Aseguramiento de la calidad y validacin

de metodologas para el anlisis microbiolgico

NORMA ISO 17025

Bqca. Alicia I. Cuesta

Normas
Sistema de calidad
ETA

Alimentos sanos

Mtodos analticos

SEGURIDAD e INOCUIDAD ALIMENTARIA

Manejo sanitario

Bqca. Alicia Irene Cuesta

Normas

CALIDAD HIGIENICA
Y SENSORIAL

Sistema de calidad
Alimentos sanos

Mtodos analticos
VIDA UTIL
Manejo sanitario

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Generalidades de la Norma ISO 17025

Los resultados de los mtodos analticos:

Basados en principios de aseguramiento de la calidad.

Validados

Acreditados segn la Norma ISO 17025

Son internacionalmente reconocidos

Considerados de referencia para la evaluacin
de conformidad de los productos de intercambio
en el comercio internacional.
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NORMA ISO 17025: 2005

General requirements for competence of calibration and testing laboratory.

Es la norma vigente para acreditar laboratorios.

Esta norma tiene todos los requisitos que deben cumplir
los laboratorios de ensayos si desean demostrar que
poseen:

Un sistema de calidad.

Son tcnicamente competentes

Capaces de generar resultados tcnicamente vlidos.
Hay un reconocimiento mutuo con otros
laboratorios del mundo.

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 La ley est por encima de las normas

La Norma ISO 17025 no contempla el cumplimiento de :
 requisitos regulatorios y
 de seguridad relacionados con el funcionamiento del
laboratorio.
La Norma dice :
QU hay que hacer? (Requisito)
El laboratorio dice el
CMO? (cmo se implementa el requisito)

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ACREDITACIN (Norma ISO 17025 )

Determinar la competencia tcnica del personal
y la validez tcnica de las operaciones.
Tiene que demostrar competencia
Los resultados de ensayo de un laboratorio
que tiene competencia tcnica
sern
CONFIABLES Y EXACTOS

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Particularidades de ensayos microbiolgicos

A diferencia de las ciencias qumicas y fsicas,
en microbiologa se trabaja con
microorganismos que se multiplican por divisin
binaria y crecen exponencialmente.
Los ensayos microbiolgicos incluyen
ensayos de
esterilidad, deteccin, aislamiento, recuento e
identificacin de microorganismos y sus
metabolitos.
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Pilares sobre los que se apoya la

COMPETENCIA TECNICA

COMPETENCIA TECNICA
Equipamiento
PERSONAL

MTODO

Ambiente

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Laboratorio da resultados confiables y exactos?

Situacin del
laboratorio con
respecto a:

Caso 1

Caso 2

Caso 3

Personal

capacitado,
desarrolla bien su
tarea.

capacitado,
desarrolla bien su
tarea.

Personal no est
adecuadamente
capacitado

Instalaciones y
condiciones
ambientales
Equipos

Adecuados y
suficientes

Riesgo de
contaminacin
cruzada

Adecuados y
suficientes

no est validada

Validada

Validada

Validacin de la
metodologa

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10

Los objetivos de un sistema de calidad son:

PREVENCIN: Evitar que se produzcan errores e
ineficiencias.
DETECCIN: Identificar los elementos causantes de los
errores.
CORRECCIN Y MEJORA: Eliminar las causas de los
errores y mejorar los procesos.
DEMOSTRAR: Evidenciar objetivamente que se ha
cumplido con los requisitos
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11

ENSAYO MICROBIOLGICO
Las operaciones que se realizan dentro del
laboratorio de microbiologa pueden dividirse en
aquellas que son crticas para la calidad de
resultados del ensayo y aquellas que tienen un
menor impacto.
Las operaciones crticas deben ser:
controladas,
monitoreadas y
documentadas.
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12

Aseguramiento de calidad
Norma ISO 17025
PERSONAL

Las personas son el motor de los sistemas de calidad

y por lo tanto este es un punto crtico y que la norma
ISO/IEC 17025 lo trata extensamente.
Tiene que haber motivacin interna para planificar,
implementar y mantener el sistema de calidad!!

