FITC.
Para el resto de las muestras medidas se observó una similar correspondencia,
validando así (Figura 2F y complementario de la Figura S1), la utilización del
método para su aplicación en muestras reales.

[Link] PACIENTES Y MUESTRAS REALES

La presencia de CTCs en muestras de sangre reales se evaluó procesando y

analizando la sangre de los diferentes donantes sanos y de las pacientes con cáncer
de mama. Entre enero y septiembre de 2016, se incluyeron 3 donantes sanos y 5
pacientes. Todas las pacientes fueron diagnosticadas de cáncer de mama
metastásico, con tumores secundarios en diferentes localizaciones anatómicas. Sus
características clínicas y evolución del cáncer en el momento de la extracción de
sangre se resumen en la Tabla 6. En la Figura 3 se incluyen las tomografías
computarizadas (TC) de las pacientes en el momento de la extracción de sangre. La
paciente 2 se encontraba en remisión completa en el momento de la extracción. Los
datos personales y clínicos se registraron según los procedimientos clínicos
estándar. Todos los pacientes proporcionaron su consentimiento informado por
escrito antes de su inclusión en el estudio. El estudio fue aprobado por el Comité
local de Ética e Investigación de Medicamentos.

Eduardo García-Rico 97
 Biopsia Líquida

Tabla 7: Características clínicas y estado de progresión del cáncer en el momento de la extracción

de sangre.
Paciente Edad /Sexo ER/PR Metástasis Estado
CP1 68/F Positivo Visceral Estable

CP2 41/F Negativo Ósea Remisión Completa

CP3 59/F Positivo Linfática Progresión

CP4 44/F Negativo Visceral Progresión

CP5 49/F Positivo Ósea Progresión

F, Femenino; ER, estrogen receptor; PR, progesterone receptor.

Figura 36: Citometría de flujo.

Figura S1: Resultados obtenidos con el citómetro de flujo y el chip optofluídico para relaciones
celulares de 1: 1, 1:10, 1: 100 y 1: 1000 Au-565: RAMOS.

98 Eduardo García-Rico
 5. Estudio III

Figura 37: Señal en el dispositivo optofluídico.

Figura 2: Adquisición de señal en el chip optofluídico. (A) Registro corto de las señales de
fluorescencia obtenidas para la muestra 1:10. (B) Correlación cruzada de las señales de fluorescencia
verde y roja. (C) Retardo (Δt = -0.0119 s) entre las señales de lectura y la de verde. Resultados
obtenidos con el chip optofluídico (D) y citómetro de flujo (E) para una muestra que contiene 1 AU-
565 (HER2 + / EpCAM +) por 1000 células RAMOS (HER2- / EpCAM-). (F) Comparación entre
el chip optofluídico y las relaciones de células de citometría de flujo de 1: 1, 1:10, 1: 100 y 1: 1000
Au-565: RAMOS.

Para reducir el volumen inicial de las muestras (8 ml), sólo se recogieron las células
mononucleares de sangre periférica (PBMC), se tiñeron y se sometieron a
citometría de flujo y al chip optofluídico. Se comenzó con el procesamiento de la
sangre de donantes sanos, sin CTCs, para establecer un umbral que identificara el
nivel intrínseco de eventos positivos atribuidos a las PBMC normales (Figura 3A y
S2). Contrariamente a lo observado para las líneas celulares tumorales, no se
observaron eventos espurios EpCAM positivos ni por citometría de flujo ni por el
chip optofluídico. Por otra parte, el número de eventos positivos HER2 fue
notablemente mayor. En el caso del citómetro de flujo, este aumento en el número

Eduardo García-Rico 99
 Biopsia Líquida

de positivos de HER2 puede atribuirse a la interacción cruzada (aunque baja) de los

anticuerpos anti-HER2 con la molécula de membrana FcɣRI (CD64, receptor de
anticuerpos de los neutrófilos) en la población de NK / granulocitos (38). En el
chip optofluídico, este fenómeno biológico se combina, además, con la
autofluorescencia celular de fondo que se registra en el canal verde. Una vez
definidos los umbrales asociados con eventos positivos, tanto para los marcadores
verdes (antiHER2) como para los rojos (antiEpCAM), se realizaron citometrías de
flujo y mediciones optofluídicas en muestras de sangre de pacientes con cáncer
(Figura 3B y S2).

Figura 38: Resultados en pacientes.

Figura S2: Resultados obtenidos con el citómetro de flujo para las muestras de sangre de donantes
sanos y pacientes con cáncer.

Las células tumorales circulantes se cuantificaron en cantidades similares, con

ambos métodos, para cuatro de los cinco pacientes, aunque uno no presentó ninguna
(CP2). Estos datos se correlacionan bien con los obtenidos con la situación clínica
de cada paciente en el momento de la extracción de la muestra (carga tumoral
estimada) (Tabla 6 y Figura 3D). En primer lugar, las muestras que definen bajos
recuentos de CTC (CP1 y CP5) presentaban metástasis pulmonares estables (CP1)
y derrame pleural maligno asociado a masa mediastínica (CP5), que presentaba
respuesta actual tras cuatro ciclos de tratamiento específico. Por el contrario, CP4
presentaba una metástasis osteoblástica en progresión actual, mientras que la
paciente con un mayor número de CTC (CP3) había sido recientemente

100 Eduardo García-Rico

 5. Estudio III

diagnosticada de progresión iniciando tratamiento en el momento de la extracción.

En destacable la ausencia de células tumorales circulantes en la sangre de CP2, que
en ese momento estaba en remisión completa (metástasis en la vértebra cervical C6,
además de metástasis viscerales). Un dato que llama la atención es que los pacientes
que están en progresión (CP3, CP4 y CP5) tienen patrones HER2 similares y bien
definidos que difieren claramente de los donantes sanos, los que están en remisión
completa (CP4) muestra un patrón similar a los sanos y, finalmente, los pacientes
estables (CP1) presentan un patrón intermedio. Dada la evidencia de que las células
tumorales circulantes pueden presentar una transición epitelial-mesenquimal
(EMT), es factible que células EpCAM negativas sean, sin embargo, tumorales.
Para establecer esto, habría que utilizar más marcadores, incluyendo marcadores
mesenquimales (39).

Figura 39: Resultados optofluídicos y características de los pacientes.

Figura 3: Resultados optofluídicos para muestras de sangre y tomografía computarizada de
pacientes con cáncer en el momento de la extracción de sangre. (A) 3 donantes sanos y (B) 5
pacientes con cáncer. (C) Tomografías computarizadas de los pacientes con cáncer en el momento
de la extracción de sangre. CP1, metástasis pulmonar (flecha roja). CP2, gammagrafía ósea y RM
antes (con metástasis lítica en C6) y en el momento de la extracción sanguínea (remisión completa).
CP3, recientemente diagnosticada y no tratada, pero con adenopatía metastásica (flecha roja). CP4,
metástasis osteoblástica vertebral que muestra la progresión ósea actual de la enfermedad (flecha
roja). CP5, derrame pleural maligno (flecha roja) y masa mediastínica (flecha azul). En el momento
del estudio, el CP5 había recibido cuatro ciclos de tratamiento específico. (D) Comparación de los
resultados de las muestras de sangre entre la citometría de flujo y el dispositivo optofluídico.

Eduardo García-Rico 101

 Biopsia Líquida

5.1.6 Conclusiones

Se ha diseñado y fabricado un chip optofluídico hidrodinámico de bajo costo, con

todas las ópticas integradas, con el fin de realizar biopsias líquidas. Este chip puede
confinar muestras de tal modo que permite detectar células individuales,
proporcionando, por lo tanto, una herramienta eficaz para cuantificar el número de
CTC en una muestra líquida dada. Para evaluar el sistema, se seleccionó el cáncer
de mama HER2 positivo, un tumor ampliamente extendido y agresivo que requiere
monitorización especial. El sistema fue diseñado con dos detectores para identificar
de forma redundante CTC positivos, mediante la identificación simultánea de señal
perteneciente a dos receptores de membrana, HER2 y EpCAM.

Los resultados obtenidos en muestras de sangre real de pacientes con cáncer de

mama HER2+ y estadios IV, con diferentes cargas metastásicas y/o progresión,
muestran que el dispositivo optofluídico puede correlacionarse con dicha carga
tumoral. Al mismo tiempo, los resultados se correlacionan bien con los obtenidos
mediante citometría de flujo, así como con los datos clínicos convencionales de
imagen y serológicos. Junto con otros procedimientos de “nueva generación”
(basados en MALDI-TOF, lateral-flow, o PCR), los resultados que aquí se
presentan son una “prueba de concepto”, que tiene como objetivo construir una
plataforma para la identificación temprana y la monitorización de células tumorales
circulantes y, secundariamente, la enfermedad oncológica. Esta plataforma de
detección puede extenderse fácilmente a la investigación de otros tumores,
empleando diferentes anticuerpos selectivos. Por último, con una población
creciente en riesgo de desarrollar cáncer, este es un método altamente sensible, no
quirúrgico, no radiactivo y utilizable en el punto de asistencia clínica (por su
portabilidad), que puede sustituir en el futuro a otras herramientas más complejas y
de uso centralizado.

102 Eduardo García-Rico

 5. Estudio III

5.1.7 Información suplementaria

[Link] Fabricación de chips microfluídicos PDMS

Se utilizaron obleas de Si de 3” como sustrato para producir las estructuras SU8

(SU8-2150, MicroChem Corp). Antes del revestimiento por centrifugado SU8, la
oblea de Si se deshidrató completamente en una placa caliente a 200ºC durante dos
horas. Después se aplicó un promotor de adhesión (OmniCoat, MicroChem Corp.)
sobre la superficie desnuda de Si y luego se horneó en una placa caliente a 200ºC
durante un minuto. La oblea se mantuvo a 100°C sobre una placa caliente para
evitar cualquier hidratación del sustrato. Las guías SU8 se fabricaron empleando
una técnica estándar ampliamente utilizada en el manejo de PDMS
(polidimetilsiloxano). El patrón microfluídico de las virutas se grabó utilizando una
litografía láser UV de resolución submicrónica (DWL 66fs de Heidelberg
Instruments) sobre una fotomáscara de cromo de 4 pulgadas. Para la elaboración de
un solo chip se construyeron dos moldes, uno que contenía las estructuras para la
base del chip, canales microfluídicos y ranuras para las fibras ópticas, y otra de la
cual se moldearon los canales de la tapa, dedicados al enfoque vertical del flujo de
muestra. La anchura de las ranuras de las fibras ópticas se estableció durante la
elaboración de la fotomáscara a 120 μm (5 μm por debajo del diámetro) para
asegurar un agarre adecuado entre el revestimiento de la fibra y el PDMS. Se puso
cuidado durante la construcción de la fotomáscara, de modo que, tras la realización
de la guía SU8, los canales que contenían las fibras de bombeo y las fibras de
recogida se alinearan de tal manera que el eje de las fibras se intersecara
exactamente en el centro del canal microfluídico una vez que estuvieran colocados.
Se dispensaron 2 ml de SU8 sobre una oblea de Si de 3 pulgadas deshidratada y
después se centrifugó a 2800 RPM durante 40 segundos con una rampa de 500 RPM
/ s. Estos parámetros permitieron obtener un espesor SU8 de aproximadamente 120-
130 μm, el requerido para evitar que las fibras sobresalgan de la ranura PDMS. La
oblea con la capa SU8 se endureció después durante 1 h a 100°C. Una vez que se
terminó la cocción suave y el disolvente de la SU8 se evaporó completamente, se
llevó a cabo una retirada de los bordes (EBD –edge bead removal-) de la capa
revestida por centrifugación SU8. Este proceso permite que la fotomáscara esté en

Eduardo García-Rico 103

 Biopsia Líquida

contacto cercano con la superficie expuesta al SU8 al horno durante la exposición

a UV, minimizando los efectos de difracción de luz UV en los contornos de máscara
modelados. La exposición UV del SU8 se realizó con una lámpara de descarga de
mercurio con un montaje de alineador de máscara (MG 1410, Karl Suss). Se
encontró que el tiempo de exposición óptimo era de 4,5 segundos para una potencia
de densidad de 124 mW / cm2 y para una longitud de onda de referencia de 405
nm. Después de que el SU8 es expuesto, se sigue una cocción a 65°C durante 5 min
y a 100°C durante 10 min. La placa caliente se desconecta y se deja enfriar a
temperatura ambiente. La oblea de Si se desarrolla luego en disolvente PGMEA
(AZ® EBR Disolvente) varias veces hasta que las estructuras SU8 están expuestas
y no se observa resto SU8 no reticulado en la oblea de Si. Se aplicó una exposición
de oxígeno al plasma al maestro terminado para eliminar la capa Omnicoat expuesta
y dejar una superficie de Si más limpia. Para ello, se utilizó un grabado con iones
reactivos (RIE –reactive-ion etching-) (PlasmaPro NGP80, Oxford Instruments) y
las condiciones fueron: potencia: 100 W, caudal de oxígeno: 35 sccm, presión: 100
mTorr y tiempo: 1 min.

