UNIVERSIDAD JORGE TADEO LOZANO
QUIMICA ANALITICA
INFORME #7
CROMATOGRAFÍA
DOCENTE: ANA MARIA CAMPOS
ESTUDIANTES: MARIANA MORENO// VALENTINA LÓPEZ
GRUPO 3.3
INFORME #7
Resumen
En el presente informe se realizó el respectivo análisis de la separación de pigmentos que se
tiene por medio de cromatografía a una muestra vegetal, en este caso el de la espinaca. En
esta práctica se llevaron a cabo dos métodos diferentes, cromatografía en placa y
cromatografía en columna. Y por otro lado se analizó la composición de una muestra
problema haciendo uso del HPLC.
Tablas Tabla 2. Distancia placa de silica
Tabla 1. Distancia placa de celulosa
Celulosa Silica
Acetona, Hexano, Éter,
Acetona, Hexano, Éter, Acetato y Metanol
Acetato y Metanol 8 7.8
Amarillo 3.7 Amarillo 3.0
Verde 4.1 Verde 0.7
Hexano 5.0 Hexano 5.0
Amarillo 4.7 Amarillo 0.2
Verde 0 Verde 0
Hexano y Acetona 7.5 Hexano y Acetona 7.5
Amarillo - Amarillo -
Verde 1.2 Verde 4.5
Tabla 3. Rf Celulosa Tabla 4. Rf Silica
Celulosa Silica
Acetona, Hexano, Éter, Acetona, Hexano, Éter,
Acetato y Metanol Acetato y Metanol
Amarillo 0,4625 Amarillo 0,38461538
Verde 0,5125 Verde 0,08974359
Hexano Hexano
Amarillo 0,5875 Amarillo 0,02564103
Verde 0 Verde 0
Hexano y Acetona Hexano y Acetona
Amarillo - Amarillo N.A
Verde 0,15 Verde 0,57692308
Los cromatofolios que se utilizaron fueron de silica y celulosa en los cuales se
observaron manchas verdes y amarillas respectivamente; las verdes hacen referencia
a las clorofilas, las xantofilas amarillas rojizos y las manchas amarillas a los
carotenos, pigmentos propios presentes en los vegetales. Esta información se
referencia en las (Tabla 1 y 2).
CAROTENOS
CLOROFILA A
CLOROFILA B
XANTOFILA
En primer lugar, fue necesario calcular el Rf que se realizó de la siguiente manera
teniendo en cuenta las distancia de las (Tablas 1 y 2).
𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑑𝑒𝑠𝑑𝑒 𝑒𝑙 𝑜𝑟𝑖𝑔𝑒𝑛
𝑅𝑓 =
𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑑𝑒𝑠𝑑𝑒 𝑒𝑙 𝑜𝑟𝑖𝑔𝑒𝑛
Dichos datos se ven reflejado en las (Tablas 2 y 3), según la teoría este debe estar entre 0-1
o de lo contrario estaría fuera del contexto de cromatografía. En cuanto a su fase
estacionaria o móvil, se determina por la polaridad que tiene el compuesto, es decir, cuando
esta en la fase estacionaria significa que no es polar y por lo tanto no se ve la repartición de
pigmentos encontrándose en la línea inicial, en cuanto a la fase móvil se debe a que es lo
bastantemente polar para dejar rastro de los pigmentos del vegetal. También en algunos de
los cromatofolios no se observó ninguna repartición o su repartición fue total, esto se debe
la polaridad que se obtiene con las tres fases móviles, hexano, acetona y la mezcla de estos.
Identifique y explique detalladamente los diferentes procesos que rigen
TODAS las separaciones realizadas en el laboratorio (adsorción, reparto, etc.).
Cromatografía de gases (GC): Se utiliza para separar y detectar compuestos de pequeño peso
molecular en la fase gaseosa. La muestra es un gas o un líquido que se vaporiza en el puerto
de inyección. Por lo general, los compuestos analizados son de menos de 1.000, porque es
difícil vaporizar los compuestos más grandes. GC se utiliza normalmente en aplicaciones
donde se detectan pequeñas moléculas volátiles y con soluciones no acuosas. GC es
favorecido para las moléculas no polares, la fase móvil para cromatografía de gases es un
gas portador, típicamente helio debido a su bajo peso molecular y ser químicamente inerte.