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13

Requisitos Personal (Norma ISO 17025):

El personal debe contar con conocimientos, experiencia y competencia de
acuerdo a las tareas y responsabilidades que tenga asignadas.
COMPETENCIA DEL PERSONAL: La competencia involucra conocimientos,
habilidades, comprensin y actitudes. La evaluacin debe ser continua.
El laboratorio debe tener documentado el personal autorizado para cada
ensayo.
PERSONAL AUTORIZADO: personal que posee el reconocimiento formal de
su capacidad para realizar en forma correcta una determinada tarea que se le
ha sido asignada.
Todo el personal tcnico que trabaja en el laboratorio de microbiologa debe
recibir un adecuado entrenamiento de modo de asegurar que ejecuta en forma
idnea las operaciones relacionadas con el ensayo.
La capacitacin es un requisito muy importante del sistema de calidad.
CAPACITACIN DEL PERSONAL: Definicin: proceso continuo y sistemtico
destinado a la formacin, entrenamiento, actualizacin o perfeccionamiento
especfico del personal.
La direccin debe definir y mantener actualizados los perfiles de puestos del
personal directivo, tcnico y de apoyo clave afectado a los ensayos.
PERFIL DEL PUESTO DE TRABAJO: Definicin: Son los requisitos mnimos de
formacin acadmica y experiencia que debe tener el personal para acceder al
puesto de trabajo.

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14

CAPACITACIN DEL PERSONAL

Entrenamiento:
Actividad de ensear las habilidades que una persona
necesita para desarrollar su labor en un determinado
puesto de trabajo.
Tiene carcter eminentemente prctico .
Se relaciona directamente con la tecnologa, tiles,
equipos, etc. que se usan en el puesto de trabajo.
Formacin:
Actividades de incorporacin de conocimientos generales
y especficos necesarios para que el personal pueda
desarrollar su labor en un determinado puesto de trabajo.
Se hace referencia a la formacin acadmica del personal.
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15

Norma ISO17025:2005 punto 5.2.2

La direccin del laboratorio debe formular

las metas con respecto a la educacin, la
capacitacin y las habilidades del personal del
laboratorio.
El laboratorio debe tener una poltica y
procedimientos para identificar las necesidades de
capacitacin del personal y para proporcionarla.
El programa de capacitacin debe ser pertinente a
las tareas presentes y futuras del laboratorio.
Se debe evaluar la eficacia de las acciones de
capacitacin implementadas.
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16

Capacitacin del personal

LABORATORIO MICROBIOLOGIA
Todo el personal tcnico debe recibir un adecuado
entrenamiento que incluyen:
Tcnicas bsicas de microbiologa para la manipulacin
de cultivos y muestras en condiciones de esterilidad
Adecuado criterio para el manejo de material
potencialmente infeccioso.
Conocimiento de normas de bioseguridad, etc.

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17

Requisitos Norma ISO 17025: PERSONAL

COMPETENCIA TECNICA

Calificacin bsica

Descripcin de actividades
y responsabilidades del personal
CONDUCCIN TCNICO

DE APOYO

Relacin de dependencia
CAPACITACION:
Identificacin de las
necesidades de capacitacin.
Planificacin de la capacitacin.
Realizacin de la capacitacin
Documentacin.

LABORATORIO

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18

Aseguramiento de calidad
Norma ISO 17025
INSTALACIONES Y CONDICIONES
AMBIENTALES

Requisitos:

Las instalaciones del laboratorio de ensayo

(incluye fuente de energa, luz y condiciones
ambientales) deben ser capaces de facilitar
la realizacin correcta de los ensayos.

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19

Instalaciones (cont)

Debe haber una efectiva separacin entre reas

vecinas en las que se realizan actividades
incompatibles.
Se deben tomar medidas para prevenir la
contaminacin cruzada.
La ubicacin, el diseo y la distribucin de las
diferentes reas que integran el laboratorio
deben minimizar el riesgo de contaminacin de
las muestras y los cultivos.

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20

MEDIDAS PARA PREVENIR LA CONTAMINACIN CRUZADA.