[Link] PDMS y posicionamiento de fibra óptica

Los masters SU8 se colocaron en la parte inferior de un recipiente de aluminio con

la cara de las estructuras SU8 apuntando hacia arriba y el PDMS desgasificado
(Sylgard 184, Dow Corning), se vertió más tarde en el recipiente y se dejó curar a
80ºC durante 2 horas. Después su endurecimiento, las placas de PDMS se frotaron
a fondo con tejidos de limpieza ópticos empapados en acetona y enjuagados con
etanol. Las superficies de PDMS se unieron irreversiblemente juntas, exponiendo
las superficies a un plasma de oxígeno generado por RIE en las siguientes
condiciones: potencia: 10 W, caudal de oxígeno: 50 sccm, presión: 80 mTorr y
tiempo: 20 s. Se insertaron un total de cuatro cables de conexión de fibra óptica con
conector único en un solo chip. Para asegurar una iluminación adecuada y un haz
gaussiano discreto y limpio en la zona de interrogación, las fibras se escindieron y
posteriormente se observaron bajo el microscopio para verificar un corte limpio de
la cara de la fibra antes de insertarlas a mano en las entradas de ranuras dedicadas,
situadas a ambos lados del chip. Igualmente, las fibras planas y homogéneas

104 Eduardo García-Rico

 5. Estudio III

clavadas garantizaron una óptima recolección de luz para las fibras de recogida.
Cada extremo de la ranura se humedeció con una gotita de etanol, que entró dentro
de la ranura por capilaridad. Esto redujo la fricción y ayudó durante el proceso de
inserción de la fibra.

[Link] Medición de muestras con el chip optofluídico

El chip optofluídico se colocó bajo un microscopio invertido (IN480TC-FL,

AMScope) para obtener imágenes claras del enfoque del fluido. Se emplearon dos
controladores de presión (OB1-mk3, Elveflow) para bombear el fluido dentro del
chip: un canal para cada uno de los cuatro fluidos sacrificiales -dos para el enfoque
vertical y dos más para el enfoque horizontal- y un canal para el flujo de la muestra.
El tratamiento independiente de cada flujo de entrada permitió no sólo ajustar el
área de la sección transversal del flujo centralizado, sino también la posición del
flujo enfocado dentro del canal microfluídico con respecto a las paredes del canal
microfluídico central. La luz de bombeo para ambas zonas de interrogación
independientes se generó mediante un diodo láser (serie 473nm 06-01, Cobolt)
acoplado a un divisor de fibra óptica 1x2 de 50:50 (FC488-50B-APC-1, Thorlabs).
Cada extremo de divisor se acopló a ambas fibras ópticas de entrada de modo único
del chip. Las potencias de bombeo típicas dentro del canal microfluídico durante el
proceso de medición fueron del orden de 10 mW. Las fibras de parche multimodo
de recolección de fluorescencia de dos salidas del chip microfluídico se conectaron
directamente a dos tubos fotomultiplicadores (R928, Hamamatsu) encerrados en
una carcasa de aluminio (PXT1 / M, Thorlabs), usando un conector FC. Para evitar
posibles intensidades de luz de bombeo desde el fotomultiplicador (originadas
principalmente por la luz difusa en las células), dos filtros de paso largo de longitud
de onda de 500 nm (FELH0500, Thorlabs) se localizaron en la carcasa de aluminio
entre la punta de la fibra óptica y el fotocátodo. Se colocaron filtros de paso de
banda adicionales (86-988 y 33-330 de Edmund Optics) junto a cada filtro de paso
largo para permitir la transmisión de luz seleccionada en cada detector
fotomultiplicador. Ambos tubos fotomultiplicadores se conectaron directamente a
un osciloscopio (TDS 1012B de Tektronix) para visualizar simultáneamente ráfagas
de fluorescencia, mientras se llevaba a cabo el proceso de medición. La resistencia

Eduardo García-Rico 105

 Biopsia Líquida

interna del osciloscopio (1 M Ω) se utilizó como impedancia de salida. A

continuación, se aplicó un seguidor de tensión de dos canales con tensión de
saturación de 9 V a la señal de tensión del osciloscopio y se utilizó una tarjeta de
adquisición de datos (NI USB-6212 BNC, National Instruments) para adquirir los
datos de señal de ambos canales. La baja impedancia en el seguidor de la tensión
impidió que las imágenes fantasmas aparecieran en uno de los canales,
especialmente a altas velocidades de muestreo en la DAQ. Para minimizar cualquier
ruido proveniente de equipos electrónicos se emplearon cables coaxiales para
conectar todos los componentes electrónicos de la instalación. La adquisición de
datos de la señal se realizó utilizando un programa Lab-VIEW, que permitió
guardar simultáneamente los datos de los dos canales para ser tratados
posteriormente con el software Scilab para mediciones de correlación de las dos
señales.

[Link] Medición de la muestra con el citómetro de flujo

La citometría de flujo de las muestras se llevó a cabo en un citómetro de flujo

NovoCyte (de AceaBiosciences), equipado con un láser de excitación de 488 nm y
filtros de detección de 530/30 nm y 675/30 nm. Los datos citométricos se analizaron
con el software NovoExpress y FloJo VX.

[Link] Cultivo de células

Las células de tumorales AU-565 derivadas de mamíferos que expresaban

receptores HER2 y EpCAM, así como las RAMOS, HER2, EpCAM negativo, se
obtuvieron de American Tissue Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA)
y se cultivaron en medio RPMI, suplementado con 10% de suero bovino, a 37ºC
en una atmósfera de CO2 al 5%.

106 Eduardo García-Rico

 5. Estudio III

[Link] Caracterización de Fluoróforos

Los perfiles de absorción y emisión para conjugados FITC y PerCP / Cy5.5 se

recogieron con un espectrofotómetro UV-visible Evolution 201 (ThermoScientific)
y Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer (Agilent Technologies).

[Link] Marcaje de Células para Análisis de Microscopía

Se recolectaron células AU-565 de placas de cultivo con tripsina / EDTA al 0,25%

y se sembraron en placas de 8 pocillos Ibidi a 1x106 células / pocillo, durante 24 a
37ºC en una atmósfera de CO2 al 5%. Al día siguiente, las células se lavaron con
PBS y se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS durante 30 min. A
continuación, las células se trataron con NP40 al 1% en PBS durante 15 min a 37ºC.
Se añadieron 2,0 µg/ml de anticuerpo HER2 ratón-anti-humano HER2 conjugado
con FITC (Abcam) y 2,0µg/ml de anticuerpo de ratón-antihumano conjugado con
EpCAM PerCP / Cy5.5 (Abcam) a células AU-565 durante 1 h de incubación a
37ºC. Finalmente, las células se lavaron tres veces con PBS y se añadió DAPI 100
nM para tinción de núcleos. Las células se analizaron mediante microscopía
confocal de barrido láser, utilizando láser de excitación de 488 nm y filtros de
detección de 540/30 nm y 650LP nm, para recoger la fluorescencia de FITC y
PerCP / Cy5.5, respectivamente. La fluorescencia DAPI se recogió con filtros de
epi-fluorescencia y las imágenes se procesaron con el software ImageJ.

[Link] Marcaje de Células para Microfluídica y Citometría de Flujo

Se recogieron las células de las placas de cultivo con tampón de disociación de

EDTA al 0,25% de PBS y se colocaron 1x106 células en suspensión en PBS 10%
de FBS. Por cada 100 μl de suspensión celular se añadieron (con la proporción AU-
565: RAMOS apropiada) 4 μl de anti-EpCAM-PerCP / Cy5.5 de ratón y 10 μl de
anti-HER2-FITC. A continuación, las células se lavaron por centrifugación a 170 g

Eduardo García-Rico 107

 Biopsia Líquida

durante 5 min y se suspendieron en PBS frío. Las muestras se midieron en el

dispositivo optofluídico y el citómetro de flujo.

[Link] Muestras clínicas

Los datos personales y clínicos se registraron según procedimientos clínicos

estándar, siendo anonimizados durante el procesamiento. Todos los especímenes se
obtuvieron con el consentimiento informado. El estudio fue aprobado por el Comité
local de Ética e Investigación con Medicamentos. Se extrajeron 8 ml de sangre en
10 ml de tubos vacutainer que contenían EDTA y se procesaron en las primeras 24
h. Los resultados para CTCs se vincularon a los datos clínicos.

[Link] Preparación de muestras clínicas

Se obtuvieron muestras de pacientes y donantes sanos en el Servicio de Oncología

Médica del Hospital Universitario Torrelodones-Madrid. Se aislaron células
mononucleares de sangre periférica (PBMC) usando Ficoll-Paque PLUS (adquirido
de GE Healthcare Life Science). Se añadieron 15 ml de solución de Ficoll a tubos
de centrifugación Leucosep de 50 ml (Greiner Bio One) y la sangre se dispuso como
una capa sobre Ficoll. Las muestras se centrifugaron a 400 g durante 40 min a
180ºC, y la capa de PBMC resultante se separó del resto de fases. Los PMBC se
lavaron dos veces en 10 ml de HBSS por centrifugación a 100 g durante 5 minutos
y finalmente se suspendieron en RPMI-1640 suplementado con FBS al 10%, hasta
su uso. A continuación, se precipitaron 1x107 células y se colocaron en 100 μl de
PBS 10% de FBS y se añadieron 4 μl de anti-EpCAM-PerCP / Cy5.5 y 10 μl de
anti-HER2-FITC. Después de 1 hora a TA, las células se lavaron por centrifugación
a 500 g durante 5 min y se suspendieron en PBS frío. Se siguieron los mismos
procedimientos para la medición de muestras clínicas en el dispositivo optofluídico
y el citómetro, como se mencionó anteriormente.

