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1. OBJETIVO
Conocer la carga microbiana en una superficie determinada en un volumen conocido de líquido.
2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE
Aplicar a muestras de hisopado de superficie recepcionadas en la Sección Microbiología de
Alimentos.
3. FUNDAMENTO
Es un procedimiento de lavado con torunda (hisopado) de un área conocida de la superficie a
investigar, limitada por una plantilla. Los microorganismos recogidos por la torunda se recuperan
en un volumen conocido de líquido con el que se realiza el recuento bacteriano.
4. REFERENCIAS
4.1 “Microbiología práctica de los alimentos”, Roberts D., Hooper W., Greenwood M.,
Editorial Acribia, 1995.
4.2 “Compendium of Methods for the Microbiological Examination of foods”. Fourth edition,
APHA [Link]íltulo 3.51
5. TERMINOLOGÍA
No Aplica
6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS
6.1 Materiales
6.1.1 Plantilla de aluminio de 25 cm2 estéril
6.1.2 Tórula estéril de algodón no absorbente de 0,5 cm de diámetro por 2 cm de largo
sobre un aplicador de madera de 12 a 15 cm de largo
6.1.3 Tórulas estériles de alginato de calcio o rayón también pueden ser usadas
6.1.4 Placas Petri
6.1.5 Pipetas estériles de 1 y 5 mL
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6.2 Reactivos y medios de cultivo
6.2.1 Solución de hexametafosfato de sodio al 1%, sodio glicerolfosfato o citrato de sodio
cuando se utilicen tórulas de alginato de calcio las cuales sus fibras son solubles en
estas soluciones acuosas.
6.2.2 Medio de transporte si se requiere
6.2.3 Frasco pequeño con tapa de rosca y con 5 perlas de vidrio de 3 mm de diámetro con
10 mL de Diluyente de máxima recuperación (MRD) o solución Ringer al cuarto de
concentración estéril.
6.2.4 Si se utilizan tórulas de alginato de calcio, se requieren frascos de 7 a 10 cm de largo
con 4,5 mL del buffer de enjuague.
NOTA: si se muestrea superficies que han sido higienizadas, se debe usar diluyente con algún
neutralizante como: 0,05 % de tiosulfato de sodio que neutraliza el cloro; 0,5% polisorbato
(Tween 80) más 0,07% de lecitina de soya, neutralizando el polisorbato los compuestos fenólicos
y la lecitina los amonios cuaternarios
6.2.5 Agar Plate Count u otro medio de cultivo apropiado según los microorganismos de
interés
6.3 Equipos
6.3.1 Incubadora regulada a 35°C ± 1°C
7. DESARROLLO
7.1 Toma de muestra:
7.1.1 Abrir asépticamente el contenedor estéril con la tórula, tomar la tórula por la parte
apical del aplicador de madera, cuidando de no tocar ninguna parte que será insertada en
el frasco.
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7.1.2 Abrir el frasco con el diluyente en forma aséptica.
7.1.3 Sumergir una torunda o tórula de algodón en una alícuota de 10 mL de diluyente (MRD
o líquido de Ringer al cuarto de concentración) contenido en un frasco pequeño o tubo
de tapa rosca, que contiene de 5 perlas de vidrio pequeñas (3 mm de diámetro).
7.1.4 Si se utilizan tórulas de alginato de calcio sumergir la tórula en un alícuota de 4,5 mL
de la solución buffer de enjuague.
7.1.5 Si se han utilizado higienizantes para limpiar la superficie, el diluyente debe contener
algún neutralizante de los mencionados en la NOTA en el punto 6.
7.1.6 Escurrir el exceso de líquido de la torunda apretándola contra la pared del frasco o tubo
y mantener firmemente la plantilla estéril sobre la superficie a muestrear
7.1.7 Frotar con la cabeza de la tórula en un ángulo de 30°, toda la zona de muestreo (25 cm2)
girándola en tres direcciones para aumentar al máximo su capacidad de recoger
microorganismos.
