REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGÍA
Micropropagación de plantas de Mentha piperita
y evaluación de sus constituyentes volátiles
Mentha piperita micropropagation
and volatil constituents evaluation
Jorge Ignacio Zapata*, Gloria Azucena Fernández**
RESUMEN SUMMARY
La aplicación de técnicas de cultivo de tejidos vegetales The use of in vitro plant tissue culture techniques for the
in vitro en especies aromáticas y medicinales puede cons- propagation of aromatic and medicinal species, could play
tituirse en un renglón importante para la economía de pe- very promising role for the economy of small farmers,
queños agricultores, debido a su alto potencial de due to the high potential of industrialization of their
comercialización y producción. Se pretende en este tra- essential oils. In this work is shown how the tissue culture
bajo demostrar una vía de aplicación semi-industrial para technique has been used for the propagation of Mentha
cultivar masivamente especies vegetales de Mentha piperita, as its essential oil is widely used in the flavor
piperita, debido a la aceptación y consumo mundial de su and fragrance industry.
aceite esencial.
Mints from different sources were studied, and evaluation
Se estudiaron diferentes variedades de Mentha para eva- of the yield and quality of the essential oil was carry out,
luar su rendimiento de producción de aceite esencial y su before and after the micropropagation by plant tissue
calidad, antes y después de la micropropagación. Para culture.
lograr el objetivo propuesto, se ensayaron diversos me-
dios de cultivo y sus respectivos balances de fitohormonas Several basal mediums with different proportion of plant
y vitaminas para lograr el máximo de multiplicación. Ade- growth regulators and vitamins were tested in order to
más se caracterizó el aceite esencial por medio de la téc- maximize the propagation results. The constituents of the
nica de análisis instrumental de cromatografía de gases. essential oil were quantified by Gas Chromatography.
Los resultados fueron promisorios para la mi- Lin & Staba (1962) basal medium, supplemented with
cropropagación, utilizando el medio basal de Lin & Staba BAP, and some vitamins, was the best for mints species
(1962), suplementado con BAP y algunas vitaminas. En micropropagation. The yield and quality of essential oil
cuanto a la eficiencia de extracción y la calidad del aceite produced by plant tissue culture and its mother plant were
esencial, no se encontraron diferencias significativas. very similar.
Palabras Clave: cultivo de tejidos vegetales, menta, hier- Keywords: plant tissue culture, mint, peppermint,
bas aromáticas, cromatografía de gases, aceites esenciales. aromatic herbs, gas chromatography, essential oils.
INTRODUCCIÓN
El avance de las técnicas biotecnologías ha permitido apli-
* Jefe del Centro de Estudios y de Investigación en Biotecnología, car nuevos procesos a la industria productiva. Una de estas
CIBIOT, Facultad de Ingeniería Química, Universidad técnicas, el cultivo de tejidos vegetales (CTV) in vitro, ha
Pontificia Bolivariana. Medellín-Colombia. Circular 1 No. 70-01, expandido sus fronteras a tal punto, que la aplicación in-
AA 56006. e-mail: jorgez@[Link]
dustrial se ha visto invadida por nuevas y excelentes ideas
**Jefe Sección de Biología. Centro de Investigación y Desarrollo tecnológicas, en busca de nuevos productos y procesos para
Tecnológico, CIDT. Compañía Colombiana de Tabaco S.A.- mejorar la calidad de vida de la humanidad.
Coltabaco. Medellín-Colombia. e-mail: azucena©[Link]
16
MICROPROPAGACIÓN DE PLANTAS DE MENTHA PIPERITA Y EVALUACIÓN DE SUS CONSTITUYENTES VOLÁTILES
Hasta el momento son pocos los trabajos reportados una sensación de frescura. El aceite esencial de esta plan-
con la aplicación del cultivo de tejidos vegetales in vitro, en ta es comúnmente denominado "Peppermint" y es uno de
especies que proporcionan sabores y fragancias. Aunque los de mayor aceptación y consumo en el mundo. Sus apli-
el mercado de los aceites esenciales y oleorresinas del caciones son diversas en productos farmacéuticos, alimen-
mundo continúa creciendo en valores mayores al 33% anual, tos, bebidas, productos de higiene y pastas dentríficas.