108 Eduardo García-Rico

 5. Estudio III

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112 Eduardo García-Rico

 6 ESTUDIO IV
BIOPSIA LÍQUIDA DE CÉLULAS:
METABÓLICA
RESUMEN

INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN

CONCLUSIONES

INFORMACIÓN
6.1 Procedimiento Metabólico SUPLEMENTARIA
para el Reconocimiento
REFERENCIAS
Universal de Células
Tumorales
 Biopsia Líquida

6.1.1 Resumen

La cuantificación de células tumorales circulantes (CTC) en muestras de sangre de

pacientes con cáncer es un enfoque no invasivo para monitorizar el estado de la
enfermedad. Permite medir de forma inmediata, y antes de que aparezcan
manifestaciones clínicas, la actividad de la enfermedad. Simultáneamente, también
permite evaluar la “enfermedad mínima residual” tras un tratamiento, las recaídas
tempranas y la eventual resistencia a los tratamientos. Pese a las ventajas teóricas
que ofrece esta metodología, aun no existe una técnica validada clínicamente. La
mayoría de los métodos propuestos en los últimos años son fenomenológicos y se
basan en el uso de anticuerpos marcados con fluoróforos o partículas magnéticas
inmovilizadas sobre superficies para capturar las células tumorales circulantes
(CTCs). Estos anticuerpos están dirigidos contra proteínas expresadas por las
células tumorales específicas, es decir, epiteliales, mesenquimales o con
características histológicas predefinidas. No son técnicas dirigidas a características
universales, es decir, comunes al “carácter” maligno. En este trabajo, se diseñó y
optimizó un método que emplea un análogo de glucosa marcado con un fluoróforo
que aprovecha las diferentes vías metabólicas de las células cancerosas para
discernirlas de células normales. Es característico de las células tumorales y común
a todas ellas, independientemente de su tipo histológico, el denominado “efecto
Warburg”. Se trata de la utilización preferente de la glicolisis aerobia,
independientemente de la presencia o no de oxígeno.

En particular, y como hallazgo destacable, se demuestra que la señal de

fluorescencia en las células tumorales se puede maximizar en gran medida mediante
la aplicación de condiciones de hiperoxia, sin dañar las células. Estos resultados se
demuestran en líneas celulares por fluorescencia confocal y mediciones de
citometría de flujo.

6.1.2 Introducción

La cuantificación de células tumorales circulantes (CTC) en muestras de sangre de

pacientes con cáncer es un enfoque no invasivo para monitorizar la actividad de la

114 Eduardo García-Rico

 6. Estudio IV

enfermedad. Se asume que los tumores primarios liberan al torrente circulatorio

células malignas que serían las responsables de la formación de metástasis y, por
tanto, del pronóstico de la enfermedad. En los últimos años se han propuesto
muchos dispositivos y métodos para la detección y cuantificación de CTCs (1,2,3).
En particular, todos estos métodos se basan en el uso de anticuerpos marcados con
fluoróforos, partículas magnéticas o inmovilizadas sobre superficies para capturar
las células. Sin embargo, el número de anticuerpos o aptámeros conocidos dirigidos
contra receptores específicos de membrana de células cancerosas es todavía muy
limitado, lo que incluye la familia HER (EGFR, HER2 y EGFR3), GD2, PSAm,
PDGF, etc. (4). Por lo tanto, la mayoría de los métodos, incluyendo el único
aprobado por la Food and Drug Administration norteamericana (CellSearch ®,
Janssen Diagnostics), utiliza anticuerpos contra los receptores epiteliales, como
(EpCAM) molécula epitelial de adhesión celular (5, 6). Es bien sabido que, en el
cáncer metastásico, las células tumorales experimentan una transición epitelial-
mesenquimal (EMT). En el EMT, las células epiteliales pierden su polaridad celular
y la adhesión célula a célula o célula a matriz extracelular, y adquieren las
propiedades migratorias e invasivas propias de las células mesenquimales o de las
células madre (7, 8). En esta situación, una fracción significativa de los CTC no
expresa ningún receptor epitelial residual y, por lo tanto, no se detecta (6, 7, 9).
Además, en la EMT se produce la pérdida de características epiteliales
(citoqueratinas, por ejemplo). Esto no significa que haya una conversión de células
epiteliales en células mesenquimales, con sus marcadores de proteína
correspondientes. Además, la detección de CTC basada en marcadores predefinidos
excluye la mayoría de las poblaciones y fenotipos tumorales secundarios
consecuencia de la enorme heterogeneidad intratumoral (tanto espacial, como
temporal). Una solución a este inconveniente se basa en el uso de las propiedades
metabólicas intrínsecas de las células tumorales que difieren de las de las sanas.
Específicamente, el efecto Warburg describe el aumento de la glicolisis aeróbica y
la absorción de glucosa en las células tumorales (10), independientemente de su
variabilidad fenotípica y genotípica. Este fenómeno se explota, por ejemplo, en la
tomografía de emisión de positrones (PET) en pacientes mediante la utilización de
2- [18F] fluoro-2-desoxi-D-glucosa (18F-FDG) (11). Este análogo de glucosa
marcado radioactivamente es internalizado por células tumorales en cantidades
mucho mayores que las células normales, a través de receptores de membrana
específicos de glucosa (GLUT) que se sobreexpresan universalmente en dichas

Eduardo García-Rico 115

 Biopsia Líquida

células. La señal de PET de las células tumorales es, por consiguiente, más alta que
en los tejidos circundantes y, por lo tanto, puede usarse para determinar la posición
del tumor dentro del cuerpo (12, 13).

En este trabajo, se diseña y optimiza un método que emplea un análogo de glucosa

(2DG o 2-deoxiglucosa) marcado con un fluoróforo de 2-[N-(7-nitrobenzo-2-oxa-
1,3-diazol-4-yl) amino]-2-desoxi-D-glucosa (2-NBDG) (14). Debido a la mayor
captación de glucosa, la señal de fluorescencia de las células tumorales es mayor
que las células normales, lo que permite su discriminación y cuantificación
mediante citometría de flujo estándar. En particular, la diferencia de señal se
maximizó bajo condiciones de alto nivel de oxígeno (es decir, hiperoxia). Para este
estudio, se evaluaron células MCF-7 añadidas en cantidades distintas a muestras de
sangre de donantes sanos. MCF-7 son células epiteliales humanas de cáncer de
mama que se han utilizado ampliamente para la investigación del cáncer de mama,
especialmente por su expresión de los receptores de estrógenos que facilitan la
respuesta hormonal (15-18).

6.1.3 Objetivos

• Detectar células tumorales circulantes aprovechando la propiedad universal

de las células malignas denominada efecto Warburg.
• Optimizar las condiciones en las que es posible dicha detección, alterando
las condiciones del microambiente tumoral.
• Determinar el papel del oxígeno como factor capaz de incrementar la
sensibilidad de este procedimiento.

6.1.4 Resultados y Discusión

El fluoróforo 2-NBDG (2-[N-(7-nitrobenceno-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino]-2-

deoxy-D-glucose se caracteriza por una absorción azul a 465 nm, lo que produce
una emisión intensa a 540 nm tras la excitación con una línea láser azul (Figura

116 Eduardo García-Rico

 6. Estudio IV

1A). Esta molécula se puede utilizar para teñir las células para su estudio mediante
imágenes de fluorescencia confocal (19). Sin embargo, como se muestra en la
Figura 1B, la diferencia en la intensidad de fluorescencia entre las células normales
utilizadas como control (BEAS-2B) y tumorales (MCF-7) después de la incubación
con 2-NBDG es demasiado baja para distinguir unívocamente los diversos tipos de
células. Se utilizó una tercera línea celular epitelial benigna de mama como control,
además de las células BEAS-2B (epiteliales benignas de pulmón).

Se investigaron varios parámetros experimentales (tiempo de incubación, fuerza

iónica, pH, temperatura y contenido de oxígeno) para maximizar la diferencia en la
emisión de fluorescencia entre células sanas y tumorales. En particular, las
alteraciones de la fuerza iónica, el pH y la temperatura no produjeron ningún efecto
relevante. En cuanto al tiempo de incubación, no se alcanzó ninguna meseta en 30
minutos. Sin embargo, mayores tiempos de incubación aumentaron la fracción de
células sufriendo apoptosis o autofagia debido al agotamiento de los factores de
crecimiento (20). De hecho, la 2-desoxi-D-glucosa (2DG), forma no fluorescente
de 2-NBDG, induce estrés oxidativo y secundariamente apoptosis en las células
cancerosas (21). Más interesante es, sin embargo, el caso de la concentración de
oxígeno. La incubación de células cancerosas en ausencia de oxígeno (hipoxia) se
ha utilizado con frecuencia en la literatura para el cultivo de células tumorales con
el fin de establecer líneas celulares (22,23) Por el contrario, la hiperoxia rara vez se
emplea o estudia. Una razón es que el tratamiento a largo plazo en la hiperoxia ha
demostrado tener efectos adversos sobre las células (24, 25). Por otro lado, se
esperaría que un mayor nivel de oxígeno aumentaría la captación relativa de
glucosa por parte de las células tumorales frente a las normales, ya que la vía
respiratoria preferente en las células normales es la fosforilación oxidativa mientras
que las tumorales, por el efecto Warburg, no estarían utilizando esta vía
(dependiente del oxígeno). Este es el concepto que se ensayó en este trabajo. El
objetivo planteado fue, por tanto, aumentar el “contraste” en cuanto a la captación
de glucosa, entre las células normales y las tumorales.

El metabolismo celular puede ser regulado a través de los cambios de su

microambiente. Por lo tanto, para lograr la máxima diferenciación entre células
tumorales y células sanas, se optimizaron varios parámetros. Se incubaron células
sanas y tumorales con 2-NBDG durante tiempos diferentes, de 1 a 30 min.

Eduardo García-Rico 117

 Biopsia Líquida

Figura 40: Perfiles de absorción y emisión de los fluoróforos utilizados.

Figura 1: (A) Absorción y perfiles de emisión de 2-NBDG y APC. Las flechas punteadas indican
las líneas de excitación. Estructura molecular de 2-NBDG. (B) imágenes de microscopía de
fluorescencia de captación de 2-NBDG para PBMC y MCF-7 incubadas con 300 μM 2-NBDG
durante 30 minutos en muestras que contenían relaciones celulares de 1:10 MCF-7: PBMC. Las
barras indican 40 μm.

Se diseñaron un conjunto de experimentos introduciendo variaciones en las

concentraciones de oxígeno (hipoxia, normoxia e hiperoxia) con el ánimo de
incrementar el contraste de intensidades entre una población tumoral y una
población de PBMC (peripheral mononuclear cells). Esta última es la población que
encontraríamos en un procedimiento de biopsia líquida, mediante separación de
células mononucleares en gradiente de Ficoll. Para las PBMC, la fluorescencia se
incrementa levemente en el curso del tiempo. Alemas, la concentración de oxígeno
no parece modificar dicha intensidad. Para las células tumorales (MCF-7), aunque
la intensidad se incrementa considerablemente con el tiempo, tanto en hipoxia como
en normoxia, en hiperoxia el incremento es significativamente mayor. La Figura 2B
muestra la diferencia radiométrica de emisión entre PBMC y MCF-7, obtenida
dividiendo la intensidad de señal de las células tumorales entre la misma en las
células sanas, en función de las condiciones de oxígeno. Dichos resultados se
confirmaron mediante microscopía confocal de fluorescencia (Figura 3). En este
último panel se observa un marcado incremento de intensidad si se compara con la

118 Eduardo García-Rico

 6. Estudio IV

Figura 1B. Teniendo en cuenta estos resultados, se seleccionaron como condiciones

óptimas 30 minutos de incubación e hiperoxia.

Figura 41: Optimización de las condiciones de cultivo, concentración oxígeno y tiempos.

