PRUEBA DE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)
FUNDAMENTO
La prueba de IFI se basa en el uso de láminas portaobjetos con áreas
circulares que contienen epimastigotes de T. cruzi previamente fijados y listos
para la identificación de inmunoglobulinas específicas (anticuerpos de la clase
IgG o IgM) presentes en el suero del paciente. Estas se adhieren a la
membrana del parásito, donde se detectan por medio de un conjugado (anti-
IgG o anti-IgM humana) marcado con isotiocianato de fluoresceína.
La reacción se lee al microscopio de fluorescencia y se define el titulo como la
última dilución del suero a la cual se observa fluorescencia (color verde
manzana) en toda la periferia de los epimastigotes; aunque sea poco intensa
esta sería una reacción positiva a esa dilución. La reacción es negativa
cuando el parásito se observa completamente rojo.
Anti IgG humana
marcada con
isotiocianato de
fluoresceína
IgG suero paciente
Antígeno
Componentes de la reacción de IFI
• ANTÍGENO
Se emplean cultivos de T. cruzi (epimastigotes) de 6 u 8 días de incubación, en
medio NNN o LIT. Estos deben estar libres de contaminación bacteriana y
fúngica. Se recomienda el empleo de cepas de T. cruzi colombianas de
referencia. Las láminas portaobjetos que se van a usar, deben lavarse y
desengrasarse previamente, luego repartir el antígeno convenientemente
diluido en las láminas.
• MUESTRAS DE SUERO
Sueros obtenidos de sangre tomada por punción venosa, punción dactilar en
tubo capilar, ó, sangre secada sobre papel filtro.
• CONJUGADO
El suero anti-IgG o anti-IgM humano marcado con isotiocianato de fluoresceína,
se encuentra disponible comercialmente. Es importante mantenerlo en
condiciones de almacenamiento apropiadas, de acuerdo con las instrucciones
del fabricante.
• TITULACIÓN DEL CONJUGADO.
El titulo del conjugado varía de acuerdo con las condiciones de trabajo y con el
laboratorista. Además de esto existen variaciones en la calidad de los
reactivos, de acuerdo con el lote y en cuanto a la resolución de diferentes
microscopios de fluorescencia.
MATERIALES
• Antígeno de T. cruzi (fijado en la lámina o liofilizado o en suspensión)
• Láminas para fluorescencia
• Laminillas cubreobjetos
• Azul de Evans
• Conjugado
• Glicerina tamponada
• Sueros problema
• Pipetas pasteur
• Tubos eppendorf de 1ml
• Micropipetas
• Puntas para Micropipeta
• Papel absorbente
EQUIPOS
• Cronómetro
• Microscopio de fluorescencia
PROCEDIMIENTO
1. Atemperar los reactivos y las muestras.
2. Realizar diluciones seriadas de las muestras 1:16, 1:32,1:64, control
positivo y negativo 1:32 en PBS
3. Servir 5µl por pozo de cada dilución de los sueros como se indica en la
imagen.
M1 CN CP 1:16 1:32 1:64 1:132
1:
PACIENTE
NOMBRE
M2 CN CP 1:16 1:32 1:64 1:132
1:
M3 CN CP 1:16 1:32 1:64 1:132
1:
DC: Dilución del conjugado
1:100
4. Incubar a 37ºC por 35 minutos en cámara húmeda
5. Lavar con agua destilada durante 3 minutos
6. Secar suavemente con papel absorbente
7. En Azul de Evans al 1%, realizar la dilución del conjugado 1:100. Servir 5µl
por pozo.
8. Incubar a 37ºC por 35 minutos en cámara húmeda
9. Lavar con agua destilada durante 3 minutos
10. Secar suavemente con papel absorbente
11. Montar con una gota de buffer glicerol fosfatado pH 8.0
12. Leer en microscopio de fluorescencia
LECTURA
Para la prueba de IFI las diluciones se realizan de acuerdo con las
orientaciones definidas por los laboratorios de referencia, es decir.
• Para la prueba IFI cualitativa, utilizando en algunos casos en banco de
sangre, por ejemplo, el titulo mayor o igual a 1:20 se considera positivo,
mientras que,
• En la IFI cuantitativa, en el laboratorio de diagnóstico y de salud
pública, el titulo positivo será mayor o igual a 1:40
Para la prueba cuantitativa se recomienda la ejecución de por lo menos 6
diluciones (títulos).
La opción de los laboratorios de referencia por la dilución de 1:40 fue tomada
después de realizar varios estudios epidemiológicos y de comparar muestras
de sueros con otros laboratorios de referencia en otros países.
Los datos epidemiológicos indicaron que en una población no chagasica, la
presencia de anticuerpos naturales es responsable por un gran número de
resultados falsos positivos, cuando esos sueros fueron analizados en
diluciones menores a 1:20
BIBLIOGRAFIA
• Felipe Gulh; Santiago Nicholls; Manual de procedimientos para el
diagnóstico de la Enfermedad de Chagas; 2001.