Se aplica presión y la fase móvil mueve el analito a través de la columna. La separación se
logra utilizando una columna recubierta de una fase estacionaria. Columnas capilares
tubulares abiertas son las columnas más populares y la fase estacionaria en las paredes del
tubo capilar. Fases estacionarias son a menudo derivados de polidimetilsiloxano, con 5 –
10% de los grupos funcionalizados para afinar la separación. Grupos funcionales típicos
son los grupos fenilo, cianopropilo o trifluoropropyl. Columnas capilares suelen ser 5-50 m
de largo. Columnas más estrechas tienen mayor resolución, pero requieren presiones más
altas.
Cromatografía liquida (LC): En la cromatografía líquida los componentes de una mezcla son
llevados a través de una fase estacionaria fijada dentro de una columna mediante el flujo de
una fase móvil líquida. Las separaciones están basadas en las diferencias de la velocidad de
migración entre los componentes de la muestra, que vienen condicionadas por la naturaleza
de los analitos y su interacción con las fases. Se lleva a cabo una cromatografía líquida en
fase normal cuando la fase estacionaria es relativamente polar y la fase móvil es
relativamente apolar. Se realiza una cromatografía en fase inversa cuando la fase
estacionaria es relativamente apolar y la fase móvil es relativamente polar.
Cromatografía en capa delgada (CCD): Una placa de CCD es una lámina de vidrio, metal o
plástico recubierta con una capa delgada de un sólido adsorbente (gel de sílice o alúmina).
Se deposita una pequeña cantidad de la muestra problema en disolución en un punto en la
parte inferior de la placa. Entonces la placa se introduce en una cubeta cromatográfica, de
forma que sólo la parte inferior de la placa queda sumergida en el líquido. Este líquido o
eluyente es la fase móvil y asciende por la placa de CCF por capilaridad.
A medida que el eluyente pasa por el lugar donde está la mancha de la mezcla problema se
establece un equilibrio entre las moléculas de cada uno de los componentes en la mezcla que
son adsorbidas y las que se encuentran en disolución.
En principio, los componentes se diferenciarán en solubilidad y en la fuerza de su adsorción,
de forma que unos componentes se desplazarán más que otros. Cuando el eluyente llega a la
parte superior de la placa, esta se saca de la cubeta, se seca, y los componentes separados de
la mezcla se visualizan.
Cromatografía de adsorción: Se identifica por recurrir a una fase estacionaria sólida de carácter
polar, en este caso cromatofolios de sílice gel o celulosa y una fase móvil líquida apolar, en
este caso hexano y se utiliza tanto con fines de analizar e identificar sustancias o con fines
de aislamiento, separando sus componentes, siendo su limitación más importante la
dificultad de separar sustancias de polaridad parecida.
Cromatografía de reparto: La cromatografía de reparto consiste en la separación de los
componentes de una mezcla sobre una fase estacionaria constituida por un soporte sólido
inerte cubierto por una película líquida que es fuertemente retenida por dicha fase. La
separación se efectúa por medio de una fase fluida móvil que es el solvente de desarrollo
que es inmiscible con el líquido del soporte estacionario y que transporta los componentes a
lo largo de la Fase Estacionaria. Los componentes se van separando según sean sus
solubilidades relativas en el líquido de la fase estacionaria y la fase móvil. Se define
entonces el coeficiente de reparto o constante de distribución como el cociente de la
concentración del soluto en la fase móvil y su concentración en la fase estacionaria:
Kd=CM/CE. Aquellas sustancias que presentan un alto valor de Kd son movilizadas más
rápidamente que aquellas que tienen un bajo valor de Kd. Así en la cromatografía de
reparto los solutos se van separando secuencialmente de acuerdo con sus respectivos
valores de Kd
Las aplicaciones prácticas de la cromatografía se encuentran por ejemplo en la
producción, donde se usa la cromatografía para la limpieza y aislamiento de
sustancias. En química analítica se utiliza para separar mezclas en compuestos
homogéneos. En cuanto a la práctica se pudo afianzar este concepto ya que se
lograron identificar diferentes pigmentos en la muestro vegetal. Sin embargo, el
procedimiento por este método es más tedioso en comparación con los otros ya que
se demora mas tiempo en separar los respectivos pigmentos.
XANTOFILAS Y
CAROTENOS CLOROFILA B
CLOROFILA A
Determine la composición de la muestra problema, discuta el proceso de separación
por HPLC (¿es isocrático o por gradiente?) y discuta sobre la eficiencia y
versatilidad de esta técnica.
Tabla 5. Datos obtenidos cromatograma
XILOSA
Tiempo de
Concentración Área
retención
[(mg/ml)] (nRiU*min)
(min)
0,4 2192,476 11,822
0,8 4364,245 11,822
1 5521,542 11,822
2 10831,833 11,822
3 16489,775 11,822
4 22385,847 11,822
Grafica 1. Curva Calibración Xilosa
CURVA CALIBRACIÓN XILOSA
25,000.00
y = 5537.9x
20,000.00 R² = 0.9996
Área (nRIU*min)
15,000.00
10,000.00
5,000.00
0.00
0 1 2 3 4 5
Concentración (mg/ml)
Grafica 2. Cromatograma Curva Xilosa
Para determinar la concentración de Xilosa y Glucosa presente en la muestra se deben
calcular hallando la ecuación de la recta en la cual x se despeja ya que representa la
concentración.
Determinación concentración de Xilosa
𝑦 = 5582.847𝑥 − 123.694
2436.745 + 123.649
=𝑋
5582.847
𝑋 = 0.458
𝑚𝑔 𝑚𝑔
𝐶 = 0.458 ∗ 2 = 0.917 𝑋𝑖𝑙𝑜𝑠𝑎 𝑝𝑟𝑒𝑠𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
𝑚𝑙 𝑚𝑙
Tabla 6. Datos obtenidos Cromatograma
Glucosa
Tiempo de
Concentración
Área (nRiU*min) retención
[(mg/ml)]
(min)
0,4 2336,492 11,066
0,8 4641,297 11,066
1 5743,932 11,066
2 11828,606 11,066
3 17156,994 11,066
4 23066,228 11,066
Grafica 3. Curva Calibración Glucosa
CURVA CALIBRACIÓN GLUCOSA
25,000.00
y = 5772.2x
Área (nRIU*min)
20,000.00 R² = 0.9997
15,000.00
10,000.00
5,000.00
0.00
0 1 2 3 4 5
Concentración (mg/ml)
Grafica 4. Cromatograma Glucosa
Determinación concentración de Glucosa
𝑦 = 5748.72𝑥 + 64.639
7543.151 − 64.639
=𝑋
5748.72
𝑋 = 1.30
𝑚𝑔 𝑚𝑔
𝐶 = 1.30 ∗ 2 = 2.60 𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 𝑝𝑟𝑒𝑠𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
𝑚𝑙 𝑚𝑙
Conclusiones
Gracias al proceso de cromatografía se logra determinar los pigmentos que
componen la muestra vegetal de la espinaca tales como, la clorofila A y la clorofila
B, xantofilas y carotenos. La cromatografía por columna, muestra la separación de
los pigmentos, sin embargo, el método de capa fina es mas eficiente con respecto al
tiempo en el cual se logra determinar los pigmentos de la muestra.
La eficiencia de la separación Rf debe estar entre 0 y 1, lo cual se cumple para cada
uno de los datos obtenidos de los cromatofolios de silica y celulosa.
En la practica se pudo evidenciar el concepto de cromatografía ya que se vio la
separación de los diferentes pigmentos
Referencias
Harvey, D. Química analítica moderna. 2002. McGraw Hill, primera edición, España.
- Ramírez, I.B; Gaviria, L.E; Young, S.T y Morales, A.L. Química analítica instrumental. 1989.
Editorial Hispanoamericana, Universidad abierta y a distancia, UNISUR. Bogotá.
- Aaron J. Ihde. (1985).The Development of Modern Chemistry. Dover Publications Inc.;
Edición: New edition.
- Hao T. Quach, Robert L. Steeper, and G. William Griffin. (2004). An Improved Method for
the Extraction and ThinLayer Chromatography of Chlorophyll a and b from Spinach .
Journal of Chemical Education. Vol. 81 No. 3.
- O. A. Quattrocchi, S. I. Abelaira de Andrizzi, R. F. Laba. Introducción a la HPLC. Aplicación
y Práctica. (1992). Artes Gráficas Farro S. A. Bs. As