UNIVERSIDAD NACIONAL “SAN LUIS GONZAGA” DE ICA

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

CONTENIDO DE POLIFENOLES TOTALES Y ACTIVIDAD

ANTIOXIDANTE IN VITRO DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE
HOJAS Y FLORES DE Chuquiraga spinosa Less.
”huamanpinta”

TESIS
PARA OPTAR AL TÍTULO DE:

QUÍMICO FARMACÉUTICO
PRESENTADO POR:
Bach. Sánchez Llamosa Miguel Jesús
Bach. Anicama Pariona Nataly Esther

ASESOR
Mg Juan José A. Palomino Jhong
Co- ASESOR
Mg. Oscar Herrera Calderon
ICA-PERÚ
2015
Dedicatoria:

A Dios por darnos el conocimiento y estar pendiente de nosotros.

A nuestros padres y hermanos quienes con su amor, apoyo y

comprensión incondicional estuvieron siempre a lo largo de nuestra

vida estudiantil; a ellos que siempre tuvieron una palabra de aliento en

los momentos difíciles y que han sido incentivos de nuestras vidas.

A nuestros asesores quienes confiaron en cada una de nosotros para

poder llevar acabo el desarrollo de la presente, brindándonos sus

conocimientos y apoyo incondicional en esta ardua labor.

4
 AGRADECIMIENTOS

Nuestro más amplio agradecimiento a los docentes que con su paciencia

nos supieron orientar hacia el camino de la superación y el éxito.

A nuestros asesores que gracias a su apoyo y dedicación no hubiese sido

posible la culminación de la presente investigación

Al Jefe del Departamento de Ciencias Químicas por permitirnos usar las

instalaciones del laboratorio de Química General Aplicada de la [Link] –

UNICA, para la realización del presente trabajo de tesis.

A nuestros profesores de la Facultad de Farmacia y Bioquímica por todo el

conocimiento brindado en estos cinco años de estudios.

3
 ÍNDICE

Página

RESUMEN 7

ABSTRACT 8

INTRODUCCIÓN 9

CAPÍTULO I. ASPECTOS GENERALES 12

1.1 BASES TEÓRICAS 12

1.1.1 Chuquiraga spinosa Less “huamanpinta” 12

1.1.2 Clasificación Sistemática de la Especie 13

1.1.3 Ubicación Geográfica y Hábitat 14

1.1.4 Composición química y usos tradicionales 14

1.2 ANTECEDENTES DE INVESTIGACIÓN 14

1.3 SISTEMAS DE DEFENSA ANTIOXIDANTE 16

1.4 FLAVONOIDES 18

1.5 DETERMINACIÓN DE CAPACIDAD ANTIOXIDANTE IN VITRO 21

1.5.1 Reacciones SET y reacciones HAT 22

1.5.2 Método del Poder Antioxidante de Reducción Férrica

(FRAP) 24

1.5.3 Método reacción con el radical 2,2’-azino-bis-(3-

etilbenztiazolin-6-sulfonato de amonio) (ABTS) 26

1.5.4 Método de inhibición frente al radical libre

2,2-Difenil-1-picrilhidraizil (DPPH) 28

4
 1.5.5 Trolox. 29

CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS 31

2.1 MATERIAL 31

2.1.1 Material biológico: 31

2.1.2 Material Farmacológico: 31

2.1.3 Material en General: 31

2.1.4 Sales químicas y reactivas: 32

2.1.5 Equipos 33

2.2 METODOLOGÍA ANALÍTÍCA 33

2.2.1 ESTUDIO FITOQUÍMICO. 33

2.2.2 DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS 35

2.3 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE IN VITRO 42

2.3.1. Método de inhibición del radical DPPH 42

2.3.2 Método reacción con el radical (ABTS) 47

CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 50

3.1 ESTUDIO FITOQUÍMICO 50

3.1.1 Clasificación taxonómica. 50

3.1.2 Porcentaje de rendimiento del extracto etanólico seco

de la obtención del extracto etanólico 50

3.1.3 Análisis fitoquímico cualitativo del extracto etanólico 51

3.2 Cuantificación de polifenoles totales 52

5
3.3 Evaluación de la actividad antioxidante frente al radical DPPH 55

3.4 Evaluación de la actividad antioxidante frente al radical ABTS 58

3.5 Determinación de la capacidad antioxidante equivalente a

Trolox (TEAC-ABTS) 59

DISCUSIÓN 61

CONCLUSIONES 66

RECOMENDACIONES 67

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 68

ANEXOS 74

6
 RESUMEN

Objetivos: Determinar el contenido de polifenoles totales y la

actividad antioxidante in vitro del extracto etanólico de las hojas y
flores de Chuquiraga spinosa Less “huamanpinta”. Diseño: Estudio
experimental. Lugar: Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad
Nacional San Luis Gonzaga de Ica-Perú. Material Biológico: Se
utilizó hojas y flores de huamanpinta los cuales se maceraron en
etanol al 96 %, durante 7 días, para obtener el extracto etanólico seco
de ambas partes de la planta por separado, se determinó los
principales metabolitos secundarios en ambos extractos y el
contenido de polifenoles totales según el método de Folin Ciocalteu,
la actividad antioxidante in vitro frente a los radical DPPH y ABTS. Se
utilizó la ecuación de la recta y el coeficiente de regresión lineal para
determinar estos valores. Resultados: Se determinó la presencia de
flavonoides, compuestos fenólicos, taninos y alcaloides. El contenido
de polifenoles totales en hojas y flores fue: 51,8 ± 1,27 mgEAG/g de
extracto y 354,2 ± 1,9 mgEAG/g de extracto respectivamente. La
actividad antioxidante frente al radical DPPH mostró; CI 50 en flores=
5,69 g/mL y CI50 en hojas =14,98 g/mL; mientras que el TEAC-
ABTS fue: TEAC hojas= 22,52 ± 0,19 mol/g de extracto y TEAC-
ABTS flores= 39,15 ± 0,31mol/g de extracto. Conclusión: El extracto
con mayor contenido de polifenoles y actividad antioxidante in vitro
frente al radical DPPH Y ABTS fue el extracto etanólico de flores de
Chuquiraga spinosa Less “huamanpinta”.

Palabras clave: Chuquiraga spinosa, huamanpinta, antioxidante,

compuestos fenólicos, DPPH, ABTS

7
 ABSTRACT

Objectives: To determine the content of total polyphenols and the

antioxidant activity in vitro of the ethanolic extract of Chuquiraga
spinosa Less “huamanpinta” of the sheets and flowers. Design:
Experimental study. Place: Facultad de Farmacia y Bioquímica,
Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica Peru. Biological
material: Which used sheets and flowers of huamanpinta, dry of both
parts of the plant macerated in ethanol to obtain the ethanolic extract
separately, it determined the main secondary metabolites in both
abstracts itself and the content of total polyphenols according to the
Folin's method Ciocalteu, the antioxidant activity in vitro in radical
DPPH, ABTS stops next determining the antioxidant equivalent
capacity of trolox (TEAC-ABTS). The equation of the straight line and
the linear regression coefficient to determine these values were used.
Results: The content of total polyphenols in sheets and flowers were:
51,8 ± 1,27 mgEAG/g y 354,2 ± 1,9 mgEAG/g. Antioxidant activity of
DPPH was: CI50 flowers: 5,69 g/mL y CI50 sheets: 14,98 g/mL;
TEAC ABTS was for TEAC sheets: 22,52 ± 0,19 mol/g de extract y
TEAC flowers: 39,15 ± 0,31mol/g; respectively. Ethanolic extract of
flowers of Chuquiraga spinosa “huamanpinta” has higher content of
polyphenols and antioxidant activity against ABTS, DPPH radical.

Key words: Chuquiraga spinosa, huamanpinta, antioxidant, phenolic

compounds, DPPH, ABTS,

8
 INTRODUCCIÓN

En un sistema biológico, un antioxidante es capaz de

reaccionar con radicales libres siendo entonces un terminador de

cadena oxidativa. La capacidad antioxidante de una sustancia o

molécula se define como la habilidad para inhibir la degradación

oxidativa (por ejemplo, lipoperoxidación). La capacidad antioxidante

está determinada a su vez por: a) reactividad química del antioxidante

asociada a la actividad antirradicalaria o estabilizadora de radicales

libres; b) capacidad para acceder al sitio de reacción y; c) estabilidad

de los productos formados después del proceso de estabilización de

radicales libres 1.

Ante un incesante daño que ejercen los radicales libres en los

sistemas vivos la naturaleza ha brindado diferentes fuentes de

protección que permiten mediar este daño. Los compuestos fenólicos

son moléculas de importancia demostrada de actividad antioxidante,

presentan un numeroso grupo ampliamente distribuido en la

naturaleza y son componentes importantes en la dieta humana 2.

El consumo promedio de fenoles en los países europeos se

estima en 23 mg/día. Existe un interés creciente en los compuestos

fenólicos debido a su efecto contra algunas enfermedades como

9
ciertos cánceres y desordenes cardíacos derivados de su poderosa

actividad antioxidante3.

La medicina alternativa complementaria se está volviendo cada vez

más popular en muchos países desarrollados y es a menudo el único

tratamiento accesible y asequible disponible. La medicina natural a

base de extractos de plantas medicinales es utilizada con el propósito

de solucionar diferentes enfermedades; los metabolitos secundarios

presentes son responsables de algunas “propiedades curativas” y

constituyen un gran potencial de reserva inexplorada de inmensa

utilidad4.

La Chuquiraga spinosa Less “huamanpinta” es una especie con

uso terapéutico de la familia de las Asteraceae, crece en los andes

del Perú sobre los 3500 msnm, y es utilizado como antiinflamatorio,

analgésico, diurético, anti prostático, cáncer genitourinario, etc5.

Sin embargo, no hay evidencia de estudios científico realizado

a la especie sobre su acción antioxidante en hojas y flores bajo la

forma de extracto etanólico, razón por la cual se realizó el presente

trabajo de investigación. Considerando el uso tradicional que se le

atribuye, nos planteamos el siguiente problema de investigación: ¿El

contenido de polifenoles totales presentes en el extracto etanólico de

hojas y flores de Chuquiraga spinosa Less. “huamanpinta” estará

10
asociado a su actividad antioxidante in vitro frente al radical DPPH Y

ABTS?

Para ello nos planteamos el siguiente objetivo general y los

específicos correspondientes:

OBJETIVO GENERAL:

Determinar el contenido de polifenoles totales y la actividad

antioxidante in vitro del extracto etanólico de hojas y flores de

Chuquiraga spinosa Less. “huamanpinta”.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

1. Identificar cualitativamente los metabolitos secundarios del

extracto etanólico de hojas y flores de Chuquiraga spinosa Less.