CRUZADA

En la prctica esto se puede lograr:

Separando las actividades en tiempo y espacio.
espacio
Mediante la construccin del laboratorio segn un
diseo sin camino de regreso se puede obtener una
reduccin significativa del riesgo de contaminacin
cruzada.
Llevando a cabo los procedimientos de una manera
secuencial,
secuencial usando las precauciones apropiadas para
asegurar la integridad de la muestra y del ensayo.
Por ejemplo uso de recipientes hermticamente cerrados.
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21

SEPARACIN DE REAS DEL LABORATORIO:

No es aceptable que
el laboratorio de microbiologa
ocupe una sola sala polivalente.
Requisito: El rea analtica debe estar separada
de la de preparacin de medios de cultivo y lavado
de material.

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22

Separacin de reas del Laboratorio:

Es conveniente separar las siguientes reas:
 zona de recepcin y almacenamiento de muestras.
 Preparacin, muestreo y pesada de muestras.( importante si se
analizan productos en polvo)
 Examen de muestras incluyendo su incubacin.
 Manipulacin de patgenos.
 Mantenimiento de microorganismos de referencia.
 Verificacin de la esterilidad.
 Preparacin de los medios y equipos incluyendo su esterilizacin
 Descontaminacin.
El rea de Lavado de material ( despus de la descontaminacin)
pueden compartirse con otras partes del laboratorio (precaucin
contaminacin con trazas de sustancias que afecten crecimiento
microbiano).
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23

El diseo del laboratorio depender de los ensayos

que se llevarn a cabo (depende del alcance de las
metodologas)
Ejemplo si adems de realizar ensayos por mtodos
tradicionales se llevan a cabo ensayos empleando tcnicas
de biologa molecular se necesitarn reas adicionales.
El laboratorio debe tomar las medidas necesarias para
reducir al mnimo el riesgo de contaminacin
siempre que dicho riesgo
sea importante para el tipo de ensayos realizados.
realizados
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24

Medidas para de disminuir el riesgo de contaminacin

y facilitar la limpieza y desinfeccin de las diferentes reas.

Medidas relativas a los materiales :

Facilitar la limpieza:
Las paredes, techos suelos y superficies de trabajo del
laboratorio deben ser lisas.
Las superficies de madera de las instalaciones y
accesorios deben estar protegidas y selladas.
Evitar maderas rugosas y sin revestir.

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25

Medidas relativas al diseo:

Espacio disponible:
Las reas del laboratorio deben ser suficientemente espaciosas.
El espacio necesario estar de acuerdo con el volumen de muestras analizadas
y la organizacin interna del laboratorio.

Facilitar la limpieza:
Las uniones entresuelo, paredes y techos deben ser cncavas.
Contar con canillas, adecuadamente ubicadas, para el lavado de manos del
personal.

Ventilacin:
Las reas de trabajo deben estar apropiadamente ventiladas y a una
temperatura adecuada.
Puede hacerse por ventilacin natural o forzada, o mediante el uso de
acondicionadores de aire. En este ltimo caso, los filtros deben revisarse,
mantenerse y reemplazarse peridicamente, acorde al tipo de trabajo que se
realiza.

Otros:
Evitar uso de cortinas y/o persiana internas
En caso de uso incluirlas en el plan de limpieza

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26

Otras medidas :
Ausencia de documentos obsoletos, objetos
o mobiliario innecesario en el rea del laboratorio.
Minimizar la apertura de puertas y ventanas durante la
realizacin del ensayo.
Contar para el lavado de manos del personal con canillas
no manuales, el jabn desinfectante debe estar dispuesto
en dispensadores y toallas descartables para el secado.
Los armario estanteras, equipos deben estar colocados
de forma de evitar acumulacin de polvo.
Ejemplo armarios hasta el techo.
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27

Se debe controlar el acceso y el uso de las reas que afecta la

calidad de los ensayos.