Figura 2: (A) Optimización del tiempo de incubación de 2-NBDG en diferentes microambientes:
hipoxia, normoxia e hiperoxia. Gráfico de paredes 3D con la condición de oxígeno para cada línea
celular en el eje z, tiempo de incubación (min) en el eje x, e intensidad de 2-NBDG. En el eje y, los
resultados se presentan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes (n =
3) para muestras que contienen relaciones celulares de 1:10 MCF-7: PBMC. Se registraron los
valores medianos de 10.000 eventos de citometría para cada muestra. La prueba de Kruskal-Wallis
reveló una diferencia significativa entre las células cancerosas (MCF-7) y normales (PBMC) en
condiciones optimizadas, p <0,01. (B) Diferencia radiométrica en fluorescencia 2-NBDG entre
PBMC y MCF-7 obtenida dividiendo la intensidad de señal de la célula tumoral por la de las células
normales, en función de las condiciones de oxígeno.

Una vez comprobada la capacidad del método para discriminar células tumorales
MCF7 en relación con células epiteliales benignas, con fundamento hipotético en
el efecto Warburg (una característica universal de las células tumorales), así como
definidas las condiciones óptimas (hiperoxia), se procedió a simular las condiciones
de una biopsia líquida real. Para ello, se realizó una siembra (spiked) de distintas
concentraciones de células MCF7 (entre 1:1 y 1:10.000, incluidas las condiciones
óptimas: 300 µM NBDG en “buffer” fosfato –PBS- , 30 minutos en hiperoxia) en
muestras reales de células mononucleares de sangre periférica de donantes sanos
(PBMC), extraídas mediante gradiente de densidad en Ficoll.

Se utilizó NBDG como marcador metabólico y CD45 como marcador de las células
mononucleares no tumorales (PBMC). Tras su extracción mediante Ficoll, las
PBMC (Peripherical Blood Mononuclear Cells) se co-cultivaron en distintas

Eduardo García-Rico 119

 Biopsia Líquida

condiciones de oxigenación y tiempos con MCF7. Después de 30 minutos de

incubación, las muestras se lavaron y procesaron por citometría de flujo. Se
utilizaron láseres azules (488 nm) y rojo (640 nm) para detectar las dos poblaciones:
MCF-7 en azul y PBMC en rojo (Figura 4). Los eventos positivos son mostrados
en verde, mientras que los eventos en rojo o en rojo y verde se consideraron
negativos. Los resultados muestran claramente la capacidad del método para
discriminar células tumorales en un contexto real. En la figura 5A se muestra la
concordancia entre el número esperado de eventos y el real. En este aspecto, es
posible extraer, para cualquier ratio de células, una señal promedio de la
fluorescencia intrínseca de cada célula individual. Esto se obtiene dividiendo la
fluorescencia total, resultado del tratamiento de las con PBMC y MCF-7 con 2-
NBDG, entre el número de eventos de cada línea celular en cada muestra. El
resultado se muestra en la Figura 5B Para cualquier ratio de células, la fluorescencia
de las células tumorales es doble en intensidad que la correspondiente a las células
normales, permitiendo el reconocimiento de eventos únicos incluso a altas
diluciones.

Figura 42: Microscopia confocal una vez optimizadas las condiciones.

Figura 3: Imágenes de microscopía de fluorescencia en de absorción de 2- NBDG para PBMC y
MCF-7 en condiciones optimizadas para muestras que contenían relaciones celulares de 1:10 MCF-
7: PBMC. Barras de escala = 40 μm.

120 Eduardo García-Rico

 6. Estudio IV

Figura 43: Resultados de la citometría de flujo.

Figura 4: Diagramas de citometría de flujo de muestras de MCF-7 y PBMCs con relaciones
celulares (A) 1:10, (B) 1: 100, (C) 1: 1000, (D) 1: 10000 y (E) Sólo PBMCs; Tras la incubación con
2-NBDG y CD45-APC durante 30 minutos bajo condiciones de hiperoxia. (F-I) Distribuciones de
intensidades de fluorescencia para (F) 2-NBDG y (G) CD45-APC, en una muestra con una relación
1: 1000 MCF-7: PBMC; Y (H) 2 - NBDG y (I) CD45 - APC, en una muestra de PBMC.

Figura 44: Correlación entre proporciones esperadas de células y reales. Fluorescencia promedio.
Figura 5: (A) Comparación entre las proporciones esperadas y medidas de MCF-7: PBMC para las
muestras incubadas con 2-NBDG y CD-45 durante 30 min bajo hiperoxia. (B) Intensidades de
fluorescencia normalizadas por célula para PBMC y MCF-7 tratadas con 2-NBDG bajo contenido
de oxígeno optimizado y condiciones de tiempo de incubación. Muestras con relaciones celulares
de 1:10, 1: 100, 1: 1000 y 1: 10000.

Eduardo García-Rico 121

 Biopsia Líquida

6.1.5 Conclusiones

La detección de células tumorales circulantes (CTC) en el torrente sanguíneo es el

núcleo de la biopsia líquida.

En este estudio se muestra la factibilidad de usar 2-NBDG para identificar células

tumorales en un medio que contenga otros tipos celulares benignos, particularmente
el medio característico de una biopsia líquida: sangre periférica. Se realiza mediante
el uso de citometría de flujo y se optimizan las condiciones de concentración de
oxígeno y tiempos de incubación.

Este método plantea las premisas para el desarrollo de una nueva generación de
biopsias líquidas, basándose en una propiedad universal e intrínseca de las células
tumorales más que en características fenomenológicas (como la presencia de una
proteína de membrana, etc.). El método aquí propuesto puede superar la mayor
dificultad que encuentran las biopsias líquidas basadas en expresión específica de
marcadores: la heterogeneidad tumoral.

6.1.6 Información Suplementaria (Materiales y Métodos)

[Link] Cultivos celulares

Las células tumorales MCF-7 y células MCF-12A derivadas de células mamarias y

las células epiteliales bronquiales humanas normales BEAS-2B se obtuvieron de la
American Tissue Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA). Se cultivaron
MCF-7 en medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) con suero bovino fetal al 10%
(FBS) y 0,01 mg / ml de insulina humana recombinante. Se cultivaron MCF-12A
en medio de Eagle modificado por Dulbecco y medio F12 de Ham (mezcla 1: 1 de
DMEM / F12) con suero de caballo al 5%, hidrocortisona 500 ng / ml, 0,01 mg / ml
de insulina bovina 100 nm / ml de toxina cólera y 20 ng / ml de factor de crecimiento
epidérmico humano. BEAS-2B se cultivaron en BEGMTM (medio de crecimiento
epitelial bronquial), suplementado con el contenido del kit BEGMTM

122 Eduardo García-Rico

 6. Estudio IV

SingleQuotsTM (catálogo Nº CC-4175). Las células se mantuvieron a 37º C en un

ambiente humidificado al 5% de CO2.

[Link] Funcionalización de CdSe Qdot

Los CdSe Qdot 625 ITK (adquirido a Molecular Probes, Life Technologies) se
funcionalizaron con amino-polietilenglicol (amino-PEG) 5000 MW, mediante
acoplamiento EDC para aumentar su biocompatibilidad. Se dispersaron 1 μM de
cada Qdot en solución tampón MES 10 mM (pH = 6,0) y se añadieron amino-PEG
con una relación molar 1 (quantum dot) : 100 (amino-PEG). Se añadió 1-etil-3- (3-
dimetilaminopropil) carbodiimida, EDC, sobre la base de una relación molar de 1:
1, y la reacción se dejó durante 2 h. Después, la solución se centrifugó para eliminar
los agregados grandes a 13.000 rpm durante 20 min, y el sedimento se recogió por
centrifugación inversa a 2.000 rpm durante 3 min. La funcionalidad de los quantum
dots se verificó mediante evaluación de su estabilidad bajo disolventes de fuerza
iónica superior, usando fluorímetro.

[Link] Marcaje celular con Qdot@amino-PEG

Para identificar con éxito diferentes tipos de células en una mezcla de células, se
funcionalizaron previamente los Qdot 625 y 685 y se utilizaron como
identificadores intracelulares para células MCF12A y MCF7, respectivamente.
50.000 células / pocillos de cada tipo se cultivaron por separado sobre cubiertas de
vidrio dentro de placas de 12 pocillos y dejaron crecer durante 48 h, a 5% de CO2 y
37ºC. A continuación, las células se lavaron con PBS 1x precalentado durante 1
minuto y se añadieron 100 nM de cada Qdot@amino-PEG en el medio de
crecimiento celular. Se esperó durante 1 hora. Después de la incubación, las células
se lavaron 3 veces con 1x PBS. Las células MCF7 (marcadas con Qdot685) se
separaron de la superficie usando solución de tripsina-EDTA al 0,25% y se
volvieron a cultivar junto con las células MCF12A (Qdot625). Las células co-
cultivadas se dejaron durante 12 h, con 5% de CO2 a 37ºC.

Eduardo García-Rico 123

 Biopsia Líquida

[Link] Optimización de la captación de 2-NBDG en muestras de PBMC.

1- En cultivo:

Para estudiar la captación y retención generales de glucosa, las células fueron

expuestas a 300 μM de 2-NBDG para diferentes tiempos de incubación: 0, 1, 5, 10,
20, 30 y 60 min. Para lograr una mayor acumulación de 2-NBDG dentro de células
MCF7, las células fueron expuestas a diferentes condiciones basadas en la
concentración de oxígeno disuelto, temperatura, pH y concentración de sodio. Los
efectos sobre la disponibilidad de oxıgeno se evaluaron exponiendo las células al
entorno de hiperoxia o hipoxia, creadas burbujeando medios de incubación de 2-
NBDG durante 20 minutos con oxígeno o nitrógeno, respectivamente. El efecto de
la temperatura se estudió cultivando células a 40ºC, 200ºC o 37ºC. El efecto del pH
se evaluó a los valores de 7,3, 7,6 y 7,9, respectivamente. Finalmente, se investigó
el efecto de concentración de ion sodio, añadiendo solución de NaCl para alcanzar
10 mM y 50 mM (concentración final). Posteriormente, las células se fijaron con
solución de paraformaldehído al 4% en 1x PBS, durante 20 minutos, y después se
lavaron 6 veces con 1xPBS y se montaron sobre láminas de vidrio con Fluoromount
G (Southern Biotech), para las mediciones de fluorescencia.

Se cultivaron rutinariamente MCF12A, una línea celular derivada de epitelio

mamario mamario, y una línea celular de cáncer de mama MCF7 (American Type
Culture Collection, ATCC, Manassas, VA, [Link].) en DMEM / F-12
suplementado con 20 ng / ml de factor de crecimiento epidérmico humano, 100 ng
/ ml de toxina de cólera, 0,01 mg / ml de insulina bovina, 500 ng / ml de
hidrocortisona al 95% y suero de caballo donante al 5%; Y en EMEM suplementado
con 10% de suero bovino fetal, 0,01 mg / ml de insulina humana recombinante, 2
mM de L-glutamina y 1% de Penicilina-Estreptomicina, respectivamente. Cada
línea celular se cultivó en una atmósfera humidificada con CO2 al 5% a 37ºC.

2- En PBMC (Ficoll):

Cantidades determinadas de células tumorales MCF-7 se introdujeron en PBMC

recogidas de donantes sanos. Las células se sedimentaron y se colocaron en 100 μl
de PBS 10% de FBS, 4 μl de anti-CD45-APC (para PBMC) y 100 μL de 2-NBDG

124 Eduardo García-Rico

 6. Estudio IV

300 μM para diferentes tiempos de incubación y disponibilidad de oxígeno: 0 min,

10 min y 30 min; Hipoxia, normoxia e hiperoxia. El entorno de hipoxia se construyó
por burbujeo de gas nitrógeno en la solución de 2-NBDG, durante 20 minutos y se
utilizó gas oxígeno para la condición de hiperoxia. Después, las células se lavaron
dos veces por centrifugación a 250 g durante 10 min y se suspendieron en PBS frío.
Adicionalmente, se seleccionaron diferentes cantidades de células cancerosas
MCF-7 y se introdujeron en la sangre: 100.000; 10.000; 1.000 y 100 células para
1x106 PBMCs. Se añadieron las mismas cantidades de marcadores, como se
describió anteriormente, y 300 μM, 30 minutos de tiempo y entorno de hiperoxia
fueron utilizados para la incubación con 2-NBDG, como condición optimizada.