“huamanpinta”, mediante el tamizaje fitoquímico preliminar,

2. Determinar el contenido de polifenoles totales presentes en el

extracto etanólico de hojas y flores de Chuquiraga spinosa Less

mediante la técnica de Folin Ciocalteu,

3. Medir el efecto antioxidante in vitro mediante la técnica de

captación del radical 1,2 difenil-picril-hidracil (DPPH) y el 2,2’-

azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfonato de amonio (ABTS) del

extracto etanólico de hojas y flores de Chuquiraga spinosa Less.

“huamanpinta”.

4. Relacionar el contenido de polifenoles totales presentes en cada

uno de los extractos de hojas y flores de “huamanpinta” con la

capacidad antioxidante in vitro.

11
 CAPÍTULO I
ASPECTOS GENERALES

1.1 BASES TEÓRICAS

1.1.1 Chuquiraga spinosa Less “huamanpinta”

Es una planta semileñosa de 1 a 1,5 metros de alto. El tallo muy

ramificado, densamente folioso. Las hojas de disposición uniformemente

alternas simples enteras de pecíolo corto de forma redondeada con borde

entero con una longitud de 1.5 mm de diámetro de color verde intenso y

brillante, con espinas axilares. Flores de color amarillo-anaranjado, con

anteras sagitadas, corolas bilabiadas, pero una de sus características más

sobresalientes es por la partidura del disco del capitulo. Inflorescencia en

cabezuela o capítulos rodeada de tres hileras de brácteas involucrales con

numerosas flores, sésiles, dispuestas en las axilas de las hojas 5.

Los capítulos femeninos con involucro cilíndrico y con brácteas

dispuestas más o menos en cinco series, las externas en forma

redondeadas y las internas angostamente redondas. Receptáculo cónico,

alveolado. Flores en escaso número con la corola algo filiforme. Aquenios

glabros con un disco anular en la parte superior y lateralmente. Papus de

color algo amarillento. Capítulos masculinos con involucro cilíndrico con

brácteas dispuestas en tres series, las externas e internas elípticas 5

estambres con los filamentos libres y soldados por las anteras (sinanterio),

receptáculo cónico alveolado de 1,5 mm de diámetro 6.

12
1.1.2. Clasificación Sistemática de la Especie

 DIVISIÓN: MAGNOLIOPHYTA

 CLASE: MAGNOLIOPSIDA

 SUBCLASE: ASTERIDAE

 ORDEN: ASTERALES

 FAMILIA: ASTERACEAE

 GENERO: Chuquiraga

 ESPECIE Chuquiraga spinosa Less

 Nombre vulgar: “huamanpinta”,

1.1.3. Ubicación Geográfica y Hábitat

La especie de la planta se ha encontrado en diferentes localidades de

Ayacucho como Quinua, Chiara, Vinchos; en la provincia de Cangallo en el

distrito de Totos, por encima de los 3,000 metros sobre el nivel del mar.

Habita en zonas escarpadas y pedregosas, se relaciona con algunas

especies arbustivas como el Gynoxis, Baccharis, etc. Su zona de vida es, el

bosque húmedo montano subtropical, también se le encuentra entre el límite

de la zona de vida ya mencionada y el páramo muy húmedo subandino

Subtropical.

13
1.1.4. Composición química y usos tradicionales.

La composición química de las hojas de Chuquiraga spinosa Less

“huamanpinta” contiene: alcaloides, triterpenos, esteroides, saponinas,

flavonoides, taninos, sesquiterpeno lactonas, aminoácidos y resinas. Tiene

además potasio, calcio, fósforo, azufre y silicio. En el uso popular se coloca

15 g de las hojas para un litro de agua, hervir por 3 a 5 minutos y se toma

una taza tres veces al día y se emplea como: Antiinflamatorio de las vías

urinarias, antiinflamatorio prostático, cicatrizante, antiséptico vaginal 6.

1.2 ANTECEDENTES DE INVESTIGACIÓN

R. Casado et al. (2011)7, demostró que el extracto acuoso y

metanólico al 50% de las partes aéreas de Chuquiraga spinosa presentó una

alta actividad antioxidante sin correlación entre la actividad antioxidante y el

total de compuestos polifenólicos. Así mismo el extracto metanólico al 50%

administrado por vía oral redujo significativamente (52,5%) el edema

subplantar inducido en la pata trasera en ratas. Este extracto, por

administración tópica, produjo una reducción de 88,07% del edema inducido

por el 12-O-tetradecanoilforbol-13-Acetato (TPA) en orejas de los ratones. El

extracto acuoso y metanólico al 50% fueron activos contra Cándida albicans

(MIC: 2,5 y 6,25 g, respectivamente) y el extracto acuoso mostró actividad

antifúngica contra Cándida cucumerinum (MIC: 2,5 g).

14
 H. Chávez et al. (2011)8estudiaron los metabolitos secundarios

bioactivos de Chuquiraga spinosa Lessing subsp. Huamanpinta Ezcurra”,

reportan que el extracto de acetato de etilo contenía los flavonoides: 5,5'-

dihidroxi-7,3'- dimetoxi-flavanona y 5-hidroxi- 7,4’-dimetoxiflavona, el

flavonoide quercetina y kampferol y del extracto etanólico se aisló el

flavonoide rutina y los flavonoides de tipo glicósido como quercetina 3-O-

rutinosido, kampferol 3-O- rutinosido y kampferol 3-O-glucosido. Los

flavonoides aislados del extracto de acetato de etilo y etanólico de

Chuquiraga spinosa lessing subsp “huamanpinta” son los responsables de la

actividad antiinflamatoria y analgésica reportadas previamente por los

autores.

M. Torres (2004)9, demostró la actividad antiinflamatoria del extracto

atomizado de la especie Chuquiraga spinosa lessing “qarisirwi” en Canis

familiaris, indicando que los metabolitos secundarios responsables de dicha

actividad serían los triterpenos y esteroides.

C. Contreras (2003)10, reportó que los extractos de Chuquiraga

spinosa Lessing, tienen actividad antiinflamatoria, el extracto acuoso

demostró mayor eficiencia farmacológica y que este extracto a la dosis de

200 mg/Kg, reporta mayor eficiencia antiinflamatoria.

15
 J. Arenas (2000)11, demostró la actividad diurética de la Chuquiraga

spinosa y concluyó que probablemente los responsables de dicha actividad

serían los flavonoides en acción sinérgica con las saponinas, fenoles y

taninos.

C. Sotelo (1998)12, estudió la “actividad antiinflamatoria de la

Chuquiraga spinosa “huamanpinta” en ratas y camundongos, empleando el

modelo experimental de inflamación producida por carragenina, demostró

una buena actividad antiinflamatoria e indica que es un mecanismo dosis

dependiente, de igual forma concluye que la fracción acuosa tiene mejor

actividad antiinflamatoria que la fracción etanólica y describe que ambas

fracciones poseen actividad antiedematogénica. La administración del

Extracto Bruto Hidroalcohólico (EBH) de huamanpinta (2000 mg/kg SC)

produjo lesiones de la mucosa gástrica similares a los producidos por la

indometacina, lo que sugiere un mecanismo de acción antiinflamatoria

mediante la inhibición de la síntesis de prostaglandinas.

1.3 SISTEMAS DE DEFENSA ANTIOXIDANTE

En un sistema biológico, un antioxidante es capaz de reaccionar con

radicales libres siendo entonces un terminador de cadena oxidativa. La

capacidad antioxidante de una sustancia o molécula se define como la

habilidad para inhibir la degradación oxidativa (por ejemplo,

lipoperoxidación). La capacidad antioxidante está determinada a su vez por:

a) reactividad química del antioxidante asociada a la actividad

16
antirradicalaria o estabilizadora de radicales libres; b) capacidad para

acceder al sitio de reacción y; c) estabilidad de los productos formados

después del proceso de estabilización de radicales libres 13.

Ante un incesante daño que ejercen los radicales libres en los sistemas vivos

la naturaleza ha brindado diferentes fuentes de protección que permiten

mediar este daño.

Estos sistemas, de acuerdo a su origen, pueden clasificarse como

endógenos y exógenos (Ver figura 01). Los sistemas de defensa

antioxidante endógeno consisten en una serie de elementos biológicos que

brindan protección ante la producción continua de radicales libres generados

por funciones celulares como la respiración y síntesis de ATP a nivel

mitocondrial; el sistema antioxidante endógeno, a su vez, se divide en

enzimático y no enzimático. El primero lo constituyen las enzimas

antioxidantes: Superóxido dismutasa, Catalasa, Glutatión peroxidasa,

glutatión reductasa, glutatión S-transferasa, entre las más importantes. El

segundo lo integran el glutatión, la coenzima Q y el ácido tioctico o lipoico. El

sistema de defensa antioxidante exógeno se forma por todos los elementos

provistos del medio ambiente (alimentos, plantas, etc.) que han sido

sometidos a estudios científicos y se les ha identificado actividad

antioxidante. Entre los más estudiados se encuentran la vitamina E, vitamina

C, β-carotenos y Polifenoles (flavonoides y taninos) 14.

17
 Licopenos, Cobre,
Cofactor Zinc, Hierro y
Manganeso.
Endógenos
Glutatión
Coenzima Q
ANTIOXIDANTES

Catalasa
Ácido tiótico Superóxidodismutasa
Glutatiónperoxidasa
Enzimas
Enzimas Glutatión reductasa,
Glutatión S-transferasa

Vitamina E
Vitamina C
Exógenos
Flavonoides
B-caroteno

Figura 01. Clasificación de los antioxidantes

1.4. FLAVONOIDES

Los flavonoides son compuestos naturales fenólicos que se

encuentran ampliamente distribuidos en las plantas, como en el té negro, el

café, la cocoa, la cerveza y el vino rojo; y sólo algunos se han detectado en

hongos y algas 15. Se les encuentra en forma libre también llamados

agliconas flavonoides, pero la mayoría de veces se les encuentra como

glicósidos, como sulfatos y algunas veces como dímeros y polímeros. Los

glicósidos pueden ser de dos clases con los carbohidratos ligados a través

de átomos de oxígeno es decir como O-glicósidos; o con los carbohidratos

18
ligados a través de enlaces C-C, es decir como C-glicósidos; los O-

glicósidos son los hallados comúnmente. Las antocianinas se encuentran

como sales en flores, frutos con coloraciones que van del color rojo hasta

violeta y el azul. (20)Los flavonoides pueden ser desde simples moléculas

fenólicas hasta compuestos muy polimerizados con pesos moleculares

superiores a los 30 000 Da 16.