el desarrollo es precario en América Latina. Para muchos
países latinoamericanos, el CTV de especies aromáticas y
medicinales puede constituir una nueva industria promisoria, MATERIALES Y MÉTODOS
convirtiéndose en proveedores de un sinnúmero de com-
puestos naturales utilizados como materia prima en indus- Material vegetal
trias alimenticias, farmacéuticas, de cosméticos, perfume-
ría y muchas otras. Se utilizaron esquejes de Mentha piperita obtenidos del
Jardín Botánico de París (Francia), de plantaciones de la
Aunque el valor agregado de estos productos es alto en región central de Colombia (tres plantas diferentes de culti-
el mercado mundial, también sus exigencias de calidad lo vos distintos) y semillas certificadas de Japón. Todos fue-
son, y deben complementarse con técnicas avanzadas de ron cultivados en invernadero en condiciones ambientales
análisis instrumental que certifiquen una óptima calidad del normales y les fueron suministrados los nutrientes necesa-
producto finalmente ofrecido. rios para una correcta fertilización mineral, cada dos me-
ses. Después de tres meses estas plantas fueron la fuente
La Mentha piperita es una fuente natural del L- mentol, de explantes para los ensayos de micropropagación in vitro.
el cual posee propiedades estimulantes, asépticas y brinda
17
REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGÍA
Establecimiento de los cultivos asépticos su posterior extracción. Luego se prepararon las muestras
de tejido vegetal por el método de microdestilación de Likens
Los explantes utilizados fueron tallos, hojas, meristemos y Nickerson (Sandra y Bicchi, 1987; Lam, et al., 1986), utili-
apicales y caulinares, extraídos de las plantas madres de zando solventes inmiscibles como agua (35 mi con tempe-
invernadero. Los explantes fueron lavados con abundante ratura de extracción de 95°C) y diclorometano (2 ml a una
agua destilada, luego desinfectados durante 5 minutos con temperatura de 40±1°C, bajo un baño María), usando 5 g
etanol (70%v/v), 5 minutos con hipoclorito de sodio (5,25% de material vegetal durante 75 minutos en un proceso de
v/v) con un tensioactivo (Tween 20 al 0.01%), finalizando extracción continua. La temperatura del fluido condensador
con tres enjuagues con agua bidestilada estéril. Se usó el fue de 5±1°C, con un tiempo de estabilización del sistema
medio basal de Lin & Staba (1962), el cual fue suplementa- de 20 minutos. El cromatógrafo de gases usado fue un
do con sacarosa (2%), mioinositol (100 mg/l) y agar bacte- Shimadzu GC-15A con un integrador Shimadzu C-R3A
riológico (DIFCO al 7,5%). Las auxinas 2,4-D, ANA y AIB Chromatopac y un detector FID. El gas portador fue nitró-
(SIGMA), las citoquininas KIN y BAP (SIGMA), se incorpo- geno a 1.5 ml/min y split de 1:50, con una columna capilar
raron al medio de cultivo en diferentes concentraciones se- de acero inoxidable de Carbowax 20M de 0.3 mm de diá-
gún el objetivo de producción del material vegetal, tal como metro interno y 25 m de longitud (Hewlett Packard). Las
se indica en la tabla 1. Se utilizó una técnica de experimen- temperaturas del FID y del inyector de 250°C y en la colum-
tación al azar. El pH se ajustó a 5.8 y autoclavado a 15 psi y na de 50°C durante 5 minutos, después isoterma a 170°C.
121 °C; además fueron establecidas las variables de inten- (Analytical Methods Committee, 1988; Bicchi y D'Amato,
sidad de luz en 1.300 unidades lux, en un cuarto de 1989; Bicchi, et al., 1988; Bicchi, etal., 1985; Chívala, et al.,
incubación del material vegetal con una humedad relativa 1982; Drozd y Novak, 1979; Godefroot, et al., 1981;Holm,
de 40% y una temperatura de 25°C y en continua presencia et al., 1989; Kawabe, et al., 1993; Sandra y Bicchi, 1987;
de luz. Cada experimento fue replicado 24 veces. Sur, 1991). El estándar interno usado fue 2-octanol
(Werrmann y Knorr, 1993).
Establecimiento de las plántulas en suelo
Las plantas regeneradas in vitro fueron transferidas a semi- RESULTADOS
lleros que contenían vermiculita (30%), tierra y arena esté-
ril, suplementado con 15 kg de nitrógeno/ha, 30 kg de fós- Después de correr todas las muestras de aceite esencial
foro/ha y 25 kg de potasio/ha. Finalmente, después de 22 de las plantas, los resultados del análisis cromatográfico se
días, se pasaron a condiciones similares en invernadero. describen en la tabla 2.
