DESCALCIFICACIÓN
Cuando hay minerales en los tejidos, como por ejemplo en el hueso, dentina, o
en procesos patológicos calcificantes en tejidos blandos, es muy difícil obtener buenas
secciones finas, bien sea de material incluido en parafina o de material en congelación.
En estos casos el proceso histológico debe incluir un paso en el que se eliminan tales
minerales denominado generalmente como descalcificación, puesto que en la mayoría
de los casos se eliminan minerales de calcio. Hay, sin embargo, maneras de obtener
secciones de tejido mineralizado sin descalcificar. Por ejemplo mediante limado
progresivo se pueden conseguir láminas muy finas de material a modo de secciones
que se observan al microscopio óptico. Otro procedimiento es incluir los tejidos
mineralizados en resinas plásticas y obtener secciones semifinas con cuchillas
especiales de acero y microtomos muy robustos.
El principal mineral duro de los tejidos animales es la hidroxiapatita, mineral
de fosfato cálcico, [Ca10(PO4)6(OH)2], que se encuentra en los huesos distribuido entre
las fibras de colágeno. Estos minerales se encuentran en equilibrio con su solución
saturada según las siguiente reacción:
Ca10(PO4)6(OH)2 = 10Ca2+ + 6PO43- + 2OH-
Si eliminamos alguno de los componentes a la derecha de la reacción, el mineral
(a la izquierda) se disolverá para equilibrar de nuevo la solución. Este es el principio de
los descalcificantes. A la hora de elegir los tiempos y sustancias descalcificantes hay
que tener en cuenta si estamos interesados en el hueso compacto o en el esponjoso.
Por ejemplo, las sales minerales tardan más en disolverse en el hueso compacto.
La descalcificación se realiza normalmente después de la fijación, aunque a
veces se hace tras la inclusión en parafina eliminando la sales de calcio sólo de las
micras más superficiales del plano de corte de la muestra. Es importante realizar
una buena fijación del tejido puesto que será incubado en soluciones ácidas
relativamente agresivas. Además, es bueno eliminar bien los restos de fijador
con lavados abundantes para evitar reacciones química con los agentes
descalcificadores. Los tiempos de fijación del hueso que se va a descalcificar suelen
ser mucho mayores que para otros tejidos. El mejor método de fijación es la perfusión,
pero si no es posible es conveniente hacer piezas pequeñas con sierras de dientes
muy finos y eliminar los tejidos que rodean al hueso antes de sumergirlo en fijador. Los
mejores fijadores son Bouin, mezclas de formalina con zinc, o FAA (formol, acético,
alcohol).
Hay dos grupos principales de agentes descalcificantes: los ácidos y
los quelantes de calcio. A continuación veremos los descalficantes más comunes.
Basados en ácidos
Los ácidos aportan hidrógenos y eliminan iones hidroxilos del medio por lo que la
reacción antes mencionada tiende hacia la solubilización del mineral.
H+ + 2OH- = H2O
Hay dos grupos de ácidos: los fuertes (inorgánicos) y los débiles (orgánicos).
Los ácidos fuertes suelen ser rápidos pero son muy agresivos por lo que el tiempo
debe ser el mínimo posible, ya que si es excesivo producen daños en los núcleos y
maceran el tejido. Los ácidos débiles son más lentos pero preservan mejor al tejido.
Los ácidos fuertes más usados son el ácido clorhídrico, el ácido nítrico, mientras que el
débil es el ácido fórmico. Cuanto más agresivos son los ácidos más se deterioran las
enzimas y los antígenos para realizar pruebas enzimáticas o inmunocitoquímicas. Los
ácidos también deterioran los ARN citosólicos por lo que las hibridaciones in situ se
ven comprometidas
El ácido clorhídrico y el ácido nítrico se suelen usar al 5-10 % en agua.
Descalcifican rápidamente y su acción no debería prolongarse más de 24-48 horas. No
se recomiendan para inmunocitoquímica ni ensayos enzimáticos. Se emplean para
muestras pequeñas y diagnósticos rápidos.
El ácido fórmico es el ácido débil más usado como descalcificante. Se puede usar
en solución acuosa (5-10 %), tamponado (con ácido cítrico) o combinado con
formalina. En este último caso la descalcificación va acompañada de fijación. El tiempo
de tratamiento con ácidos débiles es más prolongada (1 a 10 días), dependiendo del
tamaño y tipo de hueso, y de la concentración de ácido. La solución debería cambiarse
cada 24 o 48 horas.
Otros ácidos débiles como en el acético o el ascórbico se usan cuando se van a
realizar pruebas inmunocitoquímicas. La descalcificación se realiza en estos casos con
pH por encima de 2.5.
Agentes quelantes
Los agentes quelantes son aquellas sustancias orgánicas que pueden unirse
covalentemente a iones metálicos formándose un compuesto soluble llamado quelato
de metal. El EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) secuestra iones de calcio,
presentes en los cristales de hidroxiapatita del hueso, por lo que progresivamente irá
disminuyendo el tamaño del cristal. Se usa entre el 10 y el 14 % en soluciones acuosas
o tamponadas. Es un proceso lento, la descalcificación se puede extender durante
semanas, pero aporta una buena preservación de la estructura tisular. Se puede
acelerar el proceso aumentando el pH de la solución (superior a 7), pero esto puede
afectar a la calidad del tejido. El EDTA une calcio superficial del cristal y por tanto lo
que se produce es una reducción progresiva del tamaño de los cristales. Es un proceso
muy lento (6 a 8 semanas) pero que no daña el tejido. Así, cuando el tiempo no es
importante es el método recomendado. La solución deberia cambiarse cada 3 a 5 días.
En cualquiera de los dos métodos, ácidos o quelantes, hay variables que pueden
disminuir el tiempo de descalcificación, como son el aumento de la temperatura o una
agitación suave del tejido. Hay otros más agresivos como sonicación o microondas,
pero hay que controlar los daños al tejido.
Averiguar el grado de descalcificación es importante para determinar el tiempo
necesario que tienen que incubarse las muestras en las soluciones descalcificadoras.
Ya se comentó que incrementos de tiempo innecesarios puede repercutir en la calidad
del tejido, pero si el tiempo es corto pueden quedar cristales en el tejido que dificulten
el corte y procesamiento del hueso. El calcio del mineral termina en solución y si la
solución descalcificante se cambia periódicamente se podrá averiguar cuándo se ha
producido la descalcificación completa mediante la medición de la concentración de
calcio en el medio. Cuando se emplean ácidos como descalcificantes se puede realizar
una comprobación química: se añade oxalato de amonio a la solución descalcificante,
que ha sido neutralizada con hidróxido amonio. Si hay calcio en la solución se forman
precipitados de oxalato de calcio, lo que indica que aún quedan minerales en el hueso.
A veces, sin embargo, es necesario mantener el contenido mineral del hueso y la
descalcificación no se lleva a cabo. En estos casos es posible obtener secciones
mediante procedimientos no convencionales. Por ejemplo, se puede serrar el hueso en
lonchas más a menos finas y luego limar las superficies hasta llegar a un grosor óptimo
para su observación con el microscopio. También se puede infiltrar el hueso
con resinas que al polimerizar alcanzan una dureza similar a la del hueso, y
posteriormente cortar la muestra incluida con microtomos especiales como el
ultramicrotomo cuando se usan cuchillas de diamante. Otra posibilidad es realizar
cortes por congelación.