Los flavonoides tienen una estructura química definida, son moléculas que

tienen dos anillos bencénicos unidos a través de una cadena de tres átomos

de carbono, y cada anillo bencénico tiene 6 átomos de carbono, se

denominan como compuestos C6-C3-C6 (difenilpropano) derivado del ácido

shiquímico y de 3 restos de acetato (Figura 02).

Figura. 02. Estructura básica de los flavonoides y sistema de numeración.

Los flavonoides se han clasificado en varias clases de acuerdo a las

variantes estructurales que presenta la cadena central C3. Tienen 13

subclases de flavonoides con un total de 5000 compuestos y están

agrupados en: Chalconas, flavonas, flavonoles, flavanonas, flavanonoles,

antocianidinas, catequinas, epicatequinas, auronas, isoflavonoides,

19
pterocarpanos, rotenoides, etc. Los flavonoides tienen propiedades

antioxidantes, antiinflamatorias, antimicrobianas, antialérgicas,

antiasmáticas, antitumorales, etc. Siendo la de mayor importancia la

propiedad antioxidante17.

La actividad antioxidante de los flavonoides resulta de una combinación de

sus propiedades quelatantes de hierro y secuestradoras de radicales libres

(RL). También se debe a la inhibición de oxidasas, como la lipoxigenasa

(LO), la ciclooxigenasa (CO), la mieloperoxidasa (MPO), la NADPH oxidasa

y la xantina oxidasa (XO); así se evita la generación de especies reactivas

derivados del oxígeno (EROs) in vivo, así como de hidroperóxidos orgánicos.

Los flavonoides inhiben enzimas involucradas indirectamente en los

procesos oxidativos, como la fosfolipasa A2 (FLA2), al mismo tiempo se

estimulan otras enzimas con propiedades antioxidantes como la catalasa

(CAT) y la superóxido dismutasa (SOD); así los flavonoides interfieren en las

reacciones de propagación de RL y en la formación del radical en sí 18.

Los flavonoides aumentan la disponibilidad de antioxidantes endógenos, así

como la actividad de enzimas antioxidantes; al mismo tiempo que son

capaces de inhibir enzimas involucradas en la generación de especies

reactivas derivadas del oxígeno (EROs)19.

1.5 DETERMINACIÓN DE CAPACIDAD ANTIOXIDANTE IN VITRO.

20
 Se han desarrollado un gran número de métodos hasta la actualidad

para determinar la posible actividad antioxidante de diversos extractos o

muestras. Siendo difícil determinar la capacidad antioxidante de una muestra

por medio de un solo método, por tal razón es necesario combinar varios.

Esto se debe a que los antioxidantes tienen diferentes mecanismos de

acción; pueden suprimir la generación de los primeros radicales que inician

el daño oxidativo, pueden capturar radicales libres, formar complejos, quelar

metales, reducir algunos compuestos, activar sistemas biológicos

antioxidantes. Ya que en un mismo extracto puede haber mezclas de

antioxidantes con diferentes mecanismos de acción, se pueden establecer

reacciones sinérgicas siendo necesario el análisis de los posibles

mecanismos de acción de todos los antioxidantes presentes en la muestra.

Se deben considerar otros aspectos al determinar la capacidad antioxidante

de los extractos vegetales, tales como las propiedades coloidales del

sustrato, el estado de oxidación, la localización del antioxidante en las

distintas fases, el tipo de sustrato oxidable, las interacciones con otros

compuestos, la composición del sistema, la naturaleza heterogénea y

heterofásica del sistema 20 .

Por las razones ya descritas los autores tienen la necesidad de combinar

más de un método para determinar la capacidad antioxidante in vitro 21.

Los ensayos in vitro sobre la capacidad antioxidante de extractos de plantas,

se deben completar con ensayos in vivo, así como con estudios sobre el

posible efecto pro oxidante de estos compuestos a dosis elevadas, ya que

21
en estos compuestos existe un delicado equilibrio entre actividad

antioxidante y pro oxidante.

Se debe de considerar en la determinación de la capacidad antioxidante in

vitro, las modificaciones hechas en cada uno de los métodos existentes; la

comparación entre resultados se debe realizar con precaución aún si se ha

realizado el mismo método de medida ya que puede haber sufrido cambios

en la manipulación, en la temperatura de la muestra o en el procesamiento,

en la metodología empleada en la extracción, etc. También se debe tener

cuenta que los resultados para un mismo método se expresan de múltiples

maneras, dificultándose su comparación 22.

1.5.1 Reacciones SET y reacciones HAT

Aunque, como se ha explicado, existen una gran cantidad de

mecanismos por los que los antioxidantes reaccionan con los radicales

libres, como en el caso de los polifenoles, que detienen el proceso en

cadena de oxidación lipídica (chain- breaking), esta reacción se puede llevar

a cabo por dos posibles vías: reacciones de transferencia de un átomo de H

(Hidrogen Atom Transfer, HAT) o de transferencia de un electrón (Single

Electron Transfer, SET), aspectos que se deben tener en cuenta al

seleccionar un método de medida de capacidad antioxidante, por lo que, a

continuación, se explicará brevemente en qué consiste cada uno de estos

dos mecanismos.

En las reacciones HAT, la reacción sería de este tipo, siendo X• el radical

libre y AH el antioxidante:

22
 X• + AH XH + A•

El nuevo radical formado es mucho más estable que el inicial.

Por el contrario, en las reacciones SET el antioxidante transfiere un electrón

para reducir un compuesto, incluyendo metales, carbonilos y radicales, y

serían reacciones de este tipo, siendo de nuevo X• el radical libre y AH el

antioxidante:

X•+ AH X + AH• +

AH• + H2O A + H3O+

X• + H3O+ XH + H2O

M (III) + AH AH+ + M(II)

Estas reacciones son también dependientes del pH. Son métodos muy

sensibles al ácido ascórbico y al ácido úrico, que juegan un papel importante

en el mantenimiento del status redox del plasma. Algunos elementos traza y

contaminantes (sobre todo metales) pueden interferir con estos métodos,

resultando en una alta variabilidad y una baja reproducibilidad y consistencia

de los resultados 23.

Las reacciones HAT vienen determinadas por la entalpía de disociación, de

manera que un compuesto que tuviera baja entalpia facilitaría la abstracción

del átomo de H. Así mismo, se ha observado que ciertos aspectos

estructurales, como la presencia de un grupo hidroxilo en posición orto o la

posible formación de enlaces intermoleculares entre distintos sustituyentes,

pueden contribuir a reducir la entalpía de disociación, facilitando la formación

de un radical estable. Por el contrario, las reacciones SET dependen del

potencial de ionización.

23
A continuación, se describen tres de los métodos utilizados para la

determinación de la capacidad antioxidante, indicando el tipo de reacción

que se lleva a cabo en aquellos24.

1.5.2 Método del Poder Antioxidante de Reducción Férrica (FRAP).

Se trata de una reacción SET, que se basa en la reducción del

complejo de la tripiridiltriazina férrica al complejo ferroso por un antioxidante

en medio ácido. Esta reacción produce un cambio de color que es

monitorizado midiendo la absorbancia a 593 nm durante 4 minutos, según el

método original, aunque este tiempo fue posteriormente ampliado hasta 30

minutos, ya que a los 4 minutos muchos compuestos todavía no habían

acabado de reaccionar. Los resultados se expresan en equivalente Trolox

(µmol Trolox/g o µmol Trolox/L), tras elaborar una curva de calibración de

este compuesto, un análogo hidrosoluble de la vitamina E muy utilizado en la

expresión de resultados de capacidad antioxidante.

La Figura 03 muestra la reacción que tiene lugar en este método de medida

de capacidad antioxidante.

Figura 03. Mecanismo de reacción en el método FRAP

Se han planteado diversas críticas a este método:


Se lleva a cabo a un pH no fisiológico.

24
 
Como el potencial de reducción del Fe (III) a Fe (II) es de 0,77

V, cualquier compuesto con un potencial redox inferior, podría

reducir al Fe (III), sobreestimando el valor de FRAP.


A 593 nm pueden absorber otros compuestos, como la

bilirrubina oxidada, que produce biliverdina, aumentando el

valor de FRAP.


Hay compuestos como el ácido ascórbico que, además de

reducir el ion férrico a ferroso, pueden reaccionar con éste

último para generar nuevos radicales libres. Por ejemplo, en

fluidos biológicos, el Fe (II) puede interaccionar con agua

oxigenada para producir radical hidroxilo.


El FRAP no implica a ningún prooxidante ni a ningún sustrato

oxidable. Igual que no todos los reductores que transforman el

ion ferroso en férrico no son antioxidantes, hay antioxidantes

que no son capaces de llevar a cabo esta reacción, como es el

caso del glutatión, un importante antioxidante natural que da

resultados negativos en el FRAP 25.

1.5.3 Método reacción con el radical 2,2’-azino-bis-(3-

etilbenztiazolin-6-sulfonato de amonio) (ABTS).

Se trata de una reacción SET y HAT, en el método ABTS (ácido 2,2´-

azino-bis (3-etilbenzotiazolin)-6-sulfónico) el radical tiene que ser generado

tras una reacción que puede ser química (persulfato potasio), enzimática

(peroxidasa, mioglobulina) (ver figura 04 y 05), o también electroquímica.

25
Con este método, se puede medir la actividad de compuestos de naturaleza

tanto hidrofílica como lipofílica. El cromóforo ABTS presenta un color

azul/verde con máximo de absorción a λ 342 nm, el cual es soluble tanto en

agua como en disolventes orgánicos y químicamente estable. El radical

ABTS•+ una vez generado por medio de enzimas o químicamente pasa a

presentar nuevas características con máximos de absorción a λ (414, 645,

734 y 815 nm), pero se mide a una longitud de onda λ 734 nm. Una de las

principales ventajas del uso de este radical es que tiene la capacidad de

solubilizarse en medios acuosos y en medios orgánicos. El radical ABTS •+ es

más indicado para ensayos de compuestos coloreados, como el caso de los

compuestos fenólicos, por presentar absorción máxima próxima a la región

infrarroja (λ 734 nm) reduciendo posibilidades de interferencias de

compuestos coloreados que absorben en la región del visible o compuestos

resultantes de reacción secundaria26.

