LABORATORIO N° 3 ESPECTROSCOPIA VISIBLE.

1. OBJETIVOS:
Preparar la solución concentrada a 50 ppm de Azul de Metileno.
Preparar una solución estándar de Azul de Metileno a los siguientes
centranciones: 5, 10, 15, 20, 30 y 40 ppm. (Vtotal=50mL).
Obtener un espectrograma (Absorción vs Longitud de onda).
Graficar una curva de calibración (Concentración vs Absorbancia).

2. MARCO TEORICO
La Espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más utilizadas para la
detección específica de moléculas. Se caracteriza por su precisión, sensibilidad y su
aplicabilidad a moléculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomoléculas, etc)
y estado de agregación (sólido, líquido, gas). Los fundamentos físico-químicos de la
espectrofotometría son relativamente sencillos. Las moléculas pueden absorber
energía luminosa y almacenarla en forma de energía interna. Esto permite que se
inicien ciclos vitales de muchos organismos, entre ellos el de la fotosíntesis en
plantas y bacterias. La Mecánica Cuántica nos dice que la luz está compuesta de
fotones cada uno de los cuáles tiene una energía:
Efotón = h⋅ν = h⋅c/λ
Donde c es la velocidad de la luz, ν es su frecuencia, λ su longitud de onda y h= 6.6
10 -34 J⋅s es la constante de Planck.
Cuando decimos que una sustancia química absorbe luz de longitud de onda λ, esto
significa que las moléculas de esa sustancia absorben fotones de esa longitud de
onda. En esta práctica estudiaremos la absorción de luz en el ultravioleta cercano
(λ≈325-420 nm) y en el visible (λ≈420-900 nm). Cuando una molécula absorbe un
fotón en este intervalo espectral, se excita pasando un electrón de un orbital del
estado fundamental a un orbital excitado de energía superior. De está manera la
molécula almacena la energía del fotón:
A + h⋅ν → A * E(A * ) = E(A) + Efotón
Como la energía se conserva, la diferencia de energía entre el estado fundamental de
la molécula (A) y su estado excitado (A * ) debe ser exactamente igual a la energía
del fotón. Es decir, una molécula sólo puede absorber fotones cuya energía h⋅ν sea
igual a la energía de un estado molecular excitado.
Cada molécula tiene una serie de estados excitados discretos (o bandas) que
dependen de su estructura electrónica y que la distinguen del resto de moléculas.
Como consecuencia, el espectro de absorción, es decir, la luz absorbida en función
de la longitud de onda, constituye una verdadera seña de identidad de cada sustancia
o molécula. En una ampliación a esta práctica, se puede detectar una mezcla de dos
colorantes alimentarios, el rojo E-124 y un colorante verde midiendo su espectro de
ultravioleta/visible.
Los espectros de absorción se miden mediante un instrumento denominado
espectrómetro. Los instrumentos que vamos a usar en esta práctica constan de una
fuente de luz (lámpara de tungsteno) caracterizada por un espectro de emisión
continuo en un intervalo amplio de longitudes de onda (en nuestro caso 600 nm-730
nm) y de un monocromador que actúa como filtro óptico transmitiendo un haz de
luz de longitud de onda fija λ e intensidad I0. Este haz de luz penetra en la cubeta de
análisis donde se encuentra la muestra. Un detector sensible a la luz mide la
intensidad del haz a la salida If.