El acceso al laboratorio debe estar restringido slo al personal tcnico

o a personas autorizadas.
CONDICIONES AMBIENTALES
REQUISITO:
El laboratorio debe asegurarse que
las condiciones ambientales, bajo las cuales se realizan los
ensayos microbiolgicos,
no invaliden los resultados de ensayo ni comprometan la calidad
requerida de los resultados.

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28

Ejemplos de
condiciones ambientales no deseables
Condiciones
Ambientales

Efecto posible sobre el ensayo

Lugar a monitorear

Deficiente esterilidad
biolgica

Contaminacin de las muestras y

cultivos

Sala de siembra y de
preparacin de muestras

Suministro elctrico
interrumpido
o deficiente

-Variacin de las condiciones de

ensayo.
-Prdida de viabilidad cepas de
referencia por descongelacin.
-Conservacin inadecuada de la
muestra, reactivos y medios de
cultivo.

Niveles de
ruido o
vibracin excesivos.

Interfiere en la pesada de la
muestra, polvos deshidratados
para preparacin de medios de
cultivos o reactivos

Sala de preparacin de
muestras

Mayor polvo en
suspensin en el aire

Contaminacin de las muestras y

cultivos

Sala de siembra y de
preparacin de muestras

Funcionamiento
de estufas, congeladores y
heladeras

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29

Requisito
El laboratorio debe establecer:
Un programa documentado de limpieza y desinfeccin
que tenga en cuenta los resultados de vigilancia de las condiciones
ambientales y la posibilidad de contaminacin cruzada.
Objetivo:

Organizar las tareas de limpieza y desinfeccin del laboratorio de
microbiologa.

Establecer la frecuencia de realizacin de las mismas

Se detallan las superficies a limpiar y/o desinfectar, el nivel de
limpieza requerido (trapeo hmedo, trapeo mojado, etc.), los
desinfectantes a preparar y su modo de uso.

El personal que realiza la limpieza.

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30

PLAN DE HIGIENE.

Son los procedimientos
operativos empleados durante la
realizacin del trabajo en el
laboratorio.

Tiene como principal objetivo
evitar la contaminacin en todas
las etapas del ensayo
lo que implicara obtener resultados
errneos, la infeccin del personal,
etc.

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31

PLAN DE HIGIENE.
El laboratorio debe trabajar tomando las siguientes precauciones :

Relativo al trabajo propiamente dicho.
Por ejemplo:
Asegurarse que el rea de trabajo est limpia y que no haya corrientes de aire.
Limpiar la superficie de trabajo con un desinfectante adecuado, antes y despus del trabajo.
Durante la siembra y manipuleo estril de muestras no hablar y evitar toser.
Abrir los tubos de ensayo y botellas cerca de la llama.
Trabajar tan rpido como sea posible, evitando movimientos innecesarios.
la manipulacin del material patgeno o txico requiere trabajar en reas cerradas o bajo campanas
de flujo laminar, especialmente cuando se abren las cajas de Petri.
Evitar la formacin de aerosoles. Se pueden formar al abrir las cajas de Petri, los tubos, las botellas o
los frascos, al usar mezcladores, jeringas, centrfugas, etc. y cuando se esterilizan ansas hmedas.

Relativo al rea de trabajo:

Utilizar vestimenta de uso exclusivo en el laboratorio, guardapolvo de color claro, limpio y en buenas
condiciones, no debe ser usado fuera del rea de trabajo del laboratorio.
Dejar en zona de oficinas o externa al laboratorio los abrigos. portafolios, etc. Y en el rea del
laboratorio no comer, beber, fumar.

Relativo a la Higiene del personal tcnico:

Antes y al finalizar la labor en el laboratorio, el personal tcnico debe lavarse las manos con un
producto adecuado (jabn desinfectante).
El personal debe tener uas cortas y limpias, el pelo debe estar recogido, no tener anillos ni pulseras.
Uso de barbijo si es necesario.
El personal que presente infecciones serias en manos o cara no debe realizar exmenes
microbiolgicos.

