Miriam
Solache
QFB 891
Cromatografía de líquidos de alta resolución (CLAR)
Para que la CLAR de buenos resultados para un compuesto determinado depende de
la combinación correcta de las condiciones de operación, que son las siguientes:
• La preparación de la muestra,
• El tipo de la columna,
• La fase móvil,
• La longitud y diámetro de la columna,
• La velocidad de flujo de la fase móvil,
• El tipo de detección,
• El algoritmo de integración,
•
La migración diferencial(proceso por el cual se transportan a la fase móvil o se
retienen en la estacionaria). Dichos componentes se separan en la columna y al salir
de ésta son conducidos por la fase móvil en el orden en que emergieron, hacia un
detector donde se registra una respuesta proporcional a sus concentraciones y sus
tiempos de retención en la columna.
El cromatograma resultante muestra cada compuesto que sale de la columna en forma
de picos simétricos con un tiempo de retención característico por lo que este tiempo
puede emplearse para identificar el compuesto. Este tiempo de retención (tr) se mide
desde el momento de la inyección de la muestra hasta el momento en que aparece el
máximo del pico en el cromatograma.
Los mecanismos o procesos de separación que dan como resultado la retención de las
moléculas de una muestra por parte de la fase estacionaria dan lugar a los diferentes
métodos de cromatografía líquida, como por ejemplo:
• Cromatografía líquido-líquido o de partición, que consta de una fase
estacionaria líquida de composición diferente a la de la fase móvil e
inmiscibles. Las moléculas de la muestra se distribuyen entre ambas fases
como sucedería en una extracción líquido-líquido.
• La cromatografía líquido-sólido o de adsorción incluye partículas de gran área
superficial donde las moléculas son atraídas, y por lo tanto, retenidas.
• La cromatografía de intercambio iónico, en la cual la fase estacionaria contiene
grupos iónicos fijos como –SO3, junto con iones de carga opuesta (contraión).
Estos últimos están presentes en la fase móvil en forma de sales.
• La cromatografía de exclusión molecular, en la cual el empaque es un material
poroso donde el tamaño del poro está bien definido. De esta manera, las
moléculas que son demasiado grandes para el poro eluyen entre las partículas
y salen rápidamente de la columna, mientras que las que son pequeñas
penetran en los poros aumentando su recorrido y prolongando su tiempo de
elución.
• Cromatografía de fase normal. Generalmente el adsorbente sólido usado en la
cromatografía de partición y la fase estacionaria adsorbida en él, son polares
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con respecto a la fase móvil. El adsorbente más usado en estos casos es una
tierra silícica o alúmina inactiva, con partículas de diámetro y tamaño de poro
adecuados para que pueda fluir fácilmente la fase móvil.
• Cromatografía de fase inversa. Es aquella en la que el adsorbente polar se
transforma en no polar por silanización u otros medios (tratamiento con
parafinas) y la fase fija adsorbida es menos polar que la fase móvil. En estos
sistemas de partición, el grado de separación de un compuesto está regido por
su coeficiente de distribución entre las dos fases líquidas y en los compuestos
que se disocian, por el pH de la fase más polar.
Existen diferentes tipos de columnas(λ), que van a depender del material del esten
hechas, el diametro interno y el tamaño de partícula que se va ocupar, como por
ejemplo las que se encuentran a continuación:
• L1 Octadecil-silano enlazado químicamente a sílica porosa o a micropartículas
de cerámica de 5 a 10 µm de diámetro.
• L3 Partículas de sílica porosa de 5 a 10 µm de diámetro.
• L4 Gel de sílice con una superficie de porosidad controlada unida a un núcleo
sólido esférico de 30 a 50 µm de diámetro.
• L5 Alúmina con una superficie de porosidad controlada unida a un núcleo
sólido esférico de 30 a 50 µm de diámetro.
Algunas veces es útil establecer un factor de coleo para limitar el máximo permisible
con relación a la asimetría del pico (figura 0241.3). Para propósitos farmacopeicos, el
factor de coleo T, se define como la relación de la distancia del ancho del pico, W0.05,
dividido entre dos veces la distancia, f, del máximo del pico hacia el lado izquierdo del
pico. Estas distancias deben medirse a un punto que corresponda a un 5 % de la altura
partiendo de la línea base. Para un pico simétrico el factor de coleo es la unidad y el
valor de T aumenta conforme el coleo va siendo más pronunciado. El cálculo se
expresa por la fórmula y la figura 0241.3:
𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙𝑒𝑜 = 𝑇 = 𝑊0.05⁄2f
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El factor de resolución (R) es importante para asegurar la separación de dos
componentes que eluyen muy cercano uno del otro y para establecer la eficiencia del
sistema. Los valores de aceptación de cada uno de los parámetros para la aptitud del
sistema deberán ser establecidos de manera experimental.
Número de platos teóricos (N)
Cada plato teórico representa un equilibrio teórico de distribución del soluto entre las
fases. El número total de platos teóricos de una columna representa el poder de
separación de la columna. Una buena columna tiene un número alto de platos teóricos.
El valor de N es dependiente de la sustancia que está siendo analizada y de las
condiciones de operación tales como la velocidad de flujo, la temperatura, la cantidad
del empaque de la columna y la uniformidad de éste.
Bibliografía
• Secretaria de Salud. (2014). Farmacopea de los Estados Unidos
Mexicanos. Volumen I. México: Secretaria de Salud
• Rojo Callejas Francisco. (2014). Cromatografía: Generalidades. 30/04/18,
de UNAM Sitio web:
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