Análisis cuantitativo del aceite esencial ANÁLISIS DE RESULTADOS
mediante cromatografía de gases
E! cultivo de tallos y hojas de diversas edades de la Mentha
Se seleccionaron los materiales vegetales de las plantas piperita presentó algunos problemas para el establecimien-
de invernadero, de los callos y de las plantas in vitro para to in vitro, por su grado de contaminación (9% y 90% res-
18
MICROPROPAGACIÓN DE PLANTAS DE MENTHA PIPERITA Y EVALUACIÓN DE SUS CONSTITUYENTES VOLÁTILES
pectivamente); además, después de realizar la desconta- después de 7 días de inoculación. Una vez introducido el
minación del explante, en muchos casos se presentaba BAP en los medios de cultivo, se logró la mejor respuesta y
destrucción y daño físico en el material foliar. Los medios propagación de la Mentha piperita, resultado que es similar
básales sin adición de hormonas no regeneraron ninguna al obtenido por Repcáková y Rychlova (1986) en un medio
actividad celular después de 10 semanas de cultivados. El basal de Linsmaier y Skoog. Para inducir el enraizamiento
medio Lin & Staba equivale a 1/2 MS, donde se comprobó en el mismo frasco, se usó AIB (1 mg/l); en estas condicio-
que su uso no afecta considerablemente la respuesta del nes el sistema radicular fue bueno para su trasplante al suelo
explante. La adición de KIN y ANA, no proporcionan induc- y adaptación adecuada. El uso de mioinositol en concentra-
ción alguna en los explantes, diferente al AIB, 2,4-D y KIN, ciones de 100 a 5.000 ppm, no presentó ninguna diferencia
que inducen la producción de callos después de 20 días de con los otros medios ensayados, contrario a lo afirmado
cultivados, hecho comprobado por Ravishankar y por Roca y Mroginski (1991), quienes plantean una reper-
Venkataraman (1988). La adición de la KIN (1 mg/l) + BAP cusión en la presión osmótica para el inicio de actividades
(1 mg/l) proporcionó la regeneración masiva de plántulas de regeneración de los explantes de Mentha piperita. No
Figura 1. Resultados de la producción de plantas in vitro (plantas totales obtenidas en cada ensayo de 50 frascos),
mediante la combinación de los reguladores de crecimiento AIB y BAP, manteniendo constantes 1 mg/l de KIN y 1 mg/l de
ANA.
19
REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGÍA
Figura 2. Resultados de la producción de callos in vitro (callos totales obtenidos en cada ensayo de 50 frascos), me-
diante la combinación de los reguladores de crecimiento AIB y BAR manteniendo constantes 1 mg/l de KIN y 1 mg/l de
ANA.
hubo diferencias considerables en el CTV de las tres varie- derablemente con el obtenido de las plantas antes de
dades utilizadas. micropropagar de 0,730%. La Mentha piperita colombiana
después de ser cultivada in vitro y adaptada a campo, mostró
En el medio de cultivo descrito se produjeron las plántulas una disminución de 71,64% a 50,66% en el contenido de L-
con un coeficiente de multiplicación de 19 nuevos brotes mentol; tal hecho se explica por la alta cantidad de pulegona
por cada brote sembrado por frasco (ver figura 1), regene- (2,1%) en la muestra de CTV, debido a que este compuesto
radas directamente, de las cuales muchas fueron es el precursor del L-mentol a través de la mentona. La
subcultivadas cada 22 días en medio fresco, como fuente mentona y la isomentona se mantienen constantes en las dos
de nuevos explantes. Los resultados obtenidos en este tra- muestras, como se ilustra en la tabla 3; se comprueba que el
bajo estuvieron acordes con los reportados por Lin y Staba aceite esencial no varió significativamente.
(1962); Repcáková et al., (1986); Rech y Pires (1986);
Ravishankar y Venkataraman (1988); Holm et al. (1989) y
Kawabe et al. (1993), quienes cultivaron exitosamente ho-
jas, tallos y yemas axilares, produciendo diferentes tejidos
(callos, brotes, plantas y raíces). Resultados similares fue-
ron encontrados en trabajos descritos por Repcáková y
colaboradores (1986), quienes obtuvieron una regeneración
directa de plantas y raíces a partir del tejido meristemático,
consiguiendo un alto grado de uniformidad y conservación
del genotipo inicial.