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32

MONITOREO AMBIENTAL:
La calidad microbiolgica
del aire y las superficies
del laboratorio en microbiologa
Es un indicador de la efectividad
de las tareas realizadas segn el:
Plan de limpieza, desinfeccin y mantenimiento
Plan de higiene.
Procedimiento: MONITOREO AMBIENTAL
Establece :
Metodologa para la toma de muestra.
 Lugares de toma de muestra.
 Lmites de tolerancia o criterios de aceptacin o rechazo.
Frecuencia de monitoreo.
Acciones correctivas a tomar en caso de desvos de los lmites
establecidos.
Esto se aplica tanto a control ambiental del rea analtica del laboratorio
como para la campana de flujo laminar.

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33

El programa de muestreo para

monitoreo ambiental puede incluir
(dependiendo del ensayo que realiza el laboratorio):

Determinacin cuantitativa de microorganismos

presentes en el ambiente (recuento total o recuento de
determinados tipos de microorganismos como por ejemplo
hongos)
Determinacin cualitativa de algunos patgenos y/o
indicadores dependiendo de los ensayos que realiza el
laboratorio (Ejemplo: Enterobacterias, Coliformes,
Salmonella spp, Listeria monocytogenes, Listeria spp,
Staphylococcus aureus).

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34

MTODOS PARA CONTROL

CALIDAD DEL AIRE:

Mtodo pasivo, por sedimentacin.
sedimentacin
Se realiza el recuento de microorganismos viables que se posan
sobre una superficie de medio de cultivo (tcnica cualitativa).
No existe relacin entre la cantidad de colonias encontradas en por
placa y el volumen de aire.

Mtodo activo, por impacto.
Se realiza el recuento de microorganismos viables retenidos
sobre una superficie de medio de cultivo forzando un
determinado volumen de aire.
Mtodos para control calidad del aire: MTODO PASIVO Y
ACTIVO
Los resultados de ambos mtodos no son comparables (el principio
de muestreo y las unidades en las cuales se expresan son diferentes).
SE RECOMIENDA INTERPRETAR TENDENCIAS Y NO
OBSERVACIONES AISLADAS.(tomar siempre la muestra en un mismo
lugar)
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35

Mtodos para control calidad del aire:

Normas IRAM 14071-1:2002 EXPOSICIN DE PLACAS:

Toma de muestra: durante un tiempo estipulado, se exponen placas de

Petri (o sea se abren las placas) con medio de cultivo no selectivo, en el rea de
trabajo y durante el proceso de siembra.

reas a monitorear o zonas de toma de la muestra: sala

de siembra y sala de preparacin de muestras.

Medio de cultivo usado. Ejemplo PCA.

Tiempo y temperatura de incubacin: Luego de la exposicin al
aire, las placas se cierran e incuban durante Ejemplo 72 horas a 30 C.

Frecuencia de realizacin de los controles. Ejemplo mensual.

Criterio de conformidad: nmero mximo de colonias por tiempo de
exposicin de las placas. Ejemplo durante 15 minutos se permite hasta 15
colonias. Los resultados se expresan como unidades de colonias (ufc) por placa

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36

Mtodos para Control calidad

de superficies:

Mtodo

Recoleccin

Tipo de
superficie

Hisopado

Hisopo estril

Delimitada

Siembra directa

Esponjatrapeado

Esponja embebida
en medio especfico

Irregular
Superficies
100cm2

Siembra de
volumen
conocido

Caja de
contacto
o Petrifilm

Contacto, presin y
tiempo estndar

Plana

Incubacin
directa

Siembra

Normas de consulta: Mtodos para Control calidad de superficies: ISO 18593:2004 Microbiology
of food and animal feeding stuffs -- Horizontal methods for sampling techniques from surfaces
using contact plates and swabs

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37

Instalaciones y condiciones ambientales

Equipamiento necesario
Limpieza y orden

Reglas de acceso
y utilizacin
de las reas

Plan de higiene
LABORATORIO

Separacin de
reas donde
se realizan
actividades incompatibles

Monitoreo ambiental

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38

Aseguramiento de calidad
Norma ISO 17025
MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

REQUISITO:
El laboratorio debe asegurarse que
la calidad de los medios de cultivo y reactivos
sea apropiada para los ensayos realizados.
Este es un punto crtico!
Cmo se asegura su calidad?
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39

Qu necesita un
microorganismo para crecer?
MEDIOS DE CULTIVO:
Son necesarios para el aislamiento, mantenimiento,
la reproduccin y la identificacin de los
microorganismos.