LEY DE BEER:
La intensidad de un haz de luz monocromática disminuye exponencialmente al
aumentar aritméticamente la concentración de la sustancia absorbente, cuando este
haz pasa a través de un medio homogéneo
P / P0 = e -k’c
donde :
Po : Intensidad de la luz incidente P : Intensidad de la luz transmitida
c : Concentración de la solución
k : Constante, cuyo valor depende de la naturaleza del soluto, de la longitud de onda
de la luz incidente, de la concentración de la solución, y frecuentemente, de la
naturaleza del medio. Ambas leyes se combinan en una sola, generando la Ley de
Lambert-Beer
log P0 / P = a b c o A=abc
A = log P0 / P = - log T
Dónde :
a : Absortividad b : Longitud o espesor del medio (longitud de la cubeta)
c : Concentración de la solución P/Po= T : Transmitancia
Los términos absorbancia y transmitancia son definidos a continuación.
TRANSMITANCIA (T):
Es la razón entre la luz monocromática transmitida (P) por una muestra y la energía
o luz incidente (Po) sobre ella. Tanto la energía radiante incidente como la
transmitida deben ser medidas a la misma longitud de onda.
T = P / P0 = 10-abc ó %T = 100 P / P0
Se acostumbra a considerar la transmitida como la razón de la luz transmitida por la
muestra y la luz transmitida por un estándar arbitrario. Este estándar puede ser el
líquido (solvente) en que esta disuelta la muestra, aire, blanco analítico (solución
que contiene todos los componentes de la solución problema menos la sustancia
problema) u otra sustancia elegida arbitrariamente. Debido a que la transmitancia de
este estándar no es necesariamente 100%, es necesario especificar el estándar con el
cual la muestra es comparada.
ABSORBANCIA(A):
Se define como la cantidad de energía radiante absorbida por una sustancia pura o
en solución. Matemáticamente, corresponde al logaritmo negativo de la
transmitancia.T, transmitancia expresada como fracción decimal %T, transmitancia
expresada como porcentaje.
A = - log T = 2 – log %T Pero. T = P / P0 = 10-abc Luego A = - log ( P / P0 ) = -
log 10-abc A = a b c Esta ecuación indica que la absorbancia es una función lineal
de la concentración, donde a es una constante de proporcionalidad llamada
absortividad. La magnitud de a depende de las unidades de b y c. Si la
concentración c está expresada en moles por litro y la longitud de la cubeta b en
centímetros, la constante a recibe el nombre de absortividad molar( ξ ) . Luego A =
ξbc
MEDICIONES DE TRANSMITANCIA Y ABSORBANCIA.
Las mediciones de absorbancia o transmitancia se hacen por comparación entre la
muestra problema y un estándar arbitrario o referencia. Como la referencia debe
poseer un porcentaje de transmitancia de 100%, esta es llamada referencia de
100%., o una absorbancia de cero.
SELECCIÓN DE LONGITUD DE ONDA DE TRABAJO.
La longitud de onda de trabajo corresponde, generalmente, a la longitud de onda en
la cual la absorbancia del analito (sustancia a analizar) es máxima, y recibe la
denominación de Lambda máximo (λmax). Para seleccionar el λmax., se hace un
espectro de absorción o curva espectral, y que consiste en una gráfica de la
absorbancia de una solución de la sustancia absorbente de concentración adecuada,
medida a distintas longitudes de onda y en ella se determina el λmax

Las mediciones de absorbancia se hacen en la zona de longitudes de onda donde se

espera que absorba la sustancia problema. Si se trata de sustancias coloreadas, las
mediciones se realizan en la zona visible del espectro electromagnético (380 a
800nm). En el caso de sustancias no coloreadas, las mediciones se realizan en la
región ultravioleta del espectro electromagnético (200 a 380nm).
CURVA DE CALIBRACIÓN. Uno de los métodos más utilizados para determinar
la concentración de una muestra problema, es el método de la curva de calibración.
Esta curva de calibración es una gráfica que relaciona la concentración de al menos
cinco soluciones de estándar de concentraciones conocidas, con la absorbancia de
cada uno de ellos a la longitud de onda máxima (λ max)

Una vez obtenida la gráfica se determina la función matemática que presenta dicha
recta a través del tratamiento estadístico de regresión de los mínimos cuadrados, la
cual relaciona la absorbancia y la concentración de un analito. La siguiente ecuación
matemática corresponde a dicha función:
A = m c + n………..Ecuación 1
A : Absorbancia. n : Intercepto de la recta
m : Pendiente de la recta y que corresponde al producto entre absortividad a de la
muestra y el espesor b de la cubeta.
Luego se mide la absorbancia de la solución problema y se interpola su valor en la
gráfica o se reemplaza en la ecuación (1), para obtener el valor de concentración del
analito. La concentración de la solución problema debe estar comprendida en el
rango de concentración que comprende la curva de calibración. Si la concentración
de la solución problema es menor que la concentración del estándar más diluido,
debe usarse el método de adición estándar, que consiste en adicionar un volumen
determinado de un estándar concentrado a la solución problema, antes de realizar la
lectura y que permite que esta lectura este dentro de las obtenidas para la curva de
calibración. En el caso contrario, si la concentración del analito es mayor que la
concentración del estándar más concentrado la solución problema deberá ser
diluida.
 Al hacer la curva de calibración, se debe emplear la longitud de onda de máxima
absorbancia (λmax.), para obtener una recta con la máxima pendiente y así tener
mayor sensibilidad y precisión al hacer las mediciones. La medición de la
absorbancia de la solución problema debe hacerse a la misma longitud de onda que
fue hecha la curva de calibración.
3. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS

3.1 EQUIPOS:
Espectrofotómetro.

FIGURA N°01: Espectrofotómetro (PG Instruments Ltd / T80+ UV/VIS).