Persulfato de Potasio

-e *

Figura 04. Formación

del radical ABTS

26
Figura 05. Mecanismo de estabilización del catión radical ABTS• (arriba), reacción del

catión radical ABTS• con el trolox (centro) y mecanismo de estabilización del radical

formado en el trolox (abajo)

1.5.4 Método de inhibición frente al radical libre 2,2-Difenil-1-

picrilhidraizil (DPPH)

El método del DPPH se basa en la reducción del radical DPPH • por

los antioxidantes de la muestra. El radical es estable y tiene una coloración

púrpura que se pierde progresivamente cuando se añade la muestra

conteniendo sustancias antioxidantes (ver figura 06). La decoloración del

radical se determina a una λ de 515 nm hasta alcanzar el equilibrio. Entre las

ventajas de usar este método, se tiene que el ensayo DPPH es un método

rápido, sencillo y que no requiere de un equipamiento sofisticado. La

desventaja que tiene este método es que sólo puede disolverse en medio

orgánico y en algunos casos la interpretación resulta complicada, ya que

27
algunos antioxidantes pueden causar interferencias si poseen un espectro

de absorción similar al DPPH 27.

Figura 06. Reducción del radical libre 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (Brands &Williams,

1995)

1.5.5 Trolox.

Es un antioxidante como la vitamina E y se utiliza en aplicaciones

biológicas o bioquímicas para reducir el estrés oxidativo o daño celular.

El compuesto ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromo-2-carboxílico, Trolox

(ver figura 07), es un análogo soluble en agua de la vitamina E, que se

puede comparar con varios antioxidantes comerciales.

Las reacciones entre el Trolox y varios radicales libres oxidantes incluyendo

los radicales peroxi y varios radicales hidroxilo se examinaron mediante el

uso de la técnica de pulso-radiólisis, demostrando que el Trolox puede

someterse a reacciones rápidas de transferencia de electrones, así como

los procesos de transferencia de hidrógeno; el radical fenoxilo resultante

demuestra ser relativamente estable, en común con el radical fenoxi

28
derivado de la vitamina E. Las reacciones entre el Trolox (radical fenoxilo) y

una variedad de compuestos reductores biológicamente pertinentes se

examinaron mediante el uso de radiolisis pulsos. Los resultados evidencian

que el Trolox (radical fenoxilo) se repara fácilmente por el ascorbato y ciertos

tioles, pero no por urato, NADH o galato de propilo. Las pruebas evidencian

que el Trolox repara proteínas que se han oxidado por radicales libres28.

Figura 07. Fórmula estructural del trolox

CAPÍTULO II

29
 MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 MATERIALES

2.1.1 Material biológico:

 La planta entera de “huamanpinta”(Chuquiraga spinosa Less)

2.1.2 Material Químico botánico:

 Extracto etanólico seco de hojas y flores de Chuquiraga spinosa

Less.

2.1.3 Material en General:

 Material de vidrio

 Pipetas volumétricas AS de 1, 3, 5 ,10 mL

 Pipetas graduadas de 1, 3, 5, 10 mL

 Matraz volumétrico de 10, 25, 50, 100 mL

 Matraz de Erlenmeyer 100,250, 1000 mL.

 Micropipetas calibradas de 10, 100, 1000 uL

 Tubos de ensayo de 20 mL.

 Fiola de 100 mL

 Gradillas

 Frascos de vidrio color ámbar

 Jeringas

2.1.4 Sales químicas y reactivos:

 1, 1-difenil-2-picril-hidrazil (DPPH) (Sigma®)

30
  2,2’-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfonato de amonio) (ABTS).

Reactivo ABTS (Sigma ®)

 Persulfato de potasio (Sigma® )

 Trolox ®

 Reactivo de Folin Ciocalteu

 Reactivo de Liebermann-Burchard

 Cloruro férrico (Merck®)

 Reactivo de Shinoda

 Hidróxido de sodio (Merck®)

 Ácido clorhídrico (Merck®)

 Hidróxido de amonio (Merck®)

 Reactivo de Dragendorff

 Reactivo de Mayer

 Metanol (Fisher®)

 Etanol (Fisher®)

 Cloroformo (Merck®)

 Silicagel G60 (Merck®)

 Tricloruro Férrico ( JT Baker ®)

2.1.5 Equipos

 Rotaevaporador (Büchi ®)

 Estufa (Memmert®)

 Horno de aire circulante (Binder ®)

31
  Centrífuga (internacional Equipment Co®)

 Balanzas analíticas sensibles a 1 g (Metler Toledo ®); 0.1 y

0.00001 g (Bennet®)

 Espectrofotómetro UV-VIS (UNICO 2001 ®)

 Agitador Vortex (Scientific ®)

2.2 METODOLOGÍA ANALÍTÍCA

2.2.1 ESTUDIO FITOQUÍMICO.

Recolección, selección, secado y conservación de la muestra

La planta entera de Chuquiraga spinosa Less “huamanpinta” fue colectada

en el distrito de Vinchos – Huamanga – Ayacucho a una altitud de 3900

msnm, en el mes de marzo del 2014. Posteriormente 500 g de hojas y 250 g

de flores en buen estado fueron colocados en bolsas de papel craft y

trasladados al laboratorio de Química General de la Facultad de Farmacia y

Bioquímica de la Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica, para su

desecación (Anexo 2).

Clasificación Taxonómica de la especie vegetal.

La muestra vegetal fue determinada botánicamente en el Museo de Historia

Natural, de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima- Perú

(Anexo 1).

32
 Obtención del extracto etanólico de hojas y flores de Chuquiraga

spinosa Less “huamanpinta”

500 g de hojas secas y 250 g de flores fueron molidas por separado en un

molino de cuchillas, maceradas con 2,5 L de etanol al 96 % durante siete

días con agitación diaria durante cinco minutos. El filtrado se concentró en

una estufa controlada con aire circulante a 40 ºC (para obtener los extractos

etanólicos, en el que se realizó los ensayos fisicoquímicos (marcha

fitoquímica), y químicos (antioxidante in vitro), así mismo el extracto se

conservó en un frasco ámbar tapado herméticamente en refrigeración

(Anexo 3 y 4).

Screening Fitoquímico del extracto etanólico (Trease E, Evans

WC. 2002) 29.

Se pesaron 100 mg de extracto etanólico total de hojas y flores de

“huamanpinta”, para luego disolverlas en el solvente adecuado dependiendo

del tipo de identificación fítoquímica y se realizaron las reacciones de

identificación de metabolitos secundarios, para reconocer los metabolitos

secundarios presentes en el extracto mediante las siguientes reacciones:

cambios de coloración o formación de precipitados.

La marcha Fitoquímica se realizó en el Laboratorio de Química General de la

Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional “San Luis

Gonzaga” de Ica - Perú.

33
1. Determinación de Saponinas:

Prueba de la espuma:

A una solución acuosa de la muestra, se le somete a una

agitación vigorosa durante 30 segundos. La formación de una

espuma estable durante 10 minutos confirma la presencia de

saponinas.

2. Determinación de Flavonoides:

Reacción de Shinoda:

En un tubo de ensayo colocamos 5 mg de la muestra y le

añadimos 3 gotas del ácido clorhídrico concentrado y limaduras

de magnesio metálico. Si se observa un intenso burbujeo y

coloración rojo o naranja, de color intenso luego de 10 minutos

indica la presencia de flavonoides.

3. Determinación de Compuestos Fenólicos:

Reacción con Cloruro Férrico (FeCl3)

A 5mg de muestra se le agrega 5 gotas del reactivo,

instantáneamente la solución debe tomar un color verde oscuro

casi negro, lo que indica la presencia de compuestos fenólicos.

34
4. Determinación de Taninos

Reacción de la Gelatina

A 5mg de la muestra se le agregó 5 gotas del reactivo de la

gelatina al 0,1 %; en un principio si se observa una sustancia

en forma de nube en la solución y luego queda en el fondo un

precipitado color blanco, confirma la presencia de taninos.

5. Determinación de Alcaloides

Reacción de Dragendorff

A 5 mg de la muestra se le adicionó 5 gotas del reactivo a una

solución acida alcaloide se observa la aparición de un

precipitado que fue del color anaranjado, que confirma la

presencia de alcaloides.

Reacción de Mayer

A 5 mg de la muestra se adicionó un exceso del reactivo, si se

observa la aparición de un precipitado blanco, confirma la

presencia de alcaloides.

Reacción de Wagner

A 5 mg de la muestra se adicionó 5 gotas del reactivo si se

observa la formación de un precipitado marón, confirma la

presencia de alcaloides.

35
 6. Determinación de Quinonas

Reacción de Bornträger

A 5 mg de la muestra se le adicionó 5 gotas del reactivo si se

observa la formación de un precipitado pardo negruzco, confirma

la presencia del metabolito.

7. Determinación de triterpeno y/o esteroides

Reacción de Lieberman-Burchard

A 5 mg de la muestra se adicionó 5 gotas del reactivo si se

observa que la muestra se torna de un color azul, se confirma la

presencia del metabolito.

8. Determinación de los grupos Aminos Libres

Reacción de la Ninhidrina

A 5 mg de la muestra se adicionó 5 gotas del reactivo si se

observa que la muestra se torna de un color azul, este indica la

presencia del metabolito.

2.2.2 DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS 30

Se utilizó el método de Folin-Ciocalteu descrito por García et al.

(2012), para la determinación de Compuestos Fenólicos presentes

en el extracto etanólico de hojas y flores.

El Reactivo Folin-Ciocalteu el cual es una mezcla de ácido

fosfotúngstico H3PW 12O10 y ácido fosfomolíbdico H3PMo12O14. Se

36
produce una reacción óxido-reducción entre el reactivo de Folin-

Ciocalteu (se reduce) y los polifenoles (se oxidan).

Estos compuestos se reducen al interaccionar con los compuestos

fenólicos dando origen a óxidos de coloración azul (óxidos de

wolframio y molibdeno), los cuales exhiben una amplia absorción de

luz, con un máximo a 760 nm.

Se utilizó también carbonato de sodio (Na2CO3) al 20% y una solución

stock de ácido gálico 400 ug/mL.

a) Preparación de los reactivos:

Reactivo de Folin Ciocalteu (FC): Diluir 1/3 en agua para la

reacción.

Carbonato de sodio (Na2CO3) al 20%: Se tomó 4g de carbonato

de sodio y se diluyó en 20 mL de agua destilada.

Solución stock de ácido gálico (AG) 400 ug/mL: Se tomó 4mg

de ácido gálico y se diluyó en 10mL de agua destilada.

b) Preparación del estándar de polifenoles: ácido gálico 100

ug/mL

Se tomó 2mL de la solución de ácido gálico (400 ug/mL) y se

diluyó en 8mL de agua destilada, para obtener la concentración de

ácido gálico de 100ug/mL. Luego se procedió a seguir los pasos

de la tabla 1.

37
 Tabla 01.- Preparación del estándar de polifenoles.

Acido gálico Agua Volumen

CC
Tubo (100 ug/mL) destilada final
(ug/mL)
uL uL uL
1 100 900 1000 10
2 300 700 1000 30
3 500 500 1000 50
4 750 250 1000 75

Fuente: Datos de los autores.

c) Reacciones

Reacción para el Ácido gálico:

 Se tomó 300 µL de cada uno de los tubos de ensayo que

contenían el estándar de ácido gálico obtenido en el paso anterior,

con la ayuda de la micropipeta se colocó de forma ordenada en 4

tubos de ensayo rotulados.

 Luego a los 4 tubos que contenían los 300uL del estándar se

adicionó 450 uL del reactivo de Foiln diluido y se dejó reposar en

oscuridad por 5 minutos.

 Se le adicionó 450uL de carbonato de sodio a cada uno de los 4

tubos de ensayo y finalmente se le adicionó 1800 uL de agua

destilada y se llevó a reposar en un ambiente oscuro por 30

minutos, para después de ese tiempo ser llevado al

espectrofotómetro a una longitud de onda de 760 nm.

38
 Tabla 02. Batería de reacción final del estándar de polifenoles.

Acido
Reactivo Na2CO3 Agua
gálico VF CF
Tubo de Folin 20% destilada
(100 ug/mL) (mL) (ug/mL)
(uL) (uL) (uL)
uL
0 - 450 450 2100 3 0
1 300 450 450 1800 3 1
2 300 450 450 1800 3 3
3 300 450 450 1800 3 5
4 300 450 450 1800 3 7,5
VF: volumen final, CF: concentración final.
Fuente: Datos de los autores.

d) Preparación de la muestra:

Solución madre del extracto etanólico de hojas y flores: Se pesó

50,0 mg del extracto seco de hojas y 10,0 mg del extracto etanólico

de flores de Chuquiraga spinosa “huamanpinta. Se diluyó en 5 mL

de metanol.

Dilución de la muestra madre del extracto etanólico de hojas y

flores: Se tomó 0,1 mL de la solución madre diluida en metanol y se

le agregó 5,9 ml de agua destilada.

Luego se procedió a realizar las reacciones:

 Se tomó 300uL de la muestra diluida y se colocó en 3 tubos de

ensayo respectivamente.

 Luego se adicionó 450uL del reactivo de Folin a cada uno de los

tubos de ensayo, se dejó reposar en oscuridad por 5 minutos.

39
  Se adicionó 450 uL de carbonato de sodio a cada tubo de

ensayo, y finalmente se le adicionó 1800 uL de agua destilada.

 Se dejó reposar 30 minutos en oscuridad, para ser llevado al

espectrofotómetro para leerlo a una longitud de onda de 760 nm.

50 mg de extracto etanólico de hojas 10 mg de extracto etanólico de flores

Se disolvió en 5 mL de metanol

Se tomó 0,1 mL y se llevo a volumen final de 6mL

(para que las absorbancias estén dentro de la curva del

ácido gálico

Se distribuye en Se distribuye en
tres tubos de tres tubos de
ensayos. ensayos.

(Extracto etanólico (Extracto etanólico

de hojas de flores)

Se hace la reacción con el

reactivo de Folin, carbonato de
sodio y se completa con el agua
destilada para luego leerlos a
una longitud de onda de 765
nm.

40
2.3EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE IN VITRO.

2.3.1. Método de inhibición frente al radical libre 1,1-Difenil-2-

picrilhidracilo (DPPH) con modificaciones31.

El método empleado en este trabajo es el propuesto por Brand-

Williams et al, 1995; con algunas modificaciones. Dicho radical tiene

un electrón desapareado y presenta un color violeta el cual cambia a

amarillo pálido en presencia de una sustancia antioxidante, por

diferencia de absorbancia se determina el porcentaje de captación de

radical libre DPPH, ésta reacción se midió con la ayuda de un

espectrofotómetro UV/VIS.

Se encuentra expresado como IC50 (μg de extracto etanólico /mL).

Este valor corresponde a la concentración del extracto que reduce en

un 50% la absorbancia de una solución metanólica de DPPH a 517

nm con una absorbancia inicial de 0,600.

Se usó como estándar el reactivo TROLOX (6-hidroxi-2, 5, 7,8-

tetramethylchroman-2carboxilic acid) para obtener la capacidad

antioxidante equivalente a TROLOX.

Preparación de las soluciones:

a) Preparación del radical DPPH:

Se preparó una solución a 0,1 mM de DPPH, pesando 2,2 mg de

DPPH, en un matraz aforado previamente tarado y se disolvió en 100

mL de etanol, luego se llevó a comprobar que la absorbancia a 517

41
nm esté ente 0,6 y 0.7. El matraz aforado se cubrió con papel de

aluminio para la protección frente a la luz.

b) Preparación del Trolox:

Se preparó una solución stock 1 mM, para ello se pesó 2.4 mg ácido

6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromo-2-carboxílico 97% (Trolox), se

disolvió en 1000uL de etanol y se le agrego 9000 uL de agua

destilada.

c) Reacción del Trolox para establecer la curva de calibración:

Dela solución preparada de Trolox se prepararon 5 diluciones en

tubos de ensayo por triplicado según el diagrama1, respectivamente

por cada uno de las concentraciones, para ello se hizo reaccionar 300

uL de trolox y 2700 uL de DPPH. Se mantuvo en la oscuridad por 30

minutos a temperatura ambiente, para después realizar la lectura en

un espectrofotómetro UV/VIS a 517 nm.

Dilución 1 (0,5 nM): (1 mL de Solución 1mM + 1 mL de agua destilada.

Dilución 2 (0,25 mM): (1 mL de Solución 1+ 1 mL de agua destilada.

Dilución 3 (0,125 mM) : (1 mL de Solución 2 + 1 mL de agua destilada.

Dilución 4 (0,0625 mM) : (1 mL de Solución 3 + 1 mL de agua destilada.

Dilución 5 (0,0312 mM) : (1 mL de Solución 4 + 1 mL de agua destilada.

Diagrama 1. Dilución del estándar de trolox.

42
Tabla 03. Concentraciones finales del estándar de trolox en la reacción

TUBO CC de trolox Volumen Volumen de CF CF

(mM) de trolox DPPH (mM) (µM)
uL uL
1 0.5 300 2700 0.05 50
2 0.25 300 2700 0.025 25
3 0.125 300 2700 0.0125 12.5
4 0.0625 300 2700 0.00625 6.25
5 0.03125 300 2700 0.003125 3.125
VF: volumen final, CF: concentración final.
Fuente: Datos de los autores.

a) Reacción de la muestra:

Determinación de la CI50:

 Extracto etanólico de hojas: Se pesó 6 mg de extracto

etanólico seco de hojas Chuquiraga spinosa “huamanpinta”

y se diluyó en 10 mL de metanol (600 ug/mL)

Dilución 1 (300 ug/mL): (1 mL de Solución 600 ug/mL + 1 mL de agua destilada.

Dilución 2 (150 ug/mL): (1 mL de Solución 1+ 1 mL de agua destilada.

Dilución 3 (75 ug/mL : (1 mL de Solución 2 + 1 mL de agua destilada.

Dilución 4 (37,5 ug/mL) : (1 mL de Solución 3 + 1 mL de agua destilada.

Dilución 5 (18,8 ug/mL) : (1 mL de Solución 4 + 1 mL de agua destilada.

Diagrama 2. Dilución del extracto etanólico de hojas.

43
  Extracto etanólico de flores: Se pesó 2 mg de extracto

etanólico seco de flores de Chuquiraga spinosa

“huamanpinta” y se diluyó en 10 mL de metanol (200 ug/mL)

Dilución 1 (100 ug/mL): (1 mL de Solución 200 ug/mL + 1 mL de agua destilada.

Dilución 2 (50 ug/mL): (1 mL de Solución 1+ 1 mL de agua destilada.

Dilución 3 (25 ug/mL : (1 mL de Solución 2 + 1 mL de agua destilada.

Dilución 4 (12,5 ug/mL) : (1 mL de Solución 3 + 1 mL de agua destilada.

Dilución 5 (6,25 ug/mL) : (1 mL de Solución 4 + 1 mL de agua destilada.

Diagrama 3. Dilución del extracto etanólico de flores.

Se tomó 300 uL de muestra de cada uno de los diferentes extractos y

se hizo reaccionar con 2700 uL de DPPH.

Se mantuvo en la oscuridad por 30 minutos a temperatura ambiente,

para después realizar la lectura en un espectrofotómetro UV/VIS a

517 nm.

44
 Tabla 04. Batería de reacción del extracto etanólico de hojas de
huamanpinta
TUBO Muestra DPPH VF CC de muestra CF en tubo
uL uL mL ug/mL ug/mL
1 300 2700 3 300 30
2 300 2700 3 150 15
3 300 2700 3 75 7.5
4 300 2700 3 37.5 3.75
5 300 2700 3 18.75 1.875
6 300 2700 3 0 0

VF: volumen final, CF: concentración final.

Fuente: Datos de los autores.

Tabla 05. Batería de reacción del extracto etanólico de flores de

huamanpinta.
TUBO Muestra DPPH VF CC de muestra CF en tubo
uL uL mL ug/mL ug/mL
1 300 2700 3 100 10
2 300 2700 3 50 5
3 300 2700 3 25 2.5
4 300 2700 3 12.5 1.25
5 300 2700 3 6.25 0.625
6 300 2700 3 0 0

VF: volumen final, CF: concentración final.

Fuente: Datos de los autores.

45
2.3.2 Método reacción con el radical 2,2’-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-

sulfonato de amonio) (ABTS) 32.

En este método, la generación del radical ABTS• se produce por

medio químico mediante la adición de persulfato de potasio antes de la

adición de la muestra, lo que evita que los componentes de la misma pueda

reaccionar con el reactivo, otra ventaja es que se trabaja a pH fisiológico (pH

= 7,1), a una temperatura de 37 °C simulando las condiciones fisiológicas.

Para comenzar el análisis es necesario preparar el reactivo de trabajo el cual

debe tener una concentración de ABTS• de 7 mM y se procede de la

siguiente manera:

Se pesan 0,0154 g de la sal amónica cristalizada de ABTS y se disuelve en

4 mL de agua ultra pura, luego se adiciona 0,0027 g de persulfato de potasio

(K2S2O8) y se deja agitando por espacio de media hora envuelta en papel

aluminio protegido de la luz, durante 12 a 18 horas. Transcurrido el tiempo

correspondiente se toma una alícuota de 1 mL y se adiciona 70 mL de agua

destilada y se mide la absorbancia a 734 nm la absorbancia el cual debe

estar entre 0,7 ± 0,02.

Reacciones:

A) Reacción del estándar trolox con el radical ABTS: De la solución

preparada de Trolox 1 mM se preparó en tubos de ensayo una serie de

diluciones según se detalla a continuación:

46
 Dilución 1 (0,5 nM): (1 mL de Solución 1mM + 1 mL de agua destilada.

Dilución 2 (0,25 mM): (1 mL de Solución 1+ 1 mL de agua destilada.

Dilución 3 (0,125 mM) : (1 mL de Solución 2 + 1 mL de agua destilada.

Dilución 4 (0,0625 mM) : (1 mL de Solución 3 + 1 mL de agua destilada.

Dilución 5 (0,0312 mM) : (1 mL de Solución 4 + 1 mL de agua destilada.

Diagrama 4. Dilución del estándar de trolox para el ensayo ABTS.

Tabla 06. Batería de reacción del trolox frente al radical ABTS

CC de
TROLOX ABTS VF CF en tubo CF en tubo
TUBO trolox
(uL) (uL) uL (mM) (uM)
(mM)
1 0.5 100 1900 2000 0.025 25
2 0.25 100 1900 2000 0.0125 12.5
3 0.125 100 1900 2000 0.00625 6.25
4 0.0625 100 1900 2000 0.003125 3.12
5 0.03125 100 1900 2000 0.001563 1.5
6 0 100 1900 2000 0 0
VF: volumen final, CF: concentración final.
Fuente: Datos de los autores.

B) Reacción dela muestra: El extracto etanólico de hojas y flores

fueron diluidas en metanol y se procedió a realizar la reacción por

triplicado, leyendo a una longitud de onda de 734 nm y se determinó la

capacidad antioxidante equivalente a trolox (TEAC-ABTS)

47
 Tabla 07. Batería de reacción del extracto etanólico de hojas y

flores frente al radical ABTS

Batería de reacción del extracto etanólico de hojas y flores de huamanpinta

TUBO Muestra ABTS Volumen final
uL uL mL
1 300 2700 3
2 300 2700 3
3 300 2700 3

VF: volumen final, CF: concentración final.

Fuente: Datos de los autores.

48
 CAPÍTULO III

RESULTADOSY DISCUSIÓN

3.1 ESTUDIO FITOQUÍMICO

3.1.2 PORCENTAJE DE RENDIMIENTO DEL EXTRACTO ETANÓLICO

SECO DE LA OBTENCIÓN DEL EXTRACTO ETANÓLICO

El porcentaje de rendimiento del extracto etanólico seco de hojas

(%EES) fue de 10%. Este resultado fue obtenido con la siguiente

expresión:

Peso final del extracto seco

%EES= X 100
Peso inicial de la muestra seca

50g
%EES= X 100
500 g

%EES hojas= 10 %

El porcentaje de rendimiento del extracto etanólico seco de flores

(%EES) fue de 8,8%. Este resultado fue obtenido con la siguiente

expresión:

Peso final del extracto seco

%EES= X 100
Peso inicial de la muestra seca

49
 22 g
%EES= X 100
250 g

%EES flores= 8,8 %

3.1.3 ANÁLISIS FITOQUÍMICO CUALITATIVO DEL EXTRACTO

ETANÓLICO

Tabla 08. Prueba preliminar cualitativa de los metabolitos secundarios

del extracto etanólico de hojas Chuquiraga spinosa Less.
“huamanpinta”
Prueba de caracterización Resultado Metabolito secundario
Reacción de la NINHIDRINA (+) Grupos aminos libres
Reacción de la GELATINA (+) Taninos
Reacción con CLORURO (+) Compuestos Fenólicos
FERRICO (FeCl3)
Reacción de (+) Alcaloides
DRAGENDÖRFF
Reacción de WAGNER (+) Alcaloides
Reacción MAYER (+) Alcaloides
Reacción de SHINODA (+) Flavonoides
Reacción de BORNTRAGER (-) Quinonas
Reacción de LIEBERMAN- (+) Triterpeno y/o esteroides
BURCHARD
Prueba de la ESPUMA (-) Saponinas
(-) = Ausencia; (+) = Presencia

Fuente: Datos de los autores.

50
 Tabla 09. Prueba preliminar cualitativa de los metabolitos secundarios
del extracto etanólico de flores de Chuquiraga spinosa Less
“huamanpinta”
Prueba de caracterización Resultado Metabolito secundario
Reacción de la NINHIDRINA (+) Grupos aminos libres
Reacción de la GELATINA (+) Taninos
Reacción con CLORURO (+) Compuestos Fenólicos
FERRICO (FeCl3)
Reacción de DRAGENDÖRFF (+) Alcaloides
Reacción de WAGNER (+) Alcaloides
Reacción MAYER (+) Alcaloides
Reacción de SHINODA (+) Flavonoides
Reacción de BORNTRAGER (-) Quinonas
Reacción de LIEBERMAN- (+) Triterpeno y/o
BURCHARD esteroides
Prueba de la ESPUMA (-) Saponinas
(-) = Ausencia; (+) = Presencia

Fuente: Datos de los autores.

3.2 CUANTIFICACIÓN DE POLIFENOLES TOTALES PRESENTES EN

EL EXTRACTO ETANÓLICO DE HOJAS Y FLORES Chuquiraga
spinosa Less “huamanpinta”.

Desarrollo de la curva de calibración con el ácido gálico:

0.800
0.700
Absorbancia 760 nm

0.600
0.500
0.400
y = 0.0709x + 0.2104
0.300 R² = 0.9998
0.200
0.100
0.000
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Concentración de Acido gálico (ug/mL)

Figura 08. Curva de calibración del ácido gálico (AG)

51
Tabla 10. Determinación del contenido de polifenoles totales en el

extracto etanólico de hojas de Chuquiraga spinosa Less.

“huamanpinta”.

Ecuación de la recta del estándar ácido gálico: y = 0,0709X+0.2104

Peso de muestra 50 mg
0,510 0,525 0,515
Absorbancia de la muestra
60 60 60
Factor de dilución (FD)
ug EAG 4,22 4,43 4,30
ug EAG X FD 253,2 265,8 258,0
(ug EAG X FD)/1000 0,2532 0,2658 0,258
5 mg/mL 5mg/mL 5 mg/mL
mg de extracto /mL
mgEAG /g extracto 50,64 53,16 51,60
mgEAG/g extracto 51,8 ±1,27
Fórmula: [[[[ABS-0,2104/0,0709] x FD] / 1000 ] / 5mg/mL] X 1000

mgEAG/g de extracto: miligramos equivalentes al ácido gálico por gramo de extracto.

Fuente: Datos de los autores.

52
Tabla 11. Determinación del contenido de polifenoles totales en el

extracto etanólico de flores de Chuquiraga spinosa Less.

Ecuación de la recta del estándar ácido gálico: y= 0.0709X+0.2104

10 mg
Peso de muestra

0,710 0,715 0,715

Absorbancia de la muestra

60 60 60
Factor de dilución (FD)

ug EAG 7,04 7,11 7,11

ug EAG X FD 704 711 711

(ug EAG X FD)/1000 0,704 0,711 0,711

2 mg/mL 2 mg/mL 2 mg/mL

mg de extracto /mL

mgEAG /g extracto 352 355,5 355,0

mgEAG/g extracto 354,2 ± 1,9

Fórmula: [[[[ABS-0,2104/0,0709] x FD] / 1000 ] / 2mg/mL] X 1000

mgEAG/g: miligramos equivalentes al ácido gálico por gramo de extracto.

Fuente: Datos de los autores.

53
3.3 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE IN VITRO
FRENTE AL RADICAL DPPH DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE
Chuquiraga spinosa Less “Huamanpinta”.

El extracto etanólico de hojas y flores de Chuquiraga spinosa Less

“huamanpinta” se determinó mediante el ensayo de captación del

radical DPPH según Brand y Williams.

Tabla 12. Absorbancias promedio del trolox frente al radical

DPPH
TUBO CC de CF en tubo CC (µM) PROM
trolox ABS
1 0.5 0.05 50 0.075
2 0.25 0.025 25 0.32
3 0.125 0.0125 12.5 0.45
4 0.0625 0.00625 6.25 0.51
5 0.03125 0.003125 3.125 0.585
6 0 0 0 0.62
V
VF: volumen final, CF: concentración final.
Fuente: Datos de los autores.

0.7

0.6
Absorbancia leida a 517 nm

0.5 y = -0.0107x + 0.5999

0.4 R² = 0.9913

0.3

0.2 CI50 = 27.09 µmol/L

0.1

0
0 10 20 30 40 50 60
Concentración de Trolox (µmol/L)

Figura 09. Determinación de la concentración inhibitoria media (CI50) del

Trolox

54
 Tabla 13. Absorbancias promedio del extracto etanólico de
hojas de huamanpinta frente al radical DPPH
TUBO CF de muestra CF en tubo PROM
(µg/mL) (µg/mL) ABS
1 300 30 0.063

2 150 15 0.28

3 75 7.5 0.392
4 37.5 3.75 0.472

5 18.75 1.875 0.54

6 0 0 0.6

VF: volumen final, CF: concentración final.

Fuente: Datos de los autores.

0.7

0.6
Absorbancia leida a 517 nm

0.5
y = -0.0172x + 0.5576
0.4 R² = 0.9759

0.3

0.2
CI50 = 14,98µg/mL
0.1

0
0 5 10 15 20 25 30 35
Concentración de extracto etanolico de hojas de huamanpinta (ug/mL)

Figura 10. Determinación dela CI50 del extracto etanólico de hojas de

Chuquiraga spinosa Less

55
 Tabla 14. Absorbancias promedio del extracto etanólico de flores
de huamanpinta frente al radical DPPH
TUBO CC de muestra CF en tubo PROM
µg/mL µg/mL ABS
1 100 10 0.102

2 50 5 0.326

3 25 2.5 0.452

4 12.5 1.25 0.51

5 6.25 0.625 0.58

6 0 0 0.612

VF: volumen final, CF: concentración final.

Fuente: Datos de los autores.

0.7

0.6
Absorbancia leida a 517 nm

0.5 y = -0.0504x + 0.593

R² = 0.9905
0.4

0.3

0.2 CI50 = 5.69µg/mL

0.1

0
0 2 4 6 8 10 12
Concentración de extracto etanólico de flores de huamanpinta (µg/mL)

Figura 11. Determinación dela CI50 del extracto etanólico de flores Chuquiraga
spinosa

56
3.4 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE IN VITRO

FRENTE AL RADICAL ABTS DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE

Chuquiraga spinosa Less “Huamanpinta”.

Tabla 15. Curva de calibración del estándar trolox frente al radical

ABTS

TUBO CF de trolox CF (µM) PROM

(mM) ABS
1 0.025 25 0.028
2 0.0125 12.5 0.32
3 0.00625 6.25 0.496
4 0.003125 3.12 0.57
5 0.001563 1.5 0.645
6 0 0 0.71
VF: volumen final, CF: concentración final.
Fuente: Datos de los autores.

0.8
0.7
y = -0.0266x + 0.6761
0.6
absorbancia 734 nm

R² = 0.9912
0.5
0.4
CI50= 12,071 µM
0.3
0.2
0.1
0
0 5 10 15 20 25 30
uM trolox

Figura 12. Determinación dela CI50 del TROLOX frente al radical ABTS

57
3.5 DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE

EQUIVALENTE A TROLOX (TEAC- ABTS)

Tabla 16. Determinación de la capacidad antioxidante equivalente a

trolox (TEAC-ABTS) en el extracto etanólico de hojas de Chuquiraga

spinosa Less.

Ecuación de la recta del estándar trolox: y = -0.0266X+0.6761

30 mg
Peso de muestra

0,314 0,316 0,320

Absorbancia de la muestra

5 5 5
Factor de dilución (FD)

13,61 13,53 13.38

µmol/L equivalente a trolox

µmol/L equivalente a trolox X FD 68,06 67,69 66,93

3 mg/mL 3 mg/mL 3mg/mL

mg de extracto /mL

22,69 22,56 22,31

µmol trolox /g

µmol trolox /g extracto 22,52 ± 0,19

Fórmula: [[[[ABS-0,6761/0,0266] x FD]] / 3 mg/mL]

Fuente: Datos de los autores.

58
Tabla 14. Determinación de la capacidad antioxidante equivalente a

trolox (TEAC-ABTS) en el extracto etanólico de flores de Chuquiraga

spinosa Less.

Ecuación de la recta del estándar trolox: y – 0,0266X+0.6761

20 mg
Peso de muestra
0,154 0,152 0,160
Absorbancia de la muestra
10 10 10
Factor de dilución (FD)
19,63 19,70 19,40
µmol/L equivalente a trolox
µmol/L equivalente a trolox X FD 196,28 197,03 194,02
5 mg/mL 5 mg/mL 5 mg/mL
mg de extracto /mL
39,25 39,40 38,80
µmol trolox /g
µmol trolox /g de extracto 39,15 ± 0,31
Fórmula: [[[[ABS-0,6761/0,0266] x FD]] / 5mg/mL]
Fuente: Datos de los autores.

59
 DISCUSIÓN

El empleo de las plantas medicinales con fines curativos es una práctica que

se viene utilizando desde hace mucho tiempo. Durante largos períodos, los

remedios naturales y sobre todo las plantas medicinales utilizadas para

mitigar el dolor y curar enfermedades, fueron el principal e incluso el único

recurso del que disponían los médicos. Esto hizo que se profundizara en el

conocimiento de las especies vegetales que poseen propiedades

medicinales y ampliar su experiencia en el empleo de los productos que de

ellas se extraen. Es así que el uso medicinal de las plantas, la fitoterapia,

nunca ha dejado de tener vigencia, muchas especies vegetales utilizadas

por nuestros antepasados se siguen utilizando hoy en día.

La marcha fitoquímica demostró la presencia de alcaloides, taninos,

flavonoides, compuestos fenólicos, triterpenos, esteroides, en ambos

extractos de hojas y flores (tabla 04 y 05), varios de estos metabolitos

también fueron reportados por Casado et al., (2011)7 y Torres (2000)9, pero

en extractos acuoso y etanólico de las hojas de Chuquiraga spinosa. Los

resultados muestran que son los flavonoides, los triterpenos y esteroides los

más abundantes en este extracto y serían los responsables del efecto

antioxidante in vitro frente al radical DPPH y ABTS (Tablas:07, 08, 09,10).

En el estudio fitoquímico preliminar se ha identificado la presencia de

metabolitos secundarios (ver tabla 03), tales como compuestos fenólicos y

flavonoides principalmente. Se ha demostrado que la familia Asteraceae

presenta una composición fenólica variada de acuerdo a las variedades y

60
procedencia de la especie. La complejidad estructural de los polifenoles

varía desde simples moléculas fenólicas (como el ácido gálico) hasta

complejos altamente polimerizados, como son los taninos. En nuestro

estudio determinamos el contenido de polifenoles totales en hojas (51,8 ±

1,27 mgEAG/g extracto) y flores (354,2 ± 1,9 mg EAG/g extracto) y que los

resultados obtenidos en el presente trabajo, superan a especies nativas

reconocidas como la tara y el camu camu (29,5 ± 0,11; 11,7 ± 0,05 mgEAG/g

extracto), respectivamente, así como la Uncaria tomentosa (uña de gato),

Zea mays (maíz morado),Smallanthus sonchifolius (yacón), Lepidium

meyenii (maca), Krameria triandra (ratania) y Physallis peruviana

(aguaymanto) 33.

Los contenidos de flavonoides, polifenoles son mayores cuando se usa

etanol en lugar de metanol como solvente en la extracción; una posible

explicación se basa en la diferencia de polaridad de estos solventes.

Los compuestos extraídos por el etanol son ligeramente más polares que los

extraídos con el metanol. Entonces se puede inferir que hay flavonoides,

polifenoles más polares en flores que en las hojas, lo cual también explicaría

una mayor actividad antioxidante en los extractos etanólicos de las flores

frente a las hojas34.

Entre todas las propiedades biológicas atribuidas a los flavonoides la de

mayor interés ha sido su actividad antioxidante. El creciente interés por los

posibles efectos beneficiosos de los antioxidantes ha hecho que se

desarrollen un gran número de métodos para la determinación de extractos

con actividad antioxidante. En la determinación de la capacidad antioxidante

61
del extracto etanólico de hojas y flores de Chuquiraga spinosa Less,

utilizando el trolox como patrón de comparación se observa que la

concentración inhibitoria media frente al radical DPPH es significativamente

alta en los dos métodos de evaluación: DPPH (CI50 flores: 5,69 y CI50 hojas:

14,98) y la capacidad antioxidante equivalente al trolox (TEAC hojas:22,52 ±

0,19 µmol trolox /g y TEAC flores: 39,15 ± 0,31µmol trolox /g)

Al presente no hay antecedentes de otros estudios realizados a las hojas y

flores de Chuquiraga spinosa, por lo que nuestros hallazgos son importantes

para contribuir a la investigación de esta especie promisoria.

Siendo los flavonoides responsables de la actividad antioxidante, estos

interfieren en las reacciones de propagación del radical libre y en la

formación del radical en sí. La posible explicación de la actividad

antioxidante de ambos extractos se debería a los diferentes tipos de

flavonoides presentes en su composición fitoquímica no elucidad en el

presente estudio pero que las diferentes sustituciones como la posición del

grupo OH en el anillo B; en particular, una estructura orto-dihidroxilo (grupo

catecol) produce una elevada actividad, ya que confiere una mayor

estabilidad a la forma radical y participa en la deslocalización de los

electrones; actuando además como sitio de fijación preferida para trazas de

metales. La presencia de grupos hidroxilo en las posiciones 3´, 4´y 5´ del

anillo B (grupo pirogalol) ha sido reportada por incrementar la actividad

antioxidante, en comparación con la de flavonoides que contienen un simple

grupo hidroxilo. Sin embargo, bajo las mismas condiciones, tales

compuestos pueden actuar como prooxidantes, neutralizando el efecto

62
antioxidante 36. Un doble enlace entre los carbonos C-2 y C-3, conjugado

con el grupo 4-oxo, en el anillo C, la presencia adicional de grupos hidroxilo

en posición C-3 y C-5 incrementa la capacidad captadora de radicales de los

flavonoides. Un doble enlace entre C-2 y C-3, combinado con un 3-OH, en el

anillo C, incrementa también la capacidad captadora de radicales libres,

como es el caso del canferol. Una sustitución del grupo 3-OH produce un

incremento del ángulo de torsión y una pérdida de coplanaridad y,

subsecuentemente, una reducción de la actividad antioxidante. La

sustitución de grupos hidroxilo en el anillo B por grupos metoxilos altera el

potencial redox y la capacidad captadora de radicales de los flavonoides.

Grupos 3-OH y 5-OH con función 4-oxo en los anillos A y C son necesarios

para ejercer el máximo potencial antioxidante37.

La eficiencia antioxidante está directamente relacionada con el grado

dehidroxilación, pero este disminuye con la presencia de un enlace de

azúcar.

Los resultados presentados en este trabajo se encuentran en concordancia

con los presentados por Ramírez et al (2014) 38 en cuanto al contenido de

polifenoles, y sugieren que los compuestos fenólicos de las Asteraceae, en

particular de los extractos etanólicos aquí estudiados en Chuquiraga

spinosa, pueden ser utilizados como antioxidantes naturales en la dieta. En

vista de las valiosas propiedades medicinales de la huamanpinta.

En los últimos años han sido descritas numerosas propiedades de estos

compuestos, como la posibilidad de inhibir el ciclo celular, la proliferación

celular y el estrés oxidativo, y de inducir la detoxificación de enzimas, la

63
apoptosis, y de estimular el sistema inmune 39,40. Las actividades

antioxidantes y anticarcinogénica de los polifenoles de la dieta han sido

ampliamente estudiadas en diferentes líneas celulares y en animales de

experimentación. Además, diversos estudios epidemiológicos han mostrado

una asociación entre el consumo de alimentos y bebidas ricos en polifenoles

y la disminución del riesgo de padecer enfermedades crónicas relacionadas

con el estrés oxidativo, como el cáncer.

64
 CONCLUSIONES

1. Se identificaron los siguientes metabolitos secundarios en hojas y

flores de Chuquiraga spinosa Less: flavonoides, triterpenos,

esteroides, alcaloides, taninos, y compuestos fenólicos.

2. El contenido de compuestos fenólicos es mayor en el extracto

etanólico de flores en comparación al extracto etanólico de hojas

teniendo: 354,2 ± 1,9 mgEAG/g y 51,8 ± 1,27 mgEAG/g extracto

respectivamente.

3. El extracto etanólico de hojas y flores presentó buena actividad

antioxidante frente a dos radicales evaluados; la actividad

antioxidante in vitro frente al radical DPPH tuvo una CI 50 para el

extracto etanólico de flores: 5,69 µg/mL y CI 50 para el extracto

etanólico de hojas: 14,98 µg/mL; mientras que el TEAC-ABTS fue:

TEAC-hojas: 22,52 ± 0,19 µmol trolox /g de extracto y TEAC flores:

39,15 ± 0,31µmol trolox /g de extracto.

4. El extracto con mayor contenido de polifenoles fue el extracto

etanólico de flores de Chuquiraga spinosa “huamanpinta”, teniendo

una actividad antioxidante frente al radical DPPH y ABTS

directamente proporcional a la cantidad de polifenoles totales

determinados en el presente estudio.

65
 RECOMENDACIONES

1. Realizar otros estudios químicos que permitan separar y caracterizar

la estructura química de los otros metabolitos secundarios presentes

en las hojas de Chuquiraga spinosa Less “huamanpinta”.

2. Determinar el contenido de polifenoles totales por técnicas

cromatográficas como el HPLC.

3. Realizar otros estudios sobre la actividad antioxidante in vivo

empleando otros modelos experimentales.

4. Realizar estudios que propongan su conservación, propagación y uso

racional, ya que esta especie es considerada como un recurso natural

muy promisorio.

66
 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Li E. El futuro de los productos andinos en la región alta y los valles

centrales de los andes. Estado del arte del sector de plantas

medicinales en Perú. Ministerio de la Producción. 2008.

2. Montealegre P, Francis L. Actividad antiinflamatoria y antioxidante de

Bauhinia kalbreyeri Harms en un modelo de inflamación intestinal

agudo en ratas. Rev Cubana Plan Med. 2012; 17(4): 343-359.

3. Liu MNJ, Wang C, Wang Z, Zhang C, Lu S, Liu J, The antioxidant and

free radial scavenging activities of extract and fractions from corn silk

(Zea mays L.) and related flavone glycosides. Food Chem. 2011; 126,

261–269.

4. Albayrak S, Aksoy A, Sagdic O. Compositions, antioxidant and

antimicrobial activities of Helichrysum (Asteraceae) species collected

from Turkey [J]. Food Chem, 2010, 119: 114-122.

5. Agapito T, Sung I. Fitomedicina: 1100 plantas medicinales (Text in

Spanish). Lima, Peru: Edit. Isabel. 2002.

6. Brack, A. Diccionario enciclopédico de plantas útiles del Peru (Text in

Spanish).CBC–Centro de Estudios Regionales Andinos «Bartolomé

de las Casas». Peru: Cuzco. 1999

7. Casado R, Landa A, Calvo J, Garcia-Mina J, Marston A, Hostettmann

K, Calvo M. Anti-inflamatory, antioxidant and antifungical activity of

Chuquiraga spinosa. Biol. Pharm. 2011; 49 (6): 620-6.

67
8. Chávez H, Molina A, Ramos R, Ferreyra C, Revatta L. Aislamiento e

identificación de los metabolitos secundarios bioactivos de

Chuquiraga spinosa “huamanpinta”. I Congreso Internacional y III

Congreso Nacional de investigación científica tecnológica. Libro de

resúmenes. Ica-Perú. 2011.

9. Torres M. Actividad antiinflamatoria prostática del extracto atomizado

de la especie Chuquiraga spinosa lessing “qarisirwi” en Canis

familiares. Tesis de Químico Farmacéutico. Ayacucho-Perú. 2004.

10. Contreras C. Tamizaje fitoquímico y evaluación de los extractos

bencénico, alcohólico y acuoso de las hojas de Chuquiraga spinosa

Lessing “jarisirwi”. Universidad Nacional de San Cristóbal de

Huamanga-Ayacucho. 2003.

11. Arenas, J. Marcha Fitoquímica y Efecto Diurético de Chuquiraga

spinosa (Asteraceae) en Cavia porcellus (cobayos). Universidad

Nacional San Agustín. Arequipa-Perú. 2000.

12. Sotelo, C. Atividade antiinflamatoria da Chuquiraga spinosa subsp.

“huamanpinta” em ratos e camundongos. Universidade Estadual de

Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. Programa de Pós-

Graduação em Ciências. Teses de Mestre em Ciências. 1998.

13. Kapoor M, Clarkson A, Sutherland B, et al. The role of antioxidants in

models of inflammation: Emphasis on L-arginine and arachidonic acid

metabolism. Inflammopharmacology. 2005; 12(5-6): 505-519.

14. Arroyo J, Cisneros C. Modelos experimentales de Investigación

Farmacológica. Facultad Medicina Humana. UNMSM. 2012.

68
15. Arroyo J, Rojas J, Chenguayen J. Manual de Modelos Experimentales

de Farmacología. Facultad Medicina Humana. UNMSM. 2004.

16. Gómez H, González K, Medina D. Actividad Antiinflamatoria de

Productos Naturales. Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas

Medicinales y Aromáticas. Sociedad Latinoamericana de Fitoquímica.

Santiago, Chile. 2011; 10(3): 182-217.

17. Katzun B, Masters S, Trevor A. Farmacología básica y clínica. 11va

edición. Editorial McGraw-Hill. Interamericana. China. 2010.

18. Brunton L, Lazo J, Parker K. Goodman y Gilman las bases

farmacológicas de la terapéutica. Editorial McGraw-Hill

Interamericana. 9ma. Edición. México. 1996.

19. Newman D, Cragg G, Snader K. Natural products as sources of new

drugs over the period 1981 - 2002. J Nat Prod. 2003; 66: 1022 -1037.

20. Pichardo N, Teo A. Actividad Inmunomoduladora de Especies

Cultivadas Nativas de Mesoamérica (P. alliacea L y S. domingensis

Willd). Tesis de Química Bióloga. Facultad de ciencias Químicas y

Farmacia. Universidad San Carlos de Guatemala. 2010.

21. Sánchez C, Gupta M, Santana A. Actividad Inmunomoduladora de

plantas. Revista de Fitoterapia. 2002; 2(2): 151-163.

22. Fabri R, Nogueira M, Dutra L, Bouzada M, Scio E. Potencial

antioxidante e antimicrobiano de especies da família Asteraceae. Rev.

Bras. Pl. Med., Botucatu. 2011; 13 (2):183-189.

23. León F, Cabieses F. Efecto Antiinflamatorio de la Uncaria tomentosa

"uña de gato". Odontología Sanmarquina. 2000; 1(6): 66-68.

69
24. Amir Jhorfran Z, Azadbacht H, Karimi M. Evaluation of the

inmunomodulatory effects of five herbal plants. Journal of

Ethnopharmacology. 2000; 72: 167-172.

25. Sreejayan MNA. Nitric oxide scavenging by curcuminoids.

[Link]. 1997; 49: 105-107.

26. Oyaizu M. Studies on product of browning reaction prepared from

glucose amine. Jpn J. Nutr. 1986; 44: 307-315.

27. Benzie IFF, Strain JJ. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as
a measure of “antioxidant power”: the FRAP assay. Anal Biochem.
1996; 239:70–6.

28. Repetto MG, Llesuy SF. Antioxidant properties of natural compounds

used in popular medicine for gastric ulcer. [Link]. 2002;

35(5):523-534.

29. Trease E, Evans WC. Pharmacognosy. 15th ed. San Diego, CA:

Harcourt Publishers Limited; 2002:343–545..

30. Villanueva- Tiburcio, Condezo-Hoyos, L.; Asquieri, E. Antocianina,

ácido ascórbico, polifenoles totales y actividad antioxidante en la
cascara de Camu camu (Myrciaria dubia(H.B.K) Mc Vaugh. Revista
Ciencia y Tecnología de alimentos. 30(supl.1)151-160. Campinas.
Brazil. 2010.

31. Brand-Williams W, Cuvelier ME, Berset C. Use of a free radical

method to evaluate antioxidant activity. Food Science and Technolog.

1995; 28 (1): 25 -30.

32. Pellegrini N, Serafini M, Colombi B, Del Rio D, Salvatore S, Bianchi M,

70
 et al. Total antioxidant capacity of plant foods, beverages and oils

consumed in Italy assessed by three different in vitro assays. J Nutr.

2003; 133: 2812–9.

33. Soares JR, Dinis TCP, Cunha AP, Ameida LM. Antioxidant activity of

some extracts of Thymus zygis. Free Rad. Res.1997; 26: 469-478.

34. Duh PD, Tu YY, Yen GC. Antioxidant activity of water extract of harng

jyur (Chrysanthemum morifolium Ramat). Lebensm.-Wiss.u-Technol.

1999; 32: 269-277.

35. Halliwell B, Gutteridge JMC. In: Free radicals, ageing and disease.

Free radicals in Biology and Medicine. 1985; 2nd edition. Clarendron

Press. Oxford. 279-315.

36. Marletta MA. Nitric oxide: Biosynthesis and biological significance.

Trends [Link]. 1989; 14: 488-492.

37. Shimazaki H. Antioxidants. In: Niki E, Shimazaki, H, Mino, M (eds),

Free radicals and biological defense. 1994; Japanese Science

Societies Press. Tokyo. 45-57.

38. Ramírez R. Capacidad antioxidante y actividad antinflamatoria e

inmunomoduladora del extracto clorofórmicode Chuquiraga Less

“huamanpinta”. [Tesis para obtener el grado de Doctor en Farmacia y

Bioquímica]. Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima. 2014.

39. Lin JM, Lin CC, Chen MF. Scavenging effects of Mallotus repandus on

active oxygen species. J. Ethnopharmacol. 1995;46:175-181.

40. Houghton PJ. Pharmacognosy: the basis for quality herbal medicinal

products. Pharm. News. 1999; 6(4): 21-27

71
 ANEXOS

ANEXO N° 01

CLASIFICACION TAXONÓMICA VEGETAL DE LA HUAMANPINTA

72
 ANEXO N° 02

Obtención del extracto etanólico de Chuquiraga spinosa Less (Huamanpinta).

Obtención de la planta

Humectación de hojas y
flores de huamanpinta,
con etanol. Previamente
protegido de la luz.

73
 Filtración

Después del filtrado, este

se guarda en unos
envases, y se protege de
la luz, con papel aluminio.

Extracto

Extracto Extracto
etanólico etanólico
seco de seco de
Hojas Flores

74
 ANEXO N°03

Evaluación de la cuantificación de polifenoles totales presentes en el extracto etanólico

de Chuquiraga spinosa Less (Huamanpinta).

Preparación del reactivo

Folin ciocalteu.

Preparación de la muestra

Lectura de las absorbancias

en el espectrofotómetro

75
 ANEXO N°04

Evaluación de la actividad antioxidante in vitro

Ensayo del DPPH

Preparación del trolox

Preparación de la

muestra: hojas, flores

Reacción de la muestra
Con el DPPH.
Lectura en el
espectrofotómetro

76
 ANEXO N°05

Ensayo de la actividad antioxidante in vitro

Ensayo con el ABTS

Reacción del ABTS con el

persulfato de potasio
y formación de un radical libre

Preparación de la muestra:
Hojas , flores y reacción
Con el radical libre

Las flores contienen mayor

cantidad de flavonoides, ya
Que está en contacto con el
reactivo viro a color transparente

77