No fue necesaria la presencia de períodos de oscuridad
durante la incubación y crecimiento de los explantes, ni pe- Con la muestra de Mentha piperita de Francia, se com-
ríodos de excesiva oscuridad para la respuesta inicial del probaron los resultados obtenidos por Kawabe et al. (1992):
explante. La adaptación de las plantas al suelo no presentó que la pulegona es el precursor del L-mentol. Se encontró
ninguna exigencia; por el contrario, fue rápida y con exce- en la muestra cosechada a los 3 meses en campo pulegona
lente vigor. (2,59%) y mentol (9,15%), a diferencia de la muestra cose-
chada en un mes, con pulegona (46,4%) y mentol (0,4%).
El máximo valor de rendimiento alcanzado para la produc- En la figura 3 se ilustra la ruta biosintética del L-mentol,
ción del aceite esencial fue de 0,741%, que no difiere consi- demostrada por Kawabe y colaboradores (1992) y por
20
MICROPROPAGACIÓN DE PLANTAS DE MENTHA PIPERITA Y EVALUACIÓN DE SUS CONSTITUYENTES VOLÁTILES
Werrman y Knorr (1993). Esta vía metabólica determina la siblemente se precisan otros métodos de limpieza en
biosíntesis de monoterpenos en Mentha piperita, donde se vegetales.
indica como el precursor inicial a la pulegona, ya sea en
plantas jóvenes o maduras. Obsérvese que los productos • El medio basal que cumple con los requerimientos nutri-
finales no son más que estereoisómeros que finalmente al- cionales para la especie en cuestión es el de Lin & Staba
teran las características organolépticas de los aceites esen- (1962).
ciales obtenidos. Lo anterior permite deducir que el tiempo
de cosecha es una variable crítica del proceso de produc- • Los requerimientos hormonales de reguladores de cre-
ción. cimiento para el medio de propagación masiva de Mentha
piperita fueron: 1 mg/l de BAP, 1 mg/l de KIN y 1 mg/l de
En la Mentha piperita de Japón, se encontraron dos pi- ANA, y para inducir el crecimiento del sistema radicular,
cos desconocidos a los 41,5 y 46,4 minutos de elución; ade- fue necesario adicionar 1 mg/l de AIB, permitiendo un
más no se hallaron niveles adecuados de L-mentol, lo que coeficiente de multiplicación promedio de 19 brotes.
hace poco comercial su aceite esencial.
• Para producción de callos resultó benéfica la adición de
Se analizaron muestras de Mentha piperita colombiana 6 mg/l de 2,4-D, o también el incremento de las concen-
tomadas de los frascos in vitro a diferentes valores de traciones de AIB y BAP, como lo ilustra la figura 2.
fitohormonas (1 mg/l de AIB y 1 mg/l de BAP), comprobán-
dose sólo la existencia de altos niveles de pulegona (>60%) • La coloración negra de los explantes y callos, se debe a
y mentona (>4%), lo cual ratifica la vía biosintética del L- que las células excretan monoterpenos que se oxidan
mentol. fácilmente en presencia de la luz y del oxígeno presente
en el sistema.
CONCLUSIONES • La variedad japonesa probablemente requiera mayor
tiempo de cosecha para alcanzar los niveles óptimos de
• Los explantes adecuados para realizar la micropropa- L- mentol.
gación masiva de la Mentha piperita fueron los meriste-
mos apicales y caulinares, debido a que otros tejidos • Los contenidos de aceite esencial presentan algunas
requieren períodos de excesiva descontaminación. Po- variaciones después de cultivados in vitro, pero el rendi-
miento no se vio alterado.
1. (+) Pulegona
2. (-) Menthona
3. {+) Neomenthol
4. (-) Menthol
5. (+) Isomenthona
6. (+) Neoisomenthol
7. (+) Isomenthol
a: rutas biosintéticas para monoterpenoides en
mentha piperita para plantas maduras,
b: para plantas jóvenes
Figura 3. Biosíntesis de monoterpenos en células de Mentha piperita. (Kawabe; Fujiwara; Murakami y Hosomi, 1993;
Werrman y Knorr, 1993).
21
REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGÍA
• La variedad de Colombia presentó los mejores niveles AGRADECIMIENTOS
de L- mentol en todos los ensayos.