[Link] Medición de la muestra con el citómetro de flujo

La citometría de flujo de las muestras se llevó a cabo en un citómetro de flujo

NovoCyte (de AceaBiosciences), equipado con láseres de excitación de 488 nm y
640 nm y filtros de detección de 530/30 nm y 675/30 nm. Los datos citométricos se
analizaron con el software NovoExpress y FloJo VX.

[Link] Análisis de microscopía confocal por barrido láser

Se recolectaron células MCF-7 de las placas de cultivo con tampón de disociación

celular y 100.000 células se lavaron en 1x106 PBMCs. Se añadieron las mismas
cantidades de marcadores, como se ha descrito anteriormente, y se usaron 300 μM
y 30 minutos de tiempo para la incubación con 2-NBDG bajo condiciones de
hiperoxia, como condición optimizada; y 10 min bajo normoxia se utilizaron como
condición no optimizada. Después, las células se lavaron dos veces por
centrifugación a 250 g durante 10 min y se suspendieron en PBS frío. Finalmente,
se dispusieron 100 μl de solución de células en placas de μ-Ibidi de 8 pocillos y se
analizaron mediante microscopía confocal de barrido por láser, utilizando láseres
de excitación de 488 nm y 532 nm y filtros 515/30 nm y 650LP para recoger la
fluorescencia. Se aplicaron las mismas condiciones de exposición para comparar

Eduardo García-Rico 125

 Biopsia Líquida

las intensidades de fluorescencia 2-NBDG entre las muestras: 40 x macrolense,

69,3% de potencia láser, 13,20 píxeles.

[Link] Análisis estadístico

Se realizó un análisis estadístico para verificar si las diferencias de intensidad entre

la línea celular, la condición de oxígeno y el tiempo de incubación eran
significativas. Se seleccionaron un total de 10.000 eventos citométricos (n =
10.000) por muestra. La normalidad de los datos se comprobó mediante una prueba
de Kolmogorov-Smirmow, que mostró una distribución no normal; por lo tanto, los
datos se presentan como medianas. Para la comparación de más de 2 grupos no
paramétricos se realizaron test de Krustal-Wallis y pruebas post hoc en el software
SPSS 22. La significación se estableció en P <0,01.

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 6. Estudio IV

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128 Eduardo García-Rico

 6. Estudio IV

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Eduardo García-Rico 129

 7 RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
RESUMEN

OTROS HALLAZGOS
PERSPECTIVAS

La existencia de CTCs fue planteada por primera vez por Thomas Ashword en 1869
(Ashworth 1869) estudiando la sangre de un paciente fallecido por un cáncer. Sin
embargo, hasta 100 años después no se implementaron las primeras técnicas con
capacidad para detectar este tipo de células tan escasas (1/106 células
mononucleares en sangre). Salgado, en 1959 (Salgado, Hopkirk et al. 1959), y
Alexander, en 1960 (Alexander and Spriggs 1960), tomaron muestras de pacientes
 Biopsia Líquida

con cáncer, aislando células que posteriormente sembraron en sangre donada por
personas sanas con la intención de “redetectarlas” (spiking). La primera técnica
inmunomagnética se introdujo en 1998 (Racila et al. 1998) . Sin embargo, aún
faltaban tecnologías capaces de reproducir estos hallazgos y, sobre todo, faltaba la
explicación de su significado, ya que no siempre que se encontraban dichas células
malignas aparecían metástasis. Por otro lado, en biopsias de médula ósea de
pacientes con cáncer de mama en estadios muy precoces (estadios I) algunos autores
(Redding et al. 1983, Balic et al. 2013), fueron capaces de aislar células malignas.
Este hecho parece tener lugar al menos en un 3% de los estadios I/II de esta
enfermedad. Se desconoce el significado de este hallazgo, pero se ha relacionado
con las recaídas tardías del cáncer de mama. A estas células, presentes desde
estadios precoces, pero solo activas muy tardíamente (en ocasiones hasta 20 años
tras el diagnóstico) se las ha denominado células malignas “durmientes”.

La mayor parte de los estudios de biopsia líquida han sido realizados mediante
técnicas inmunohistoquímicas, es decir, mediante una preselección de los
marcadores que se buscan en la célula diana (Cristofanilli et al. 2004) , por lo que
el conocimiento de la dinámica de las metástasis es aún muy limitado. La hipótesis
en que se fundan presupone que el fenotipo tumoral es epitelial. Las estrategias
diseñadas hasta la actualidad para la enumeración y, en su caso, caracterización de
las CTCs, pueden dividirse en dos grandes categorías en función de si se plantea
una etapa previa de concentración: procedimientos con o sin enriquecimiento
celular. Dada la bajísima cantidad de células tumorales circulantes (1 x 106
mononucleares, o +/- 1 célula por ml de sangre total), en el primer caso se realiza
un “enriquecimiento” previo al estudio, procedimiento que podrá ser negativo (por
eliminación de células sanguíneas no tumorales) o positivo (por selección de las
células malignas) (Millner et al. 2013, Ferreira, et al. 2016). En el segundo caso, sin
enriquecimiento, se procede al estudio directo de la muestra tal como se obtiene. A
continuación, se describen algunas técnicas representativas de distintos enfoques
metodológicos:

• Basados en gradientes de densidad: Ficoll (se separan células

mononucleares de la muestra de sangre completa).
• Basados en antígenos de membrana, tanto de los leucocitos o células
hematopoyéticas (CD45), como de las propias células tumorales

132 Eduardo García-Rico

 7. Resultados y Discusión

(EpCAM). Casi todas estas técnicas son específicas de tumor

(mama, colon, pulmón o próstata), ya que es preciso conocer los
anticuerpos que se utilizarán. Una variante (MACS: Antigen
Activated Cell Sorting) utiliza el mismo fundamento, pero con
tecnología de citometría de flujo y la posibilidad de aislar las células
(sorting)
• Basados en el tamaño: se presupone que el tamaño de las CTCs es
mayor que el resto de células sanguíneas, por lo que se explota esta
característica, haciendo pasar la sangre por membranas con poros o
por recorridos con barreras (ISET©) (Tan, Yobas et al. 2009).
• Basados en electrolisis (Zheng et al. 2007)
• EPISPOT®: depleción con anti CD45, selección positiva con
CXCR4 y PSA o MUC1 (según el objetivo).
• Basados en PCR o FISH: detección de ADN específico intracelular.
• Dispositivos microfluidicos con anticuerpos fijos.
• HB-Chip (Herringbone Chip): basado en las variaciones de flujo
laminar en un sistema microfluídico.

Por otro lado, el ADN circulante fue descrito por primera vez en 1948 (Mandel and
Metais 1948) y relacionado con células metastásicas en 1954 (Watanabe 1954).
Aparece tanto en individuos sanos como enfermos, pero las concentraciones son
muy diferentes. Así, en sujetos sanos la concentración de ADN en sangre es de 1-
10 ng/ml y en pacientes con cáncer de colon fluctúa entre 22 y 3922 ng/ml, con una
media de 1157 (Leon et al. 1977, Schwarzenbach et al. 2008). La fracción de ADN
tumoral oscila entre 0,1% y 30% del ADN circulante total (ctDNA/cfDNA)

Se ha detectado ADN circulante aumentado en pacientes con traumatismos o

inflamación, por lo que es muy inespecífico. Algunas enfermedades autoinmunes
también cursan con un incremento de ADN en circulación, como el LES (Lupus
Eritematoso Sistémico). Una vez que comienza un tratamiento sistémico efectivo
en cáncer de colon metastásico, las concentraciones de ADN total se reducen
progresivamente (Schwarzenbach, et al. 2008). Así, el papel que podría jugar el
ADN circulante en el diagnóstico y pronóstico oncológico se podría enfocar de dos
maneras (igual que en el caso de las CTCs): cuantitativo y cualitativo. Este último
enfoque depende de la identificación específica de las secuencias y esto,

Eduardo García-Rico 133

 Biopsia Líquida

normalmente, dependerá a su vez de que dichas secuencias sean conocidas en

general o específicamente en el tumor primario.

El ADN circulante parece estar muy fragmentado, aunque respecto a esto no hay
un acuerdo unánime en la literatura. Así, Mouliere (Mouliere et al. 2011) sostiene
que las secuencias significativas son de menos de 150 pb. Otros autores sostienen
que son de 140 o más pb. La discrepancia se debe probablemente a las limitaciones
de la técnica utilizada, PCR cuantitativa. Aunque, por otro lado, dicho tamaño (+/-
140 pb), se corresponde con el tamaño (en unidades de pares de bases) del
nucleosoma, por lo que tendría fundamento encontrar fragmentos más
frecuentemente de este tamaño.

Las tecnologías más representativas son:

• ARMS/Scorpion: utiliza primers para iniciar una PCR si en la diana

está presente la secuencia complementaria.
• PCR digital: se generan “amplicones” de una sola plantilla
(template) de ADN que se marca con fluoróforos.
• Mutant-Enriched PCR: primers para el ADN no mutado y el mutado
diferentes y posterior digestión especifica del no mutado.
• BEAming: basado en la amplificación de moléculas únicas de ADN
tras un preprocesamiento en emulsion y posterior amplificación a
escala masiva.

Todas ellas son dependientes de PCR y, por tanto, precisan de una tecnología
centralizada y utilizada por personal especializado y dedicado.

134 Eduardo García-Rico

 7. Resultados y Discusión

Publicaciones sobre biomarcadores

Patentes sobre biomarcadores

Figura 45: El incremento de publicaciones acerca de biomarcadores es claramente más rápido que
su traslación cínica. Modificado de Elisabeth Drucker y Kurt Krapfenbauer 2013

Aun no existe un estándar para la práctica clínica de biopsias líquidas. En la Figura

45 puede observarse el retraso existente en el desarrollo de aplicaciones prácticas
de biomarcadores en general y el conocimiento académico de los mismos. Sólo hay
una tecnología aprobada en Estados Unidos, denominada CellSearch®, para la
enumeración de CTCs. Este retraso en la aplicación se debe a la enorme dificultad
que existe en la práctica para coordinar el diseño de procedimientos tecnológicos
nuevos con su disponibilidad en la práctica clínica común. Una práctica lo
suficientemente amplia como para la realización de ensayos clínicos prospectivos
con potencia estadística.

El objetivo general que en esta tesis se ha planteado consiste en la superación de la

dificultad reseñada mediante el desarrollo de nuevas estrategias. Así, se han
identificado dos niveles del problema: uno estratégico y otro tecnológico:

• Estratégico: es necesario un abordaje, directo o indirecto, pero

dirigido a la presencia de células tumorales circulantes o sus
productos, desde perspectivas generales. Es decir, considerando
propiedades universales de las células tumorales. Clásicamente esto
es lo que hasta la actualidad ha planteado la poliquimioterapia: el
abordaje de la proliferación como propiedad universal del cáncer.

Eduardo García-Rico 135

 Biopsia Líquida

• Técnico: es necesaria la aproximación de la tecnología a los puntos

de asistencia clínica, superando la necesidad de centralización y
personal especializado.