Contienen sustancias nutritivas

pH adecuado

Deben estar estriles.
Incubacin:
Depende del metabolismo del microorganismo a
cultivar.
La atmsfera empleada.(aerobio, microaeroflico,
anaerobio)
Tiempo.
Temperatura.
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40

Clasificacin de medios de cultivo:

[Link] su estado fsico: lquidos, semislidos y slidos.
[Link] su finalidad en microbiologa:
No selectivos: contienen suficientes nutrientes como para

soportar el crecimiento de gran variedad de microorganismos.

Selectivos: permiten el crecimiento de slo un tipo de

microorganismo.

Enriquecido: son medios no selectivos que se le agrega

sustancias como ser sangre, suero, albmina, etc... Para

microorganismos exigentes.

Diferenciales: son medios de cultivo que permiten

establecer diferencias entre diferentes tipos microorganismos.

Bqca. Alicia Irene Cuesta

41

Los medios de cultivo se preparan:

1. En el laboratorio a partir de sus diferentes

componentes.
2. A partir de productos en polvo deshidratados
comerciales o
3. Pueden adquirirse medios listos para su uso.
La calidad de un medio de cultivo depende de la calidad de
los ingredientes bsicos, la correcta formulacin, calidad
del procedimiento de preparacin, ausencia de inhibidores,
envasado y almacenamiento.
Normas de consulta: ISO 7218:1996(E) Microbiology of
food and animal feeding stuff-General rules for
microbiological examinations y ISO/TS 11133-1:2000
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42

Requisitos de los medio de cultivo

provistos por el fabricante :

Los lotes de medios deben estar debidamente identificados.
(TRAZABILIDAD)

Cada lote recibido debe ir acompaado de evidencias del
cumplimiento de las especificaciones de calidad.

El fabricante debe proveer informacin acerca de las
especificaciones de calidad del medio de cultivo, debe incluir lo
siguiente:
Nombre del medio y lista de componentes, incluido cualquier suplemento.
Fecha de vencimiento del medio.
Condiciones de almacenamiento.
Control de esterilidad.
Control del crecimiento de los microorganismos de inters (target) y de los
microorganismos no deseados (no target) y criterios de aceptabilidad.
Controles fsicos y criterios de aceptabilidad aplicados.

Bqca. Alicia Irene Cuesta

43

Manejo de los medios de cultivo:

[Link] laboratorio debe registrar la fecha :

de recepcin

de apertura del envase.

de caducidad
2. El almacenamiento debe realizarse en las
condiciones apropiadas.

Envases: deben estar hermticamente cerrados.
(especialmente medios deshidratados)

No deben utilizarse medios deshidratados que
presenten apelmazamiento o un cambio de color.
Bqca. Alicia Irene Cuesta

44

CONTROL DE CALIDAD DEL AGUA DESTILADA

Para la preparacin de medios, soluciones y tampones,

debe utilizarse agua destilada que haya sido sometida a
controles peridicos que aseguren su calidad.
Controles peridicos:

Requisitos del agua destilada:
-Conductividad.
- pH
- Contaminacin microbiana
- Libre de sustancias bactericidas, inhibidoras o
interferentes.
-Se debe llevar un registro actualizado de los mismos.
Bqca. Alicia Irene Cuesta

45

Procedimiento para preparacin

de medios de cultivo, diluyentes y reactivos
Los medios de cultivo, soluciones y reactivos deben
prepararse, almacenarse y utilizarse de acuerdo
con un procedimiento documentado.

En dicho procedimiento debe haber una descripcin del
equipamiento necesario.

