CROMATOGRAFIA DE
LIQUIDOS DE ALTA
RESOLUCIÓN (HPLC)
MÓDULO 2
FASE MÓVIL, BOMBA E INYECTOR
[Link] MÓVIL EN HPLC
2.1. FASE MÓVIL
2.1. FASE MÓVIL
En Cromatografía Líquida la fase móvil tiene por función disolver y transportar la muestra y, por lo tanto, los
analitos desde el inyector hacia el resto del sistema, pasando por la columna analítica, alcanzando el detector y
finalmente salir hacia el contenedor para los desechos.
La composición dependerá de la naturaleza de los analitos a separar, de la fase estacionaria y del mecanismo de
separación a usar.
2.1. FASE MÓVIL
La fase móvil es un componente muy
importante dentro del sistema
cromatográfico en HPLC y requiere tener
ciertas características tales como:
• Alta Pureza (solvente grado HPLC)
• Filtrada (libre de partículas)
• Desgasificada (libre de gases)
• Libre de Cloruros (sobretodo si tiene
contacto con acero inoxidable)
• Baja reactividad
• Alto poder disolvente de la muestra
• Baja viscosidad
• Compatible con el detector que se vaya
a utilizar
2.1. 1. AGUA
El Agua es ampliamente utilizado como componente de
la fase móvil en HPLC y debe ser una agua de alta
pureza, para evitar presencia de contaminantes que
pudieran generar reacciones no deseadas con
compuestos de la muestra, analitos o con la fase
estacionaria, o en otro caso, daños en componentes del
sistema cromatográfico.
Basándose en la clasificación de aguas para uso de
laboratorios de la norma ASTM 1193:2001, el agua
recomendada para HPLC es la grado 1.
A continuación se presentan los usos recomendados
por la norma ASTM 1193 para agua Tipo I y en la Tabla 1
se presentan los requerimientos para el agua de
distintos tipos.
2.1. 1. 1. CLASIFICACION DE LOS TIPOS
DE AGUA ASTM 1193: 2001.
Tipo I: Usada para procedimiento que
requieren de máxima exactitud y
precisión; tales como espectrometría
atómica, fotometría de llama,
enzimología, gas en la sangre, soluciones
buffer de referencia y reconstitución de
materiales liofilizados usados como
estándares. El agua Tipo I, debe
seleccionarse siempre que en la prueba
sea esencial un nivel mínimo de
componentes ionizados o cuando se
preparan soluciones para análisis de
rastreo de metales, HPLC.
Tabla 1: Características de los distintos tipos de Agua según ASTM
1193:2001.
Conductividad / Resistividad
Conductividad eléctrica: todas las sustancias con transportadores de carga
móviles (electrones e iones) actúan como conductores de la electricidad cuando se
aplica una corriente eléctrica y por lo tanto poseen una conductividad que puede
ser medida y es la recíproca de la resistividad específica.
Unidades Sí:
Conductividad: S/m (Siemens por metro)
Resistividad Específica: m
Es muy importante que el agua que se utilizará en HPLC tenga muy baja
conductividad, ya que esto implica que habrá una muy pequeña cantidad de
sustancias contaminantes que transporten cargas, como es el caso de los metales
(cationes) y sus sales (aniones)
[Link]. Producción de Agua Grado Reactivo Tipo I
Para la producción de Agua Tipo I:
- Se utilizan resinas de intercambio
aniónico y catiónico con filtros de
carbón activo
- Poseen filtros de partícula
generalmente de 0.22 m
- Volúmenes típicos de producción son
de 0.5 ~ 1.5 L/min
- Cantidad máxima de TOC : 5 ~ 10 ppb
- Reducen nivel de metales pesados y
pirógenos
- Resistividad hasta18.2 M·cm
2.1. 1.1.3. Ventajas del Agua Tipo 1
Utilizar el Agua Tipo I como componente de la fase móvil en HPLC tiene una serie de
ventajas, entre las que destacan:
- Prolongar la vida útil de las columnas analíticas ya que esta agua tiene una muy baja
carga de contaminantes químicos y biológicos
- Disminución de las reacciones inespecíficas entre compuestos presentes en la
muestra y contaminantes en el agua
- Mejoramiento de los límites de detección y cuantificación, debido a la desaparición
En la Figura 1 se comparan los cromatogramas que se obtienen al aplicar un gradiente
desde 100 % agua a 100% acetonitrilo a un flujo de mL/minuto en 30 minutos y
lectura de absorbancia a 210 nanométros.