En esta tesis doctoral, siguiendo este análisis, se han planteado y cumplido los
siguientes objetivos, tanto metodológicos como estratégicos:

1- Desarrollo de un método rápido, simple y sin marcajes, que combinando la

técnica SERS con un análisis discriminante de mínimos cuadrados (PLS-
DA), permite el análisis de fragmentos de ADN largos con una sensibilidad
de una sola base (primer objetivo específico)

Se ha demostrado específicamente en la detección de mutaciones puntuales típicas

de cáncer de colon en el gen K-RAS en fragmentos que se han considerado típicos
de ADN tumoral circulante (el tamaño de un nucleosoma). El análisis de dichas
mutaciones es un problema clínico actual, ya que es preciso conocer dicho estatus
mutacional para decidir el tratamiento adecuado (en este caso CETUXIMAB si la
mutación está ausente). Hasta ahora la determinación debe realizarse sobre tejido
tumoral procedente de la cirugía. Por este método se obtiene una toma aislada, que
no permite una posterior monitorización.

Se partió del hecho previamente conocido de que los cambios en una sola base en
moléculas de ADN de una longitud determinada son capaces de modificar, bajo
determinadas, condiciones su conformación espacial. Se diseñó un modelo basado
en SERS para detectar, mediante nanopartículas, el espectro específico de cada uno
de los posibles cambios de base que tienen lugar en el gen K-RAS en cáncer de
colon. Posteriormente se correlacionó este método con el estándar: la secuenciación
o la SSCP (Single Strand Conformational Polimorphism).

La tecnología aportada cumple los requisitos que se plantean en los objetivos: es

sencilla, de bajo coste y aplicable en centros no especializados. El trabajo realizado
es una prueba de concepto. En el futuro es factible añadir más marcadores, incluso
de forma masiva, dado que la tecnología SERS lo permite.

2- Detección de la proteína c-MYC derivada de células tumorales circulantes

mediante la construcción de un receptor capaz de transducir dicha presencia
a través de las modificaciones específicas en un espectro SERS y
correlacionar la cuantificación de la proteína c-MYC derivada del

136 Eduardo García-Rico

 7. Resultados y Discusión

procedimiento anterior con la presencia de células tumorales, tanto de líneas

celulares como de muestras de sangre real de pacientes con cáncer,
demostrando así la posibilidad de detectar dichas células mediante un
procedimiento de discriminación genérico o universal (amplificación de c-
MYC) (segundo y tercer objetivo específico).

Se construyó un “receptor” específico de la proteína c-MYC, con fundamento en su

propiedad de heterodimerizarse con la proteína MAX. El receptor peptídico se unió
a materiales plasmónicos especialmente diseñados, de forma que determinados
eventos secundarios al reconocimiento del péptido/c-MYC, se tradujeron en
alteraciones medibles en el espectro. Para ello, el transductor (repórter SERS) se
diseñó de tal forma que sus cambios de orientación molecular en relación al sustrato
SERS se reflejasen en el espectro SERS, de acuerdo con las denominadas reglas
de selección superficial. Se comprobó la efectividad del sistema mediante líneas
tumorales con alta expresión de c-MYC y, posteriormente, se testó en sangre real
de un paciente con alta carga tumoral.

3- Diseño de un dispositivo microfluídico de flujo 3D, donde todas las ópticas

están integradas en el chip, para la cuantificación de fluorescencia de CTCs
en muestras reales y demostración de su efectividad (cuarto objetivo
específico).

Se diseñó un dispositivo microfluídico capaz de focalizar un microflujo en 3D, y

en el cual todas las ópticas se integraron en el chip, permitiendo la cuantificación
de fluorescencia de CTCs en muestras reales con una implementación técnica muy
sencilla y ligera. Para probar el rendimiento del chip, se seleccionaron dos objetivos
de membrana celular, la molécula de adhesión de células epiteliales, llamada
EpCAM, y el receptor tirosina-quinasa, HER2/neu (EGFR2). La eficacia de la
plataforma se testó en líneas celulares y en una variedad de donantes sanos y
pacientes con cáncer de mama metastásico.

4- Detección de células tumorales circulantes aprovechando la propiedad

universal de las células malignas denominada efecto Warburg o glicólisis
aerobia y manipular dicho efecto mediante la modificación de la
concentración de oxígeno en el microambiente tumoral (quinto y sexto
objetivo específico)

Eduardo García-Rico 137

 Biopsia Líquida

Se utilizó un modelo in vitro con líneas celulares de cáncer de mama (MCF7), en el

que dichas células fueron sometidas a distintas condiciones en su microambiente,
con objeto de comprobar su nivel de captación de glucosa. Se utilizó una molécula
de un derivado de glucosa marcado con un fluoróforo (NBDG) y los datos se
obtuvieron mediante citometría de flujo. Posteriormente se comprobó la efectividad
del método mediante un procedimiento de “spiking” de células MCF7 en sangre
real (tras separación de PBMC, mediante un gradiente de Ficoll), con resultados
concluyentes de su efectividad.

7.1 Otros hallazgos destacables

7.1.1 Proteína c-MYC como marcador surrogado

Existen dos cuestiones respecto a las biopsias líquidas cuya definición es

imprescindible para abordar la interpretación de sus resultados correctamente. Se
trata de la procedencia del ADN (ctDNA) o de las proteínas analizadas. Dicho ADN
puede proceder del tumor primario tras su necrosis o apoptosis de sus células, pero
también puede proceder de las propias células tumorales circulantes o de las ya
mencionadas células diseminadas circulantes (procedentes de las metástasis). Con
las proteínas ocurre lo mismo. Incluso podría ocurrir que el ADN o las proteínas
detectadas no procedieran de células tumorales, sino del propio tejido sano o de
células circulantes del sistema inmune (linfocitos, monocitos, etc.). En todo caso,
si los perfiles de expresión se consiguen correlacionar clínicamente con momentos
bien definidos de la enfermedad, este fenómeno también adquiere relevancia aun
no siendo dependiente de las células tumorales. Se trataría de un epifenómeno, pero
con valor diagnóstico o pronóstico. Esto podría estar ocurriendo con la detección
de c-MYC en PBMC. Aunque en este trabajo se ha utilizado solo un control sano
(una muestra escasa) hay publicaciones con resultados contradictorios. Es
destacable, sin embargo, que no existe ninguna publicación hasta la actualidad en
la que se evalúe la proteína c-MYC plasmática ni derivada de PBMC. Los trabajos
existentes, muy escasos, se refieren siempre a la amplificación de ADN de c-MYC,
lo cual no tiene por qué tener relación con el nivel de proteína. Por lo tanto, este es

138 Eduardo García-Rico

 7. Resultados y Discusión

el primer estudio publicado en el que se aborda esta cuestión. La cantidad total de

proteína celular está relacionada con la fase del ciclo celular dominante en la
población celular que se esté considerando. La variación de concentración de
proteínas intracelulares, por ejemplo, entre linfocitos inactivados (en G0 ) y
estimulados (G1 y/o G2) es de 20 o 30 veces (Engelhard et al. 1991).

Por todo lo anterior cabría esperar, dado que en sangre periférica las PBMC no
tumorales (linfocitos, fundamentalmente) no están activadas, que los incrementos
en la concentración de c-MYC de los extractos de PBMC, procederían de células
tumorales. Según Park (Park et al. 2009), la detección por PCR de cMYC en plasma
es capaz de distinguir pacientes con carcinoma gástrico de sanos con una
sensibilidad de 75,4 y una especificidad de 76,9, aunque con un punto de corte más
alto, la especificidad llega a 100%. En cáncer de próstata también se ha cuantificado
c-MYC, en este caso por FISH tras un aislamiento de células tumorales circulantes
basado en la presencia o no de EpCAM (marcador epitelial). En todos estos casos
se trata del ADN o del “gen” c-MYC, pero no de la proteína.

En conclusión, se demuestra que la presencia de células tumorales circulantes tiene

un impacto en la presencia de la proteína c-MYC en los extractos de proteínas de
PBMC en pacientes con cáncer.

7.1.2 La hiperoxia como factor inductor de un incremento de

captación de glucosa en las células tumorales.

En el cuarto trabajo aquí presentado se demuestra que la 2-deoxiglucosa marcada

(y por tanto la glucosa) se incorpora a las células tumorales de cáncer de mama
(MCF7) con mucha más intensidad que en las células mamarias benignas y que en
las células hematopoyéticas mononucleares. Ambos hechos fundamentan el diseño
de un método universal para la enumeración y posterior caracterización de células
tumorales circulantes, al menos en el caso del cáncer de mama. Este hallazgo abre
las puestas a una nueva estrategia de biopsia líquida.

Sorprendentemente, en un medio hiperóxico las células tumorales incrementan esta

captación de glucosa. Esto es un hecho apenas explorado o descrito en
publicaciones anteriores. La mayor parte de las publicaciones estudian ambientes
de hipoxia o de normoxia (Marchiq et al 2016, Mohlin, et al. 2016, Schito and

Eduardo García-Rico 139

 Biopsia Líquida

Smenza 2016, Vadde et al. 2017) dado que es la situación habitual en los tumores
reales (en el tejido tumoral) debido a su escaso aporte sanguíneo. Con este hallazgo
se plantea la hipótesis de que las células tumorales privilegiarían una vía metabólica
volcada a la síntesis de biomasa más que a la generación de energía (el efecto
Warburg sería su expresión). El oxígeno tendería a invertir esta situación, desviando
los recursos de glucosa hacia la fosforilación oxidativa, por lo que las células
tumorales requerirían más glucosa para mantener la situación en equilibrio. Hasta
ahora no se había descrito el efecto de incremento de captación de glucosa que la
hiperoxia induce en las células malignas.

7.2 Perspectivas

La metodología aquí presentada requiere una validación clínica para definir su

sensibilidad, especificidad, así como curvas ROC. Pero su utilidad no se limita a la
aplicación específica de las dianas que se han definido en este trabajo (c-MYC o
RAS). Se trata de pruebas de concepto que suponen la primera fase de estudios
clínicos posteriores. Los dispositivos presentados son ampliables a otras dianas.

Figura 46: Aplicación práctica de los hallazgos.

140 Eduardo García-Rico

 7. Resultados y Discusión

Por su sencillez de uso y bajo coste, dichos dispositivos pueden constituir un

instrumento clínico accesible una vez que las dianas han sido definidas por los
estudios centralizados. En la Figura 46 se muestra como los procesos de selección
de paneles de biomarcadores (investigación básica) convergen al aplicarse en
dispositivos y plataformas basadas en la tecnología que aquí se presenta.

La Figura 47 esquematiza los dos objetivos clínicos de las técnicas propuestas. Por
una parte, determinar la carga de enfermedad (con todas sus implicaciones
pronosticas, predictivas, detección de enfermedad residual o detección de recaídas,
etc.). Por otra parte, caracterizar la enfermedad o sus modificaciones en el tiempo.
Las cuatro tecnologías presentadas se integran en este esquema clínico común.

Figura 47: Diagrama del proceso de aplicación clínica de las técnicas de biopsia líquida propuestas.

Eduardo García-Rico 141

 Biopsia Líquida

142 Eduardo García-Rico

8 CONCLUSIONES
GENERALES
 Biopsia Líquida

144 Eduardo García-Rico

 8. Conclusiones Generales

1. En esta tesis doctoral se ha demostrado una nueva estrategia basada en la

técnica SERS sin marcaje para la detección de mutaciones puntuales en
grandes fragmentos de ADN. El potencial de esta técnica sensible, rápida,
directa y barata para el diagnóstico queda demostrado en la clasificación
inequívoca de mutaciones clínicamente relevantes en el oncogén K-RAS.
Es preciso validar tanto experimental como clínicamente en ensayos
prospectivos su aplicación clínica como biopsia líquida. En la actualidad,
aún no hay ninguna tecnología validada.