 Balanza analítica.

FIGURA N°02: Balanza analítica (AND / GR-200).

3.2 MATERIALES:

Pipeta de vidrio.

2 vasos de precipitación.

Probeta.

Matraz aforado.

3.3 REACTIVOS:

Azul de metileno.

Agua destilada.

Solución amortiguadora.
4. PROCEDMIENTO EXPERIMENTAL.
4.1 Preparar una solución patrón que sirva de referencia para las demás muestras:
con una balanza analítica en un vaso de precipitación pesar 0.025 g de azul
de metileno. Después agregar 25 ml de agua destilada y disolver por unos
minutos. Finalmente, el contenido se agrega a una fiola y aforar hasta su
capacidad máxima (500 ml) hasta obtener una concentración de 50 ppm.

4.2 Conseguir 6 frascos de la misma capacidad (250ml) y etiquetarlos por

concentraciones: 5 ppm, 10 ppm, 15 ppm, 20 ppm, 30 ppm, 40 ppm. Lavarlos
anteriormente con agua destilada.
4.3 Luego, preparar las soluciones estándar de azul de metileno: primero calcular
que volumen de la solución patrón se debe agregar a cada frasco para obtener la
concentración deseada. Para ello usar la ecuación de dilución para un volumen
total de 50 ml. Al obtener el volumen patrón se procede a aforar con agua
destilada hasta 50 ml para que así lograr obtener la concentración pedida en
cada frasco.
4.4 Antes de usar el espectrómetro, para poder obtener el espectrograma de
ABSORBANCIA vs LONGITUD DE ONDA (nm), limpiar la probeta por la
parte traslucida y cogerlo por la parte opaca. Luego se procede a verter la
muestra en la probeta y luego se coloca dentro del espectrómetro (que debió
estar conectado 2 horas antes aprox. y calibrado).
4.5 Observar cómo se forman las gráficas de calibración para cada muestra vertida
en la probeta, con un rango de longitud de onda de 550 nm – 700 nm. Observar
en que puntos se forman los picos más altos de las gráficas. Los resultados
fueron anotados en la Tabla 1.
4.6 Al obtener todos los datos de las 6 muestras, se procede a graficar la curva de
calibración PPM vs ABSORBANCIA y la ecuación de la recta es: Y = 14.808X
– 13.42.
 5. RESULTADOS
Tabla 01: Datos experimentales de absorbancia obtenidos de una espectroscopia visible
para una solución de azul de metileno a diferentes concentraciones.

N.º PPM ABS λ (nm)

1 0 1.011 664.5
2 5 1.671 664
3 10 2.391 665.5
4 15 2.701 669.5
5 20 2.861 672.5
6 30 2.906 676.5
7 40 1.011 664.5

Fig. 01 Espectrograma “Absorbancia V.S longitud de onda)”.

Fig. 02 Curva de calibración “Ppm vs Absorbancia”.

Curva de calibracion y = 14.808x - 13.42

45
40
35
30
25
ppm

20
15
10
5
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
ABSORVANCIA

La ecuación aproximada de la gráfica según su línea de tendencia es y = 14.808x - 13.42

6. CONCLUSIONES
 Se aprendió el funcionamiento del espectroscopio
 La turbidez de la solución afecta el paso de radiación a través de esta.
 La determinación de la absorbancia en una solución química, es indicativa de la
concentración existente en esta. Se ha demostrado que existe una relación lineal
entre la absorbancia y la concentración.
7. RECOMENDACIONES
 Mantener el área de trabajo limpia y seca por posibles riesgos eléctricos con
los equipos.
 Hacer bien los cálculos de las soluciones ya que cualquier fallo afecta a los
resultados.
 Nunca tocar las células del espectrofotómetro por los lados cristalinos.
 Tener siempre cada frasco etiquetado para así saber de qué solución o
reactivo se trata.
 Llevar puesto en cada momento nuestro EPP.
8. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
 PDF 1:
[Link]
d_material=566977
 PDF 2:
[Link]
 PDF 3:
[Link]
9. ANEXOS

Algunos Materiales, equipos e instrumentos

Preparación de la solución patrón

 Preparación de las soluciones estándar

Preparación de la muestra a analizar.

Colocación de la muestra
Vista interna del espectrómetro
Resultados obtenidos