CROMATOGRAFIA DE

LIQUIDOS DE ALTA
RESOLUCIÓN (HPLC)
 MÓDULO 5

TRATAMIENTO DE MUESTRAS, CÁLCULOS Y

TROUBLESHOOTING
5.1. TRATAMIENTO DE
MUESTRAS
5.1.1. Precauciones en el muestreo

Como en toda metodología analítica, en

Cromatografía Liquida el muestreo es una etapa
crítica. Para asegurar que los resultados obtenidos
sean representativos de la muestra o del lote que
ella representa se deben tener ciertas
consideraciones:

1.- Aplicar un diseño estadístico apropiado que

considere objetivos del estudio, certeza e
incertidumbre.
2.- Instrucciones claras para la toma de muestra,
etiquetado, conservación y transporte para facilitar
el análisis (Cadena de custodia).
3.- Entrenamiento del personal en técnicas de
muestreo y en los procedimientos específicos.
(Capacitación)
5.1.2. Precauciones en el volumen de muestra a inyectar
La etapa de la inyección de la muestra líquida y homogénea es una importante fuente de error. En general cuanto
mayor sea el volumen inyectado, menor será el error.
Habitualmente hay una relación entre el volumen de inyección y el tamaño de la columna a utilizar.

En columnas de 4,6 mm ID debemos considerar los siguientes máximos volúmenes.

Hatsa 100 uL en columnas de 25 cm de longitud.
Hasta 50 uL en columnas de 15 cm de longitud.
Hasta 20 uL en columnas en columnas mas cortas.
5.1.3. Limpieza de la muestra

Frecuentemente, la muestra que necesita ser

analizada no se encuentra en la forma en la
cual pueda ser inyectada directamente al
HPLC. El objetivo de la preparación de la
muestra es la remoción de potenciales
interferentes y la obtención del componente
de interés de la muestra, en un solvente y en
una concentración apropiados para la
inyección (detección y medición).
La remoción de interferentes puede
maximizar la exactitud y disminuir los tiempos
de análisis. En la figura de la derecha se
muestra el cromatograma de un componente
que eluye con interferentes cercanos en el
cromatograma (arriba), luego de la limpieza los
interferentes se han removido (abajo).
5.1.4. Extracción en fase sólida

La extracción en fase sólida SPE es una rápida,

simple y exacta forma de preparación de
muestra, para ello utiliza pequeños cartuchos de
extracción similares a columnas de HPLC. Los
cartuchos son llenados con una fase estacionaria
a elección, de acuerdo al tipo de compuesto que
se desea analizar. El componente de interés es
retenido, para luego ser eluido con un solvente
adecuado.
Alternativamente pueden retenerse las
impurezas y el componente de interés puede ser
eluido. SPE elimina los requerimientos de largos
y costosos problemas asociados a gasto de
solvente y tiempo de preparación de muestras,
como en extracción líquido líquido por ejemplo.
[Link]. Objetivo de la extracción en fase sólida (SPE)
La SPE puede utilizarse para retener el analito (ver figura de la izquierda) o los
interferentes (figura de la derecha)
[Link]. Interacciones con el soporte en la SPE
Dependiendo de la naturaleza de la muestra y analitos, existen distintas alternativas de
rellenos para los cartuchos de SPE, tal como se muestra en los 4 ejemplos de más abajo.
[Link]. Alternativas de limpieza de muestras por métodos clásicos
En la tabla de más abajo se muestran distintas alternativas recomendadas de tratamientos para
muestras complejas, los cuales en general son complejos.
[Link]. Alternativas de limpieza de muestras por SPE
En la tabla de más abajo se muestran distintas alternativas recomendadas de tratamientos para
muestras complejas por SPE.
[Link]. Proceso de Extracción en Fase Sólida

El proceso de SPE ocurre de acuerdo al ejemplo de la izquierda. A la derecha se observan distintas

cámaras de extracción que se pueden utilizar.
[Link]ón en HPLC

El método de derivatización es usado para mejorar los límites de detección, ej: introducción de
un fluoróforo en una molécula no fluorescente.
La reacción puede llevarse a cabo antes de la separación, (Pre-columna u off line)
O después de la separación y antes de la detección (post-columna, on line). Ver figura de más
abajo.
[Link]. Derivatización Pre columna
Ejemplo: Derivatización de aminoácidos libres utilizando 9-fluorenylmethyl-chloroformat (FMOC).
Más abajo se observa la reacción de derivatización pre columna utilizada para la determinación de
aminoácidos derivatizados con detector de fluorescencia.
[Link]. Derivatización Pre columna

Ejemplo: Derivatización de aminoácidos

libres utilizando fenilisotiocianato (PITC). En
la figura de la derecha se observa la reacción
de derivatización pre columna utilizada para
la determinación de aminoácidos
derivatizados con PITC utilizando detector
de fluorescencia.
[Link]. Derivatización post columna

El diagrama de la derecha muestra un

reactor, en el cual el eluente de la
columna es mezclado con el reactivo
de derivatización en la cámara de
reacción antes de llegar al detector.
Otros tipos usan incorporación de
reactivo con aire segmentado o
empaque de perlas.
[Link]. Derivatización post columna
Más abajo se muestra una fotografía de un sistema de derivatización post columna.
5.2. Análisis Cualitativo y
Cuantitativo en HPLC
5.2.1 Análisis Cualitativo en
HPLC
5.2.1. Análisis Cualitativo en HPLC

La técnica de cromatografía líquida entrega

una serie de información cualitativa (que
puede ser utilizada para fines de
identificación de compuestos), para estos
efectos el tiempo de retención
proporciona información relevante que
permite llevar a cabo la identificación de
los analitos.
[Link]. Identificación de los Picos

La HPLC por sí sola puede identificar los picos

sólo por la comparación de los tiempos de
retención entre un estándar y una muestra
problema. La identificación de todos los
componentes en una muestra compleja puede ser
difícil y consumir bastante tiempo, la confirmación
de la identidad de los componentes debe hacerse
por otra técnica de análisis, con el material
colectado del HPLC. La identidad del pico
también puede ser confirmada con una
sobrecarga en la muestra, con adición del
componente de interés, esto dará un incremento
en el área del pico de interés, la señal del resto
de los componentes se verá disminuida por un
efecto de dilución.
En la figura 1 se puede apreciar el efecto en el
cromatograma de una muestra de orina al
adicionar estándares de Vitamina C y ácido fólico.
Figura N° 1: Efecto en el cromatograma de orina blanco al que se le adiciona
estándares de vitamina C y ácido fólico en concentraciones crecientes.
[Link]. Identificación de las muestras

La HPLC es usada cualitativamente para

controles de calidad del tipo presencia o
ausencia de analitos en un producto, algunas
veces las intensidades relativas de los
componentes provee suficiente información ej.
Identificación de la fuente de la materia prima
o controlar su calidad. Este tipo de análisis es
particularmente usado para muestras muy
complejas. La integridad del producto también
puede ser monitoreada por el chequeo de los
picos del cromatograma. La figura de la
derecha, se observan dos cromatogramas de
aceite natural de limón y aceite sintético y
como se puede apreciar son diferentes y a
través de la simple observación se puede
concluir que no corresponden al mismo tipo
de muestra.
5.2.2 Análisis Cuantitativo en
HPLC
5.2.2. Análisis Cuantitativo en HPLC

La técnica además de proveer información para

identificar también entrega información que
permite llevar a cabo la determinación de la
cantidad de analitos presentes en la muestra, y
esta información está directamente relacionado
con el área bajo la curva de los picos
cromatográficos.
[Link] Integración de los Picos
Cromatográficos

La HPLC cuantitativa está basada en la

comparación de la respuesta del detector
al analito contra un estándar de
concentración conocida. La respuesta del
detector puede ser medida como la altura
del pico o su área. Muchos equipos de
HPLC cuentan con un sistema de
integración digital o electrónico, el cual
permite una mayor exactitud en la medida
de área del pico. En ausencia de un sistema
de integración los cálculos pueden hacerse
triangulando el área del pico de acuerdo a
la ecuación:

Area del Pico = Altura (h) x Ancho a la mitad de la Altura

(w1/2)
[Link] Integración de los Picos
Cromatográficos

Area del Pico = h x w1/2

La altura del pico puede medirse desde la

línea base hasta su señal máxima. Para que
los resultados sean más exactos el ancho
de los picos no deben alterarse
significativamente durante el tiempo de
análisis. Condiciones como temperatura de
columna, razón de flujo de fase móvil e
inyección de muestra deben ser
estrictamente controlados.
[Link] Integración de los Picos Cromatográficos por software

De acuerdo a lo señalado en la figura de abajo, el software realiza el cálculo digital del área
del pico cromatográfico resolviendo la integral de la variación de la absorbancia en relación
al tiempo de elución.
[Link]. Normalización de Área / Normalización interna

Con la normalización de área , el área de cada componente es expresada como un porcentaje del total
de las áreas de todos los picos presentes en el cromatograma, excluyendo el solvente. En el ejemplo de
más abajo, tenemos 3 picos, cuyas áreas suman 13,53 que equivale al 100 %, luego cada área se calculará:

% C1 = A1 x 100
A1 + A2 + A3
% C1 = 2,73 x 100 = 20,2 %, y así sucesivamente
13,53

NÚMERO ÁREA ÁREA PORCENTUAL

1 2,74 20,2
2 7,61 56,2
3 3,19 23,6
13,53 100,0
[Link]. Normalización de Área corregida o con factor de respuesta
Para corregir las variaciones en la sensibilidad del detector, el factor de respuesta para cada
componente debe ser calculado. Las áreas de los picos son corregidas por diferencias de
respuestas del detector a los diferentes tipos de analitos antes de la normalización. En el
ejemplo de más abajo, tenemos 3 picos, las áreas son las mismas, sin embargo, el detector
responde de manera distinta a cada compuesto y para el compuesto 1, el factor de respuesta
(en la próxima diapositiva se muestra la forma de determinarlo) es 0,603, por lo tanto e
cálculo de su área corregida y normalizada es:
% C1 = A1 x f1 x 100
A1xf1 + A2xf2 + A3xf3
% C1 = 2,74 x 0,603 __ x 100 = 21,14 %
7,813
[Link].1. ¿Cómo se calcula el factor de respuesta (f)?

Se determina a partir de la señal generada por cantidades conocidas de analitos (ya sea en
mezcla o separados), analizados bajo las mismas condiciones que la muestra.
En la tabla de más abajo, por ejemplo, el factor de respuesta para el compuesto 1 se determina
de la siguiente manera:

f1= A1/C1
F1= 2,73/4,53=0,60

FACTOR DE RESPUESTA
COMPUESTO ÁREA CONCENTRACIÓN
ÁREA/CONCENTRACIÓN

1 2,73 4,53 0,603

2 7,61 14,36 0,530

3 3,19 4,78 0,667

 [Link]. Estándar Externo o Calibración
Externa

El estándar externo está contenido en una

solución estándar conteniendo el mismo
componente de la muestra a ser determinado,
a nivel aproximadamente igual a la
concentración actual en la muestra. El factor C1= A1xC2
de respuesta es calculado para cada A2
componente del cromatograma del estándar.
La concentración de cada componente en la
muestra es calculado multiplicando el área del
pico por el apropiado factor de respuesta. Este
método es dependiente de la
reproducibilidad del volumen inyectado, así
como de la cantidad de muestra inyectado
cada vez.
[Link]. Estándar Interno

El uso de un estándar interno involucra la

adición de un volumen de substancia
exactamente medido a cada estándar y a las
muestra a determinar. Las soluciones son
inyectadas en el HPLC y la razón del área del
pico estándar y el área del estándar interno
son calculados. Esta razón puede ser graficada
para cada concentración del estándar
obteniendo un gráfico de calibración. Este
procedimiento elimina errores asociados a la
variación del volumen de inyección y a la
pérdida de analitos en los procesos de
derivatización.
[Link]. Estándar Interno

El estándar interno debería ser escogido para

un pico bien separado de todos los otros
componentes de la muestra, pero debe
además aparecer cerca del pico que interesa
analizar. El estándar interno normalmente es
de estructura similar a la del analito evitando
diferencias de polaridades extremas o
sensibilidad de los detectores y asegurar
similares propiedades en la extracción de los
analitos. En el ejemplo de la derecha, el
estándar interno eluye entre los componentes
de interés en la muestra.
[Link].1. Ejemplo de Estándar Interno

Para ilustrar el uso de estándar interno, consideraremos la determinación de aspirina usando fenacetina
como estándar interno.

1) Realizar curva de calibrado graficando la relación de áreas de la aspirina v/s área de la fenacetina (ver
figura de la izquierda), según cálculo mostrado al lado izquierdo
2) Se inyecta la muestra con la misma concentración de fenacetina y se determina la relación de áreas
3) Se interpola en la curva y se obtiene la concentración de la muestra desconocida
5.3. TROUBLESHOOTING EN HPLC
5.3.1. CRITERIOS A CONSIDERAR

ANTE UNA FALLA SE DEBE

TIPOS DE SERVICIO

 1.- IDENTIFICAR LA
1.- MANTENCIONES
FALLA
PREVENTIVAS

 2.- AISLAR LA FALLA

2.- REPARACIONES
 3.- CORREGIR LA FALLA
5.3.2. Reglas básicas

 Asegúrese que el problema exista

 Modifique un solo factor a la vez

 Sustituya la parte que falta si el problema no se

soluciona, vuélvalo a colocar

 Escríbalo
 5.3.3. Presunciones básicas para un buen Troubleshooting

 Usted se ha capacitado y sabe operar el equipo (Licencia de conducir A)

 El HPLC está enchufado y encendido
 Los solventes están en los reservorios
 Las bombas están mantenidas y en buen funcionamiento
 El HPLC está bombeando y marca presión alta y constante
 La lámpara del detector está en buen estado y encendida
 Las tuberías con solvente no tienen burbujas y están purgadas
 Usted no está usando una longitud de onda inadecuada para medir
 El rack de inyección está puesto y las muestras en posición correcta
 Usted no está corriendo gradiente de fase reversa a fase normal
 Usted no está usando solventes sin desgasificar
 Usted no tiene contaminación de agua al trabajar con columnas de sílica
 Usted no está trabajando a pH extremo con columnas que no lo resistan
 Usted no está corriendo gradiente de buffer a 100% ACN
 Usted no está usando gradiente con detector de Índice de refracción
 5.3.2. Presunciones básicas para un buen Troubleshooting

 Usted no está usando detector de Índice de refracción en laboratorio

sin control de temperatura.
 Usted no tiene buffer precipitando en sus pistones
 No hay vapores de HCl cerca de su HPLC
 Usted no tiene grandes fluctuaciones de temperatura en su
laboratorio
 Usted ha asistido a un entrenamiento regular en el tema
 Usted tiene personal entrenado que entiende lo que está haciendo
 Usted no ha dejado a cargo del equipo a un nuevo operador
 Usted usa instrumentos y materiales adecuados, bien verificados
conoce perfectamente su funcionamiento
 Usted tiene un PC de características adecuadas para manejar su
equipo
 Usted tiene un sistema operativo adecuado para manejar su equipo
 Usted mantiene periódicamente la memoria de su PC con buena
capacidad
5.3.3. Recomendación de registro de uso de columna

TIPO C-18 FABRICANTE xxxxxxxx

RECIBIDA------------ DISTRIBUIDOR xxxxxxxx
NUMERO------------ TELEFONO xxxxxxxx

LONGITUD 25 cm
ID 4,6 mm
dp 5 um

SISTEMA DE CONTROL
DESTINADA A IBUPROFENO
FASE MOVIL METANOL 75% / AGUA 25%

CONTROL
FECHA ANALISTA N°INYECCIONES SOLVENTE N t R

22 .01.2013 PP 54 MET/H2O 4500 1,01 3,2

04.02.2013 JC 27 MET/H2O 4500 1.00 3,2
07.03.2013 PP 65 MET/H20 4500 1.01 3,2
14.03.2013 JC 0 MET/H2O 2300 1,5 1,8
5.3.4. Fallas frecuentes relacionadas al equipo
[Link]. Presión en aumento

 FILTRO DE LÍNEA SUCIO

 INYECTOR BLOQUEADO
 PRE COLUMNA DETERIORADA
 COLUMNA TAPADA
[Link]. PRESIÓN FLUCTUANTE
 AIRE EN CABEZAL
 SELLO DESGASTADO
 PÉRDIDA EN EL SISTEMA
Diagrama interno del sistema de bombeo
[Link]. Carryover

 CONTAMINACIÓN DEL SISTEMA DE INYECCIÓN

INDEPENDIENTE DE LA CANTIDAD DE MUESTRA INYECTADA
[Link]. Pérdidas en inyector

 SELLOS DE AGUJA
DESGASTADO
 ROTOR DESGASTADO
 CONECCIONES SUELTAS
[Link]. Deriva de la línea base

 MALA DESGASIFICACIÓN DE
SOLVENTE
 IMPUREZAS DE SOLVENTE
 IMPUREZAS ELUYENDO DE LA
COLUMNA
 FILTRACIONES EN EL EQUIPO
 FLUCTUACIONES DE TEMPERATURA
 FALTA DE EQUILIBRIO EN LA
LÁMPARA
 LÁMPARA SUCIA
 CELDA SUCIA
 ÓPTICA SUCIA
DIAGRAMA DE ENSAMBLAJE DE CELDA
[Link]. Señal ruidosa

 LÁMPARA AGOTADA O CON BAJA

ENERGÍA
 AIRE EN LA BOMBA
 COLUMNA ELIMINANDO
PARTICULAS O CONTAMINACIÓN
 AIRE EN LA CELDA
 CELDA SUCIA
 FILTROS SUCIOS
 FALTA CONEXIÓN A TIERRA
 PÉRDIDAS EN EL SISTEMA
 ELECTRÓNICA RUIDOSA
[Link]. Derivas en los tiempos de retención

 FALTA DE EQUILIBRIO
EN LA FASE MÓVIL

 CAMBIOS EN LA FASE MÓVIL

(EVAPORACIÓN)

 CAMBIOS EN LA
TEMPERATURA
[Link]. Cambios en tiempo de retención

 MÁS CORTOS
 MÁS LARGOS

 PÉRDIDA DE LOS GRUPOS C-18

DE LA COLUMNA  FASE MÓVIL INADECUADA
 MATERIAL DE RELLENO DE LA  TEMPERATURA ERRÓNEA
COLUMNA CONTAMINADO  FLUJO INADECUADO
 FASE MÓVIL INADECUADA
 TEMPERATURA ERRÓNEA
 FLUJO INADECUADO
 COLUMNA SOBRECARGADA
[Link]. Cambios bruscos en tiempos de retención

• PÉRDIDAS EN EL EQUIPO
• FASE MÓVIL INADECUADA
• FALLA EVIDENTE EN LA BOMBA
• BURBUJAS EN CABEZAL DE PISTÓN
[Link]. Picos con cola

 DISOCIACIONES PARCIALES POR

pH INADECUADO
 MÁS DE UN MECANISMO DE
RETENCION
 FASE MÓVIL INAPROPIADA
 COLUMNA DEFICIENTE
CAMBIO DE SELECTIVIDAD DE LA
COLUMNA
 ESPACIO VACÍO EN LA CABEZA DE LA
COLUMNA
 PRECOLUMNA DETERIORADA
 MATERIAL DE RELLENO DE LA
COLUMNA CONTAMINADO

TAILING MAYOR SOLO EN PICOS TEMPRANOS GENERALMENTE

SON CAUSADOS POR EFECTO EXTRACOLUMNAR (VOLUMEN MUERTO)
CRITERIOS PARA EVALUACIÓN DE TAILING
COLUMNA CONTAMINADA

PICOS CON FRONTING COLUMNA SOBRECARGADA

 [Link]. Picos fantasmas

 ELUCIÓN DE COMPUESTOS RETENIDOS

DE INYECCIONES ANTERIORES

 MUESTRA MAL IDENTIFICADA

LOS PICOS SE TORNAN MÁS ANCHOS AL AUMENTAR EL TIEMPO DE RETENCIÓN

ES UN FENÓMENO NORMAL EN ANÁLISIS ISOCRÁTICO

[Link]. Picos más anchos de lo habitual

 COLUMNA CON BAJA

EFICIENCIA
 MAL AJUSTE DE LA TOMA
DE DATOS DEL DETECTOR
 FENÓMENO NORMAL EN
CROMATOGRAFÍA DE
EXCLUSIÓN MOLECULAR
5.3.5. Cuidados con el uso de columnas

 FILTRAR LAS FASES MÓVILES Y LAS MUESTRAS

 REMOVER LAS SALES CON AGUA CADA VEZ QUE SE USAN
 ELIMINAR EL AGUA DE LA COLUMNA USAR METANOL/AGUA
 CIRCULAR PERIÓDICAMENTE METANOL
 USAR UNA COLUMNA PARA CADA TIPO DE MUESTRA
 OPTIMIZAR PROTOCOLOS DE PREPARACIÓN DE MUESTRA
 UTILIZAR FILTROS
 INYECTAR RÁPIDAMENTE
 UTILIZAR pH 1.5 a 9.5 (CONSULTAR FABRICANTE)
 NO SUBIR DE 60°C (CONSULTAR FABRICANTE)
 IDEALMENTE DISOLVER LA MUESTRA EN FASE MÓVIL
 GUARDAR LAS COLUMNAS TAPADAS EN SOLVENTE ORGÁNICO
ACUOSO
 EVITAR CAÍDAS Y GOLPES
 REGENERAR SEGÚN INSTRUCCIONES DEL FABRICANTE
5.3.6. Recomendación general para cambios de solvente
5.3.7. Cosas que nunca se deben hacer

 No tapar la salida del detector de Índice de Refracción

 No lavar con metanol después de haber pasado buffer
 No inyectar muestras que puedan precipitar con la fase móvil
 No filtrar solventes orgánicos con filtros para solventes acuosos
 No derramar buffer sobre la electrónica del equipo
 No cambie columnas deteniendo el flujo
 No almacene columnas con THF destapadas por semanas
 No selle los recipientes de fase móvil
 No corte tubos sin herramientas adecuadas