2. Se ha construido un receptor peptídico capaz de heterodimerizarse con la

proteína c-MYC, de forma que cuando esto ocurre las alteraciones
conformacionales que tienen lugar son transducidas a variaciones
características y específicas en el espectro SERS del receptor. Ha quedado
demostrada su efectividad frente a ELISA, técnica estándar.

3. Se ha planteado y demostrado un abordaje nuevo para la detección indirecta

de células tumorales circulantes a partir de la proteína c-MYC, proteína que
por encontrarse elevada en más del 70% de los tumores, puede convertirse,
mediante la metodología propuesta en esta tesis, en un nuevo biomarcador
indirecto de la presencia y cantidad de células tumorales circulantes.

4. Se ha diseñado y fabricado un chip optofluídico hidrodinámico de bajo coste

con todas las ópticas integradas, con el fin de realizar biopsias líquidas. Este
chip confina la muestra de tal modo que ha permitido detectar células
individuales, proporcionando, por lo tanto, una herramienta eficaz para
cuantificar el número de células tumorales circulantes en una muestra
líquida dada. El dispositivo se ha patentado y licenciado.

Eduardo García-Rico 145

 Biopsia Líquida

5. Se ha propuesto y demostrado una metodología nueva, que se ha

denominado biopsia líquida metabólica, para la detección de células
tumorales circulantes basada en las características metabólicas diferenciales
de estas células (consumo de glucosa) y se ha demostrado su efectividad en
cultivos, co-cultivos y pacientes reales. El método se ha patentado y
licenciado.

6. Se ha descrito por primera vez el efecto de la hiperoxia en la captación de

glucosa por las células malignas. Este efecto se ha utilizado para mejorar la
discriminación del método de biopsia líquida metabólica.

146 Eduardo García-Rico

9 REFERENCIAS
GENERALES
 Biopsia Líquida

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148 Eduardo García-Rico

 9. Referencias Generales

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 Biopsia Líquida

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150 Eduardo García-Rico

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Eduardo García-Rico 151

10 APÉNDICES
CONSIDERACIONES
ÉTICAS Y LEGALES

CONSENTIMIENTO
INFORMADO

RELACIÓN DE
ARTÍCULOS Y
CARACTERÍSTICAS
COPIA DE LOS
ARTÍCULOS
ORIGINALES
PATENTES
 Biopsia Líquida

154 Eduardo García-Rico

 10. Apéndices

A: AUTORIZACIÓN DEL COMITÉ DE ÉTICA

Apéndice A: Autorización del Comité de Ética

Eduardo García-Rico 155

 Biopsia Líquida

156 Eduardo García-Rico

 10. Apéndices

B: CONSIDERACIONES ÉTICO-LEGALES
Apéndice B: Consideraciones Ético-Legales
1- CONSIDERACIONES LEGALES:

Este estudio se llevará a cabo en cumplimiento con el protocolo, de acuerdo con la

Ley Orgánica 15/1999, de 13 de diciembre, de Protección de Datos de Carácter
Personal; la Ley 41/2002, de 14 de noviembre, básica reguladora de derechos y
obligaciones en materia de información y documentación clínica, la última versión
de la Declaración de Helsinki, el Convenio de Oviedo sobre derechos humanos y
biomedicina, asi como cualquier norma y/o legislación que le sea de aplicación.

El investigador, cuando firma el protocolo, se adhiere a las instrucciones y

procedimientos descritos en ellos y a la normativa legal vigente.

2-CONSIDERACIONES SOBRE LAS MUESTRAS:

Las muestras para la realización de este estudio serán analizadas y custodiadas en

los centros previamente reseñados para tal efecto. Las muestras serán recogidas en
tubos convencionales de analítica o en tubos especiales (diseñados para el
mantenimiento prolongado de muestras recién extraídas -72 h-). Una vez
procesadas las muestras serán destruidas.

Las muestras serán únicamente utilizadas para la investigación propuesta en este

protocolo. Bajo ninguna justificación las muestras saldrán de la custodia aquí
definida.

3-BENEFICIOS Y RIESGOS POTENCIALES PARA LOS PACIENTES:

Pueden no existir beneficios potenciales para los pacientes participantes en este

proyecto. Sin embargo, el mayor conocimiento de métodos de diagnóstico precoz,
screening, pronóstico y monitorización de tratamientos, podrá redundar en una
mejoría general de los métodos actualmente en uso.

Por lo que se refiere a los riesgos, no hay ningún riesgo asociado a la participación
en este estudio, ya que no se realiza ninguna exploración y/o procedimiento

Eduardo García-Rico 157

 Biopsia Líquida

adicional. Tampoco hay visitas específicas, ya que estas coincidirán con la práctica
habitual.

4-INFORMACIÓN AL PACIENTE:

La información al paciente se suministrará tanto de forma oral como escrita, en un

vocabulario legible y comprensible para un profano en esta materia.

El investigador conservará el consentimiento informado firmado en un archivo y

deberá documentarse, además, en los registros médicos de los pacientes.

158 Eduardo García-Rico

 10. Apéndices

C: CONSENTIMIENTO INFORMADO
Apéndice C: Consentimiento Informado
UTILIZACIÓN DE DATOS CLÍNICOS Y MATERIAL BIOLÓGICO EXCEDENTE DEL PROCESO
ASISTENCIAL PARA INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA.

En el [Nombre del Hospital], igual que en la mayoría de hospitales, además de la

asistencia a los pacientes, se realiza investigación biomédica. La finalidad de esta
investigación es progresar en el conocimiento de las enfermedades y en su
prevención, diagnóstico, pronóstico y tratamiento. Esta investigación biomédica
requiere recoger datos clínicos y muestras biológicas de pacientes y donantes
sanos para analizarlos y obtener conclusiones con el objetivo de conocer mejor las
enfermedades y avanzar su diagnóstico y/o tratamiento.
Las muestras y datos clínicos obtenidos para el diagnóstico o control de las
enfermedades, una vez utilizadas con esta finalidad, resultan también útiles y
necesarias para la investigación. De hecho, muchos de los avances científicos
obtenidos en los últimos años en medicina son fruto de este tipo de estudios.
Solicitamos su autorización para utilizar el material biológico sobrante de las
pruebas que, como parte del actual proceso asistencial, se le han realizado o se
le van a realizar en este centro, con el fin de que puedan ser utilizadas en
investigación biomédica.

Siguiendo lo establecido por la Ley 14/2007, de Investigación Biomédica, la Ley

Orgánica 15/1999, de Protección de Datos Personales, y sus normas de desarrollo,
le solicitamos que lea detenidamente este documento de información y el
consentimiento informado que se le adjunta al final para su firma, si está de
acuerdo en participar en esta propuesta

Muestras biológicas e información asociada:

en ningún caso se le practicarán más pruebas de las imprescindibles para su
adecuada atención médica.
Se guardará y dispondrá del material biológico sobrante que se le extraiga durante
el proceso asistencial (tejidos biológicos), sin que este hecho le cause molestias
adicionales. Las muestras y la información asociada a las mismas se custodiarán
y/o guardarán en [Nombre del Hospital] hasta su utilización. El sobrante será
destruido.

Los datos personales que se recojan serán obtenidos, tratados y almacenados

cumpliendo en todo momento el deber de secreto, de acuerdo con la legislación
vigente en materia de protección de datos de carácter personal.
La identificación de las muestras biológicas será sometida a un proceso de
codificación. A cada muestra se le asigna un código de identificación, que será el
utilizado por los investigadores. Únicamente el personal clínico responsable de su
asistencia podrá relacionar su identidad con los citados códigos. Mediante este
proceso los investigadores que utilicen las muestras no podrán conocer ningún

Eduardo García-Rico 159

 Biopsia Líquida

dato que revele su identidad. Asimismo, aunque los resultados obtenidos de la

investigación realizada con sus muestras se publiquen en revistas científicas, su
identidad no será facilitada. En aquellos estudios en los que no se prevean
resultados potencialmente útiles para su salud, y de acuerdo con el
correspondiente Comité de Ética, las muestras y datos podrán ser anonimizadas,
es decir, no habrá ninguna posibilidad de volver a asociar la muestra con su
identidad. La donación tiene por disposición legal carácter altruista, por lo que
usted no obtendrá ni ahora ni en el futuro ningún beneficio económico por la
misma, ni tendrá derechos sobre posibles beneficios comerciales de los
descubrimientos que puedan conseguirse como resultado de la investigación
biomédica. Sin embargo, los conocimientos obtenidos gracias a los estudios
llevados a cabo a partir de su muestra y de muchas otras pueden ayudar al avance
médico y, por ello, a otras personas.

Participación voluntaria. Su negativa NO repercutirá en su asistencia médica,

presente o futura
Su participación es totalmente voluntaria. Si firma el consentimiento informado,
confirmará que desea participar. Puede negarse a participar o retirar su
consentimiento en cualquier momento posterior a la firma sin tener que explicar
los motivos y esto no repercutirá negativamente en su asistencia médica, presente
o futura.

Revocación del consentimiento: si usted decide firmar este consentimiento,

podrá también cancelarlo libremente.
Si en un futuro usted quisiera anular su consentimiento, sus muestras biológicas
serían destruidas y los datos asociados a las mismas serían retirados del Biobanco.
También podría solicitar la anonimización de las muestras, en cuyo caso se
eliminaría la relación entre sus datos personales (que revelan su identidad) y sus
muestras biológicas y datos clínicos asociados. Los efectos de esta cancelación o
anonimización no se podrían extender a la investigación que ya se hubiera llevado
a cabo.
Si deseara anular su consentimiento, deberá solicitarlo por escrito al Director del
Biobanco, en la dirección anteriormente indicada.

Información sobre los resultados de la investigación: se le proporcionará

información si usted desea recibirla
En el caso de que usted lo solicite expresamente, el Biobanco podrá
proporcionarle información acerca de cuáles son las investigaciones en que se han
utilizado sus muestras y de los resultados globales de dichas investigaciones, salvo
en el caso de cancelación o anonimización.
Los métodos utilizados en investigación Biomédica suelen ser diferentes de los
aprobados para la práctica clínica, por lo que no deben de ser considerados con
valor clínico para usted. Sin embargo, en el caso que estas investigaciones
proporcionen datos que pudieran ser clínica o genéticamente relevantes para
usted e interesar a su salud o a la de su familia, le serán comunicados si así lo
estima oportuno. Asimismo, podría darse el caso de obtenerse información

160 Eduardo García-Rico

 10. Apéndices

relevante para su familia, le corresponderá a usted decidir si quiere o no

comunicárselo.

CONSENTIMIENTO INFORMADO
UTILIZACIÓN DE DATOS CLÍNICOS Y MATERIAL BIOLÓGICO EXCEDENTE DEL PROCESO
ASISTENCIAL PARA INVESTIGACIÓN BIOMEDICA

Nombre y apellidos del donante.....................................................................................

DNI……………………. Edad........................

Persona del centro que informa. .....................................................................................

DNI…………………….

El abajo firmante autoriza al Hospital [Nombre del Hospital] a que el material biológico sobrante
de las pruebas que se le han realizado o se le van a realizar como parte del actual proceso
asistencial sean utilizadas con la finalidad de llevar a cabo proyectos de investigación biomédica,
siempre que éstos cuenten con la obligada aprobación del Comité de Ética de Investigación
competente. Esta autorización la concede tras haber sido informado verbalmente y haber leído la
información adjunta.
Confirmo que:
1. Autorizo que el excedente de material biológico utilizado para pruebas diagnósticas y la
información clínica asociada se utilice para investigación en los términos recogidos en el
Documento de Información al Donante: SI NO

2. Deseo que se me comunique la información derivada de la investigación que realmente sea

relevante y aplicable para mi salud o la de mi familia SI NO Teléfono o E-mail de
contacto…………………………………

3. Autorizo a ser contactado en el caso de necesitar más información o muestras biológicas

adicionales

SI NO Teléfono o E-mail de contacto:……………………………………

4. He expresado mi deseo de que se respeten las siguientes excepciones respecto al objetivo y
métodos de las investigaciones:

………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………

DONANTE PERSONA QUE INFORMA

Firma Firma

En........................., a..…. de…………….. de.............

CONSENTIMIENTO INFORMADO ANTE TESTIGOS

Eduardo García-Rico 161

 Biopsia Líquida

UTILIZACIÓN DE DATOS CLÍNICOS Y MATERIAL BIOLÓGICO EXCEDENTE DEL PROCESO

ASISTENCIAL PARA INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA
Nombre y apellidos del donante.....................................................................................
DNI……………………. Edad........................
Nombre y apellidos del testigo que firma........................................................................
DNI…………………….
Relación con el donante:……………………………………
Persona del centro que informa. .....................................................................................
DNI…………………….

El abajo firmante confirma que el donante:

1. Autoriza al Hospital [Nombre del Hospital] a que el material biológico sobrante de las pruebas
que se le han realizado o se le van a realizar como parte del actual proceso asistencial sean
utilizadas con la finalidad de llevar a cabo proyectos de investigación biomédica, siempre que
éstos cuenten con la obligada aprobación del Comité de Ética de Investigación competente. Esta
autorización la concede tras haber sido informado verbalmente y haber leído la información
adjunta.

2. Desea que se le comunique la información derivada de la investigación que realmente sea

relevante y aplicable para su salud o la de su familia SI NO Teléfono o E-mail de
contacto…………………………………

3. Autoriza a ser contactado en el caso de necesitar más información o muestras biológicas

adicionales

SI NO Teléfono o E-mail de contacto: ……………………………………

4. Ha expresado su deseo de que se respeten las siguientes excepciones respecto al objetivo y
métodos de las investigaciones:

………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
5. Me autoriza a firmar en su nombre.

TESTIGO PERSONA QUE INFORMA

Firma Firma

En........................., a..…. de…………….. de.............

REVOCACIÓN DEL CONSENTIMIENTO

UTILIZACIÓN DE DATOS CLÍNICOS Y MATERIAL BIOLÓGICO EXCEDENTE DEL PROCESO
ASISTENCIAL PARA INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA

POR EL DONANTE:

Yo, D./Dña .......................................................................................... con DNI …………………………..

anulo el consentimiento prestado en fecha.......... de.......................de 20.......... y no deseo

162 Eduardo García-Rico

 10. Apéndices

proseguir la donación voluntaria al Biobanco [Nombre del Biobanco], que doy por finalizada al día
de hoy.
SOLICITO ELIMINACIÓN SOLO DE LA MUESTRA.
SOLICITO ELIMINACIÓN SOLO DE MIS DATOS PERSONALES.
La muestra quedará anonimizada irreversiblemente y podrá ser utilizada en proyectos de
investigación.
SOLICITO ELIMINACIÓN TOTAL DE MIS DATOS Y MUESTRAS.
Fdo.:
En......................a.......de....................de 20………

POR EL TUTOR/REPRESENTANTE LEGAL DEL DONANTE:

Yo, D./Dña ........................................................................ con DNI ……………………..………., Como

representante legal de D/Dña…………………………………………, con DNI…………………..………, anulo el
consentimiento prestado en fecha..........de.......................de 20.......y no deseo proseguir la
donación voluntaria al Biobanco [Nombre del Biobanco], que doy por finalizada al día de hoy.
SOLICITO ELIMINACIÓN SOLO DE LA MUESTRA.
SOLICITO ELIMINACIÓN SOLO LOS DATOS PERSONALES.
La muestra quedará anonimizada irreversiblemente y podrá ser utilizada en proyectos de
investigación.
SOLICITO ELIMINACIÓN TOTAL DE MIS DATOS Y MUESTRAS.
Fdo.:
En......................a.......de....................de 20………

Eduardo García-Rico 163

D: CARACTERÍSTICAS DE LAS PUBLICACIONES ORIGINALES
Apéndice D: Caracteristicas de las Publicaciones Originales

Andgewandte Journal of the American Chemical Scientific Reports (Nature) Oncotarget

Society (JACS)

Impact Factor 11,709 13,038 5,228 5,008

Cuartil Q1 Q1 Q1 Q1

Titulo Conformational SERS Classification Surface-Enhanced Raman Scatttering Optofluidic Device for the Metabolic Pathway for the Universal
of K-Ras Point Mutations for Cancer Surface Selection Rules for the Quantification of Circulating Tumor Fluorescent Recognition of Tumor
Diagnostics Proteomic Liquid Biopsy in Real Cells in Breast Cancer Cells
Samples: Efficient Detection of the
Oncoprotein c-MYC

Autores J Morla-Folch,P Gisbert-Quilis,M E Pazos,M Garcia-Algar,C Penas,M E Pedrol,M Garcia-Algar,J M Garcia-Algar,A Fernández, M
Masetti, E García-Rico, RA Alvarez Nazarenus,A Torruella,N Pazos, L Massons,M Nazarenuus,L Guerrini, Nazarenus, A Torres Nuñez, L
Puebla, L Guerrini Guerini,M E Vazquez, E Garcia- J Martinez, A Rodenas, A Guerrini, N Feliu, WJ Parak, E
Rico,JL Mascareñas, RA Alvarez Fernández,M Aguiló, L G Estévez,I García-Rico, RA Alvarez Puebla
Puebla Calvo, A Olano, E García-Rico, F
Diaz, RA Alvarez Puebla

Datos de Publicación 2017,56,2381-2385 2016, 138, 14206-14209 Aceptado, pendiente publicación Aceptado, pendiente de “minor
revision”
E: ARTÍCULOS ORIGINALES
Apéndice E: Artículos Originales
 Biopsia Líquida

Apéndice F: Copia de los Artículos Originales

166 Eduardo García-Rico

 10. Apéndices

Eduardo García-Rico 167

 Biopsia Líquida

168 Eduardo García-Rico

 10. Apéndices

Eduardo García-Rico 169

 Biopsia Líquida

170 Eduardo García-Rico

 10. Apéndices

Eduardo García-Rico 171

 Biopsia Líquida

172 Eduardo García-Rico

 10. Apéndices

Eduardo García-Rico 173

 Biopsia Líquida

CARTA DE ACEPTACIÓN DE “SCIENTIFIC REPORTS”

Prof. Ramón A. Alvarez-Puebla,

ICREA, Passeig Lluís Companys 23, 08010 Barcelona, Spain
Universitat Rovira i Virgili; Edifici N5, Campus de Sescelades, Carrer de Marcel·lí Domingo
SN, 43007 Tarragona, Spain
Tel: (+34) 977297083
Email: [Link]@[Link]
Website: [Link]

De: "scientificreports@[Link]" <scientificreports@[Link]>

Responder a: "scientificreports@[Link]" <scientificreports@[Link]>
Fecha: martes, 9 de mayo de 2017, 12:04
Para: Ramon Angel Alvarez Puebla <[Link]@[Link]>
Asunto: Scientific Reports: Decision letter for SREP-17-07906A

Dear Prof Alvarez Puebla,

We are delighted to accept your manuscript entitled "Optofluidic device for the quantification of
circulating tumor cells in breast cancer" for publication in Scientific Reports. Thank you for choosing to
publish your work with us.

You should have just received another email from scientificreports@[Link] with instructions for the next
step, which is to complete your publication agreements. To continue with your publication agreements you
will need to create a new account on this new system. Please complete these as soon as possible so we can
start preparing your manuscript for publication. The agreements include the licence, which defines the terms
of publication, and billing information for your Open Access article. Please see our FAQs page for further
information about article processing charges.

After we've prepared your paper for publication, you will receive a PDF proof for checking. At that point,
please check the author list and affiliations to ensure that they are correct. For the main text, only errors that
have been introduced during the production process or those that directly compromise the scientific integrity
of the paper may be corrected at this stage. Please ensure that only one author communicates with us and that
only one set of corrections is returned. The corresponding (or nominated) author is responsible on behalf of
all co-authors for the accuracy of all content, including spelling of names and current affiliations.

To ensure prompt publication, your proofs should be returned within two working days; please
contact [Link]@[Link] immediately if you wish to nominate a contributing author to receive
the proofs on your behalf.

Acceptance of your manuscript is conditional on all authors' agreement with our publication policies
(see[Link] In particular, your manuscript must not be published
elsewhere and there must be no announcement of this work to any media outlet until the publication date is
confirmed. We will inform you by email as soon as your manuscript is scheduled for publication, which will
be after we have received and approved your proof corrections. Advice about media relations is available
from NPG's press office at press@[Link].

Your article will be open for online commenting on the Scientific Reports website. You may use the report
facility if you see any comments which you consider inappropriate, and of course, you can contribute to
discussions yourself. If you wish to track comments on your article, please register for this service by visiting
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**A form to order reprints of your article is available at [Link]

[Link]. To obtain the special author reprint rate, orders must be made within a month of the publication
date. After that, reprints are charged at the normal (commercial) rate.**

We look forward to publishing your article.

Best regards,

Muhammad Shiddiky
Editorial Board Member
Scientific Reports

174 Eduardo García-Rico

 10. Apéndices

CARTA DE ACEPTACIÓN DE “ONCOTARGET”

Eduardo García-Rico 175

 Biopsia Líquida

176 Eduardo García-Rico

 10. Apéndices

F: PATENTES
Apéndice G: Patentes
APPARATUS AND METHOD FOR DETECTION OF TUMOUR CELLS AND
CIRCULATING TUMOUR CELLS (ESTUDIO IV DE ESTA TESIS
DOCTORAL)

Eduardo García-Rico 177

 Biopsia Líquida

178 Eduardo García-Rico

 10. Apéndices

Eduardo García-Rico 179

 Biopsia Líquida

180 Eduardo García-Rico

 10. Apéndices

Eduardo García-Rico 181

 Biopsia Líquida

182 Eduardo García-Rico

 10. Apéndices

Eduardo García-Rico 183

 Biopsia Líquida

184 Eduardo García-Rico

 10. Apéndices

Eduardo García-Rico 185

 Biopsia Líquida

OPTOFLUIDIC DEVIDE AND METHOD FOR DETECTING CIRCULATING

TUMOUR CELLS (ESTUDIO III DE ESTA TESIS DOCTORAL)

186 Eduardo García-Rico

 10. Apéndices

Eduardo García-Rico 187

 Biopsia Líquida

188 Eduardo García-Rico

 10. Apéndices

Eduardo García-Rico 189

 Biopsia Líquida

190 Eduardo García-Rico

 10. Apéndices

Eduardo García-Rico 191

 Biopsia Líquida

192 Eduardo García-Rico

 10. Apéndices

Eduardo García-Rico 193

 Biopsia Líquida

CRÉDITOS

Plantilla: Kayla Friedman y Malcolm Morgan (PhD Thesis/ Masters Dissertation Word
Template and Information and Requirements for Cambridge University)
Dibujo Agradecimientos (página iii): Adolfo de Carolis (Ilustración en L'Odissea, 1926,
Nicola Zanichelli editore; Bologna 1926).
Verso en dedicatoria: A. Machado
Versos en agradecimientos (página iii): Ítaca; C. P. Cavafis,

Ulysses Defying the Cyclops, LF Schutzenberger

194 Eduardo García-Rico