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7.1.8 Romper la torunda, y el extremo algodonoso dejarlo caer en los 10 mL o 4,5 mL de
diluyente contenido en el frasco, envase o tubo.
7.1.9 Tomar una segunda torunda y repetir la frotación del área como antes.
7.1.10 Para el muestreo de superficie de utensilios como cuchillos, cucharas, cucharones, etc,
humedecer la tórula y muestrear en forma suave y firme 3 veces por la superficie.
7.1.11 Romper la torunda y dejar caer la porción algodonosa en el mismo frasco o tubo de
diluyente.
7.1.12 Tapar el frasco con la muestra y poner en contenedor refrigerado para enviar al
laboratorio.
7.1.13 Analizar dentro de las 24 horas después de la toma de muestra.
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7.2 Siembra:
7.2.1 Agitar enérgicamente el frasco o tubo que contiene las torundas y las perlas de vidrio
hasta que las torundas se deshilachen dando fibras de algodón, haciendo 50 ciclos
completos de 15 cm en 10 segundos, golpeando la palma de la otra mano al término de
cada ciclo. Grupos de frascos o tubos pueden ser agitados al mismo tiempo.
7.2.2 Utilizando el método de recuento en placa PRT-712.02-023 realice la siembra y cuente
los microorganismos en suspensión. Para ello siembre 1 y 0,1 mL o diluciones si fuera
necesario de la muestra agitada previamente con el diluyente.
7.2.3 Incubar 48 horas a 35°C ± 1°C.
7.2.4 Cuando otro tipo de microorganismo es buscado añada el respectivo agar selectivo/
diferencial e incube conforme a las condiciones requeridas.
7.3 Cálculo:
7.3.1 Efectuar la lectura y registrar los datos en el registro RG-712.00-101 “Registro
Recuento microorganismos en superficie. Método de torunda”.
7.3.2 Realizar el cálculo según la siguiente fórmula:
10 x N / 25 microorganismos por cm2
7.3.3 Para las superficies irregulares en donde no se puede calcular un área, los resultados se
pueden registrar en base a todo el sitio de muestreo en lugar de un área de medida.
7.4 Informe de resultados:
7.4.1 Informar los resultados como N° de microorganismos por cm2
7.5 Interpretación de resultados:
7.5.1 Conforme a la U.S. Public Health Service se recomienda que la limpieza adecuada y
la sanitización de equipamientos para servicios de alimentos no debe ser mayor a 100
colonias por utensilio o área de superficie del equipamiento muestreado.
7.5.2 La interpretación de resultados en áreas que no pueden ser medidas deberán estar
basadas en los datos históricos obtenidos cuando las áreas han sido sometidas a limpieza
y sanitización. Generalmente los niveles de microorganismos no deberían exceder más
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que unas pocas colonias y en muchos casos el tipo de microorganismos puede ser más
significativo que sólo el número.
7.5.3 La Organización Mundial de la Salud tiene la siguiente clasificación e interpretación de
recuentos aerobios mesófilos (RAM) en controles de superficies. 1983. VPH 83.42.
N° COLONIAS DESIGNACION INTERPRETACION
<3 0 MUY BUENO
3–9 1 BUENO
10 – 29 2 MODERADO
30 – 90 3 INSUFICIENTE
>90 4 MALO
WHO / 1983 VPH 83.42
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7.5.4 La Comunidad Económica Europea cuenta con el siguiente estándar:
N° DE
INTERPRETACION
MICROORGANISMOS
< 1 colonia / cm 2 Excelente
De 2 a 10 colonias / cm 2 Bueno
Limpiar la superficie
11 ó más colonias / cm 2
inmediatamente.
NIVEL DE
RIESGO
NIVEL N° ufc/100 cm2
Muy bajo riesgo < 10
Riesgo moderado >10 < 100
Alto nivel de riego > 100 < 1000
Muy alto nivel de riego >1000
European Standard CEN/TC 243/W G2 (1993)
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8. REGISTROS
8.1 Registro Recuento microorganismos en superficie. Método de torunda
9. ANEXOS
9.1 No Aplica