Especial agradecimiento al director del Centro de Investi-
• Se comprobó la presencia de la pulegona como precur- gación y Desarrollo Tecnológico (CIDT) de la Compañía
sor del L- mentol en la vía biosintética. Colombiana de Tabaco S.A. Medellín, doctor Francisco José
Palacio Ramírez, quien permitió que esta investigación fue-
se una realidad. También se agradece al doctor Dagoberto
Castro, investigador de la Universidad Católica de Oriente,
Rionegro; por su colaboración en la formulación de este
artículo.
REFERENCIAS
Analytical Methods Committee. 1988. Aplication of Gas-Liquid Volatile Constituents of Mentha arvensis Cultures. Biosci. Biotech.
Chromatography to the Analysis of Essential Oils. Part XII. Biochem. 57:657-658.
Determination of Octan-3-ol in Oils of Peppermint and Mint. Lam, K., Nickerson, G. B., Deinzer, M. L. 1986. A Rapid Solvent
Analyst. 113:657-659. Extraction Method for Hop Essential Oils. Journal of Agrie. Food
Bicchi, C., D'Amato, A. 1989. Capturing of Volatiles Emitted by Chem. 34:63-66.
Living Plants by Means of Thick Film Open Tubular Traps. Journal Lin-Mei, L., Staba, E. J. 1962. Peppermint and Spearmint
of High Resolution Chromatography. 12:316-321. Tissue Cultures. Callus Formation and Submerged Culture. Lloydia.
Bicchi, C., Frattini, C., Nano, G. M., D'Amato, A. 1988. On 24(3) 139-145.
Column Injection-Dual Channel Analysis of Essential Oils. Journal Ravishankar, G. A., Venkataraman, L. V. 1988. Rapid
of High Resolution Chromatography 11:56-60. Multiplicaron of Plants from Cultured Axillary Buds of Mentha
Bicchi, C., D'Amato, A., Frattini, C., Nano, G. M., Capelletti, E., piperita. Philippine Journal of Science. 117. Parte 2.121-129.
Caniato, R. 1985. Analysis of Essential Oils by Direct Sampling Repcáková, K., Rychlova, M., Chellárová, E., Honcariv, R.
from Plant Secretory Structures and Capillary Gas 1986. Micropropagation of Mentha piperita L Through Tissue
Chromatography. Journal of High Resolution Chromatography. Cultures. Herba Hungarica. 25. (2) 77-88.
8:431-435. Roca, W., Mroginski, L. 1991. Cultivo de tejidos en la agricul-
Chívala, F, Gabri, G., Liddle, A. P, Ulian, F. 1982. Qualitative tura. Fundamentos y Aplicaciones. CIAT, Cali, Colombia.
Evaluation of Aromatic Herbs by Direct Headspace GC Analysis. Sandra, P, Bicchi, C. 1987. Chromatographic Methods:
Applications of the Method and Comparison with the Traditional Capillary Gas Chromatography in Essential Oil Analysis. New York,
Analysis of Essential Oils. Journal of High Resolution Huething, p. 435.
Chromatography and CC. 5:182-188. Srivastava, N. K., Luthra, R. 1993. The Relation Between
Drozd, J.; Novak, J. 1979. Headspace Gas Chromatography. Primary and Secondary Metabolism in Peppermint Under Fe-
Journal of Chromatography. 165:141 -165. Stress. Journal of Essential Oil Research. 5:525-534.
Godefroot, G., Sandra, P, Verzele, M. 1981. New Method for Sur, S. V, Tuljapa, F. M., Sur, L. I. 1991. Gas Chromatography
Quantitative Essential Oil Analysis. Journal of Chromatography. Determination of Monoterpenes in Essential Oíl Medicinal Plants.
203:325-335. Journal of Chromatography. 542:451 -458.
Holm, Y, Hiltunen, R., Jokien, K., Tormala, T. 1989. On the Werrman, U., Knorr, D. 1993. Conversión of Menthyl Acétate
Quality of the Volatile Oil in Micropropagated Peppermint. Flavour or Neomenthyl Acétate into Menthol or Neomenthol by Cell
and Fragance Journal. 4:81-84. Suspensión Cultures of Mentha canadiensis and Mentha piperita.
Kawabe, S., Fujiwara, H., Murakami, K., Hosomi, K. 1993. Journal of Agric. Food Chem. 41:517-520.
22