Figura 1: Comparación de cromatogramas utilizando aguas de
distintas calidades en la fase móvil
2.1. 1. 4. Filtración de la Fase Móvil
Así como el agua utilizada debe ser pura, el
resto de los componentes de la fase móvil,
además de ser de alta pureza (grado HPLC), la
fase móvil debe ser filtrada ya sea para
eliminar partículas que pueden provocar
obstrucciones en componentes del sistema
(inyector, pro ejemplo) o bien acumularse en
la cabeza de la columna analítica y provocar su
taponamiento con la consiguiente pérdida de
eficiencia y daño a la misma o a la bomba por
el aumento de la presión interna .
2.1. 1. 4. Filtración de la Fase Móvil
El sistema de filtración a utilizar debe generar un vacío adecuado, ya que además en
esta etapa también se produce la desgasificación de la fase móvil
2.1. 1. [Link] de membranas para la filtración
Debido a que la naturaleza de las muestras y analitos es variada, existen en el mercado
varios tipos de membrana que poseen distintas características que se deben considerar
al momento de elegir qué membrana utilizar.
Acetato de Celulosa (CA)
Membrana hidrofílica ideal para filtrar muestras acuosas. Baja unión de proteínas
Celulosa Regenerada (RC)
Membrana hidrofílica ideal para filtrar muestras acuosas y orgánicas en HPLC. Resistencia pH 2 a 12. Baja
unión de proteínas
Difluoruro de Polivinideno (PVDF)
Membrana Hidrifílica con buena resistencia a solventes, ideal para filtración de Fase móvil de HPLC, baja
unión de proteínas
2.1. 1. [Link] de membranas para la filtración
Politetrafluoroetileno (PTFE)
Membrana Hidrofobica quimicamente resistente a solventes, ácidos y bases
Polipropileno (PP)
Alta resistencia, puede ser usado virtualmente con todos los solventes, ácidos y bases
Glass Fiber (GF)
Comunmente usado como pre filtro para todas las filtraciones Típicamente usada para muestras que
contienen DNA.
Nylon – Poliamida 6-6 (NY)
Comunmente usado para filtración de muestras antes de inyectar, buena resistencia a solventes. Tiene
propiedades hidrofílicas por lo que se obtienen buenos resultados con muestras acuosas. No se
recomienda para trabajos con proteínas
2.1. 1. 6. Sistemas de Desgasificación en Línea
Son sistemas de desgasificación que aprovechan la propiedad semi
permeable del Teflón a los gases. Se hace pasar la fase móvil por
un tubo de teflón el cual se mantiene dentro de una cámara de
vacío, de esta forma la fase móvil que pasa a través del sistema y
se mantiene constantemente libre de gases disueltos.
Muchos equipos de cromatografía de líquidos funcionan sólo con
desgasificación previa ya sea por agitación, calentamiento, ultra
sonido o burbujeo con helio.
La desgasificación continua ofrece la ventaja de evitar la re
disolución de gases atmosféricos durante el tiempo de análisis. La
presencia de gases en fase móvil favorece la formación de
burbujas y desplaza la fluorescencia (efecto Quenching).
2.1. 1. 6. Sistemas de Desgasificación en
Línea
Como se puede ver en la figura de la
derecha, en estos sistemas de desgasificación
se aplica un vacío, el cual actúa sobre la Fase
Móvil que es impulsada por la bomba.
Cuando la Fase Móvil sale del reservorio de
solventes y atraviesa la cámara de vacío, los
gases presentes son extraídos y así al
momento de alcanzar la bomba y ser
empujada hacia el inyector y la columna, la
fase Móvil está libre de gases que pudieran
interferir en el normal desarrollo de la
cromatografía.
2.1. 1. 7. Composición de la Fase Móvil
En la mayoría de los casos la fase móvil estará constituida por mezclas de 2 o más solventes en
proporciones definidas. Cuando la proporción de los componentes de la Fase Móvil permanece
constante durante todo el proceso cromatográfico se dice que la cromatografía se está desarrollando en
modo isocrático. En cambio cuando la proporción relativa de los solventes varía durante la cromatografía
se dice que la cromatografía se está desarrollando en gradiente.
También existen distintas denominación de la composición de la fase Móvil de acuerdo al número de
solventes que la componen.
Si la Fase Móvil esta compuesta por 2 solventes se denomina mezcla binaria.
Si la Fase Móvil esta compuesta por 3 solventes se denomina mezcla ternaria.
Si la Fase Móvil esta compuesta por 4 solventes se denomina mezcla cuaternaria.
Otro antecedente que se debe tener en consideración es que los componentes de la Fase Móvil deben
poder mezclarse entre sí, es decir, deben ser miscibles.
En la Figura 2 se muestra la miscibilidad entre solventes de uso común en HPLC. Por ejemplo, el
acetonitrilo no puede utilizarse para una mezcla binaria con ciclohexano, así como la acetona se puede
utilizar con cualquiera de los solventes descritos en la figura.
Figura 2: Miscibilidad de distintos solventes de uso común en HPLC
2.2. Intrumentación en HPLC
La instrumentación en HPLC comprende distintos componentes, como los que se describen en la Figura
N° 3. La del sistema cromatográfico a utilizar depende en gran medida del tipo de problema analítico a
resolver. Por ejemplo, el tipo de muestra, tipo de analitos, niveles de detección y cuantificación
requeridos, requisitos normativos y legales, etc.
Pero de manera general siempre el sistema deberá contemplar a lo menos:
- Reservorio de Solventes
- Bomba
- Inyector
- Columna Analítica
- Detector
- Sistema de Procesamiento de Datos
- Contenedor para desechos
Figura N° 3. Sistema de Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución típico
2.2.1. BOMBA
La Bomba del HPLC es la encargada de
impulsar a la Fase Móvil para que ésta avance a
través del sistema y debe poseer las siguientes
características:
- Entregar un flujo constante de fase móvil,
libre de pulsaciones.
-Entregar flujos reproducibles, ( típicamente
0,001-9,999 mL/min.), con una presión en el
sistema de hasta 6000 PSI.
- Tener un bajo volumen interno para
responder rápido a los cambios de solventes.
- De manufactura confiable y construidos en
materiales no reactivos con la fase móvil o
eluente.
TIPOS DE BOMBAS
[Link]. Bomba de Jeringa
La bomba de jeringa es la bomba mas simple disponible para ser usada en HPLC.
Es usada para dosificar muy pequeños volúmenes de eluente, a flujos muy constantes.
La razón de flujo puede ser variada cambiando la velocidad del motor. La jeringa que es llenada con el solvente
generalmente tiene un volumen de 200 a 500 mL antes que requiera nuevamente ser llenada. No se requiere
ningún tipo de reductor de pulso.
La bomba de jeringa es usada para trabajos con columnas de microcalibre, cuando no es necesario un gran
volumen de eluente
TIPOS DE BOMBAS
[Link]. Bomba de un pistón
La bomba de un pistón
consiste en una pequeña
cámara en la cual el
eluente es bombeado
por un pistón el que a su
vez es movido por un
motor
Cuando el pistón se mueve hacia atrás (succión), el eluente entra a la cámara, cuando el pistón se mueve
hacia delante (compresión), el eluente es forzado a salir de la cámara.
Una válvula Check de entrada asegura que el eluente no será forzado a retornar a la línea al ser
comprimido y una válvula check de salida asegura que el eluente no retornará a la cámara durante la
succión.
TIPOS DE BOMBAS
[Link]. Bomba de un pistón
Las bombas de un pistón
son productoras de pulsos,
estos pueden disminuirse
usando bombeos de alta
velocidad , reductores de
Pulso (DAMPER),
compensadores
electrónicos o una
combinación de ellos.
VALVULA CHECK
[Link]. Bomba de un pistón
ABIERTA CERRADA
Flujo
Fase
móvil
La válvula check está diseñada para permitir que a medida que el pistón se mueve, permita que la Fase
Móvil avance hacia la columna analítica, pero evita que se devuelva hacia el reservorio de solventes.
VALVULA CHECK
[Link]. Bomba de un pistón
Video operación de una válvula check.
TIPOS DE BOMBAS
[Link]. Bomba de doble pistón
Las bombas de doble pistón, a diferencia de la bomba de pistón simple pueden atenuar las pulsaciones. Existen bombas
de doble pistón en serie y en paralelo.
Bombas doble pistón en serie
Bombas doble pistón en paralelo
Emplea dos pistones idénticos.
Cada pistón trabaja a diferente velocidad, el primero Cada pistón trabaja en forma independiente
como pistón de trabajo y el segundo como pistón entregando el mismo volumen de solvente.
de equilibrio. Los volúmenes de cada pistón son combinados
El pistón de trabajo entrega la razón de flujo en la zona de alta presión.
programada durante la compresión.
Al mismo tiempo, el pistón de equilibrio está
llenando su cámara. Esto sirve como reserva de
solvente el cual se expulsará cuando el pistón de
trabajo se esté llenando.
Se producirá una entrega de solvente continua.
En la Figura N°4 se ve diseño de bombas en serie y
paralelo.
Figura N° 4. Diseño de Bombas de doble pistón en paralelo (izquierda) y en serie (a la
derecha).
Figura N° 5. Pulsaciones de bomba pistón simple v/s doble pistón
PISTON SIMPLE
DOBLE PISTON
Como se puede apreciar, las bombas de doble pistón si bien tienen pulsaciones,
están son atenuadas de manera muy importante en relación a las bombas de pistón
simple.
[Link]. FORMACIÓN DE GRADIENTE
El desarrollo de la cromatografía en gradiente implica el cambio de las proporciones relativas de los
solventes que conforman la Fase Móvil en el tiempo.
El gradiente puede ser formado en alta y baja presión.
Gradiente en alta presión:
En el gradiente en alta presión existe una bomba por cada solvente que conforma la fase móvil, el que
es bombeado en alta presión. El gradiente se va formando en función de los flujos relativos que
entrega cada bomba para cada solvente en particular, los cuales se mezclan en el mezclador o mixer
en alta presión y luego avanzan hacia el resto del sistema cromatográfico.
Gradiente en baja presión
En el gradiente en baja presión, existe una sola bomba que succiona a todos los solventes que
componen la fase móvil. En este caso el solvente se va conformando mediante la operación de
bombas solenoides que proporcionan una fracción del flujo total de la bomba, así los solventes llegan
al mixer donde se mezclan en baja presión y luego llegan a la bomba que los impulsa hacia el resto
del sistema cromatográfico en alta presión
En la figura N° 6 se muestra el esquema de formación de un gradiente binario en alta y baja presión
Figura N° 6. Esquema de formación
de gradiente binario en alta presión
(arriba) y en baja presión (abajo)
[Link]. SISTEMA DE INYECCIÓN
La muestra en HPLC debe ser ingresada al sistema
cromatográfico mediante un sistema de inyección
que debe ser capaz de trabajar en el área de alta
presión e ingresar un volumen pequeño y discreto.
Los inyectores poseen un loop de volumen fijo. Con
la válvula de muestreo en posición de carga, la
muestra es introducida por la puerta del inyector
con ayuda de una jeringa y aguja llenando el loop El tipo de inyector más común
con la muestra. Cuando la válvula es girada a la es la válvula que se muestra
posición de inyección, el eluente pasa a través del arriba.
loop transfiriendo su contenido dentro de la
columna.
[Link].1. COMPONENTES DEL INYECTOR
En el esquema de abajo se muestran los componentes de un inyector para HPLC
[Link].1.1. Introducción manual de la muestra:
Posición de Carga
Inicialmente el inyector se encuentra en la posición de carga. En esta posición se introduce la jeringa y se inyecta
la muestra, la cual ingresa al loop y el exceso se irá directamente al desecho del [Link] figura N° 7
Posición de Inyección
El inyector se pasa rápidamente a la posición de inyección, momento en el que el contenido del loop es
impulsado por la bomba hacia la columna de manera [Link] figura N° 8.
Figura N° 7: Introducción Manual de la Muestra - Carga
El rotor de la válvula es girado. Esta rotación
mueve los conectores internos entre las
puertas de la válvula de modo de poder llenar
el loop . El analista inyecta la muestra usando
una jeringa y llenando el loop. Cualquier
exceso de muestra es eliminado a través de la
cañería de drenaje.
Figura N° 8: Introducción Manual de la Muestra -
Inyección
El rotor de la válvula es girado. Esta rotación
mueve los conectores internos entre las
puertas de la válvula, de modo de poder
arrastrar el contenido del loop y enviarlo hacia
la columna.
[Link].1.2. Introducción automática de la muestra:
Posición de Carga
Inicialmente el inyector se encuentra en la posición de carga. En esta posición se introduce la jeringa
autosampler que inyecta la muestra, llenando el loop. En esta posición la fase móvil está pasando directamente
hacia la [Link] figura N° 9
Posición de Inyección
El inyector automático pasa rápidamente a la posición de inyección, momento en el que el contenido del loop
es impulsado por la bomba hacia la columna de manera [Link] figura N° 10.
Figura N° 9: Introducción automática de la Muestra - Carga
Figura N° 10: Introducción automática de la Muestra - Inyección