El laboratorio debe colocar una etiqueta indicando la
identificacin y otros datos en los medios de cultivo y
reactivos.(TRAZABILIDAD)

Debe haber un registro de preparacin de medios de
cultivo y reactivos.
Bqca. Alicia Irene Cuesta

46

LAVADO DE MATERIAL:

Otro aspecto a tener en cuenta es el correcto

lavado del material reciclable.
El laboratorio de debe contar con un instructivo para esta
tarea.
Pasos:
Descontaminacin material de vidrio.
Enjuague y se lavado con agua caliente y detergente
apropiado ( extran neutro diluido al 2%)
Enjuague n de veces con agua corriente y luego un n de
veces con agua destilada. Eliminar el detergente
El material se seca en estufa y se acondiciona para ser
esterilizado.
Bqca. Alicia Irene Cuesta

47

Control de esterilidad de los medios de cultivo y diluyentes:

Fue efectivo el proceso de esterilizacin de los medios de

cultivo y diluyentes?
PRUEBA: se incuban en estufa de cultivo.
La temperatura y tiempo de incubacin para esta prueba se
corresponden con las condiciones usadas durante el ensayo.
Se realiza este ensayo sobre el 1% de las placas o tubo del
comienzo y 1% de las placas o tubos del final de verter o
distribuir los medios o diluyentes.
Este procedimiento se realiza por cada vez que se esteriliza
un lote de medio de cultivo o diluyente en autoclave o se
esteriliza por filtracin.
Bqca. Alicia Irene Cuesta

48

Aseguramiento de calidad de los medios de cultivo:

Posibles problemas
Anormalidad

Posible causa

Falla en la
solidificacin del
medio slido

Sobrecalientamiento del medio durante la preparacin

Peso incorrecto del agar

Agar mal disuelto o incompleta mezcla de los ingredientes

Formacin de
precipitado

Sobrecalientamiento del medio durante la preparacin

pH medido incorrectamente

Pobre calidad del agua.

Pobre calidad del medio deshidratado.

pH incorrecto

Pobre calidad del agua.

Pobre calidad del medio deshidratado.

pH medido incorrectamente.

Contaminacin externa con qumicos.

Sobrecalientamiento del medio durante la preparacin

Bqca. Alicia Irene Cuesta

49

Aseguramiento de calidad de los medios de cultivo:

Posibles problemas
Anormalidad

Posible causa

Color anormal

Sobrecalientamiento del medio durante la preparacin

pH incorrecto

Contaminacin externa.

Pobre calidad del agua o del medio deshidratado.

Selectividad pobre

Sobrecalientamiento del medio durante la preparacin

pH incorrecto.

Formulacin inadecuada.

Pobre calidad del medio deshidratado.

Suplementos agregados incorrectamente Ej: con el medio demasiado
caliente o en alta proporcin.

Medio inhibitorio/
Productividad baja

Pobre calidad del agua.

Formulacin inadecuada Ej. ingredientes y suplementos mal pesados.

Sobrecalientamiento del medio durante la preparacin

Pobre calidad del medio deshidratado

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50

EVALUACIN DE LA CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

El objetivo es definir la: metodologa para evaluar la

PRODUCTIVIDAD y SELECTIVIDAD de medios de
cultivo slido, semislido o lquidos ya preparados y
esterilizados, utilizados en el laboratorio de
microbiologa.
Cultivo de trabajo (segn Instructivo de cultivos de
referencia) Se prepara un cultivo en fase estacionaria
de la cepa a partir de la cepa de reserva almacenadas
en el laboratorio en un caldo no selectivo (por ejemplo
caldo cerebro corazn)

Bqca. Alicia Irene Cuesta

51

PRODUCTIVIDAD:
Definicin: rendimiento, recuperacin, crecimiento
de un microorganismo que se espera que desarrolle en
el medio de cultivo.
Segn el medio de cultivo, se usa una cepa apropiada de
referencia target para evaluar la productividad
(ver anexo B de la norma ISO/TS 11133-2:2000)
EJEMPLO: En un medio de cultivo no selectivo
como por ejemplo el PCA se evala el
adecuado desarrollo de las cepas target o
blanco.
En este caso se usan E. coli ATCC 25922,
S. aureus ATCC 6538 y B. subtilis ATCC 6633
Bqca. Alicia Irene Cuesta

52

SELECTIVIDAD:
Definicin: la supresin del crecimiento de un
microorganismo que se espera sea inhibido
en el medio de cultivo.
Segn el medio se usa una cepa apropiada de referencia
no-target para evaluar la selectividad
(ver anexo B de la norma ISO/TS 11133-2:2000)
En un medio de cultivo selectivo como por ejemplo Caldo Lauril sulfato (LST)
se evala el desarrollo de las cepas target y no target.
En este caso las cepas target que se usan son
[Link] ATCC 25922, [Link] ATCC 43864
y las cepas no target Enterococcus faecalis ATCC 29212.
Evala reacciones caractersticas: gas y turbidez.
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53

En medios selectivos y/o diferenciales hay que evaluar:

El crecimiento de las cepas target

Hay que prestar atencin tambin a la
apariencia, tamao y morfologa de las
colonias (especificidad)
El crecimiento de las cepas
no-target debe estar en parte o
completamente inhibido.
Bqca. Alicia Irene Cuesta

54

PARA EVALUAR CADA LOTE DE MEDIO DE CULTIVO

segn Norma ISO/TS 11133-2:2000

SE PUEDE EMPLEAR LOS SIGUIENTES MTODOS:

a)Pruebas cuantitativas
b) Pruebas semi-cuantitativas
c) Pruebas cualitativas

Bqca. Alicia Irene Cuesta

55

MEDIO DE REFERENCIA

El uso de un medio de referencia especfico

es obligatorio en los mtodos de cuantitativos
(ver anexo B de la norma ISO/TS 11133-2:2000)
Para las pruebas semi-cuantitativas o cualitativas,
el uso de un medio especfico de referencia
o un medio de cultivo que da una la reaccin positiva"
ayuda al nterpretar los resultados.
El medio de referencia debe ser de conocida buena calidad
(por ejemplo ser un medio listo para el uso
de calidad asegurada por el proveedor)
Bqca. Alicia Irene Cuesta

56

PRODUCTIVIDAD:
Pruebas cuantitativas: la proporcin de Productividad PR
es definido como sigue:
PR = Ns /No
donde
Ns: es el recuento total de colonias obtenido en el medio de
cultivo a probar (obtenido de uno o ms placas)
No: es el recuento total de colonias obtenido en el medio de
cultivo de referencia definido obtenido de uno o ms placas
que debe ser 100 ufc.

Bqca. Alicia Irene Cuesta

57

PRODUCTIVIDAD: Pruebas cuantitativas

CRITERIO DE CONFORMIDAD:
Anexo B de la norma ISO/TS 11133-2:2000.

All figuran:
 Los microorganismos
Tiempo y temperatura de incubacin
Criterios
Medio de referencia que debe usarse segn el medio a
evaluar.
 PR debe ser mayor o igual a un valor lmite para que el
medio de cultivo sea conforme.
En general para que los medios no selectivos como el
PCA sea conforme, el PR debe ser a 0,7.
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58

PRODUCTIVIDAD:
Ejemplo Pruebas cuantitativas
Se desea evaluar la productividad del PCA.
El medio de referencia usado es agar tripticasa soya (TSA)
1) Ns ( dil -6):140 ufc
No ( dil -6): :170 ufc
PR = Ns /No
PR= 0,8 esto quiere decir que el medio testeado es conforme
2) Ns ( dil -6):100 ufc
No ( dil -6): 230 ufc
PR = Ns /No
PR= 0,4 esto quiere decir que el medio testeado
no es conforme en cuanto a su productividad.
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PRODUCTIVIDAD:
Pruebas semi-cuantitativas.

Se inocula en forma de estras diluciones del

cultivo con ansa calibrada de acuerdo a la figura o
modelo.
Las placas inoculadas se incuban a temperatura
y tiempo que depende del medio de cultivo
evaluado y se observa el crecimiento.
Se evala la productividad del medio teniendo en
cuenta el valor de cada estra con crecimiento.

Bqca. Alicia Irene Cuesta

60

PRODUCTIVIDAD :
Pruebas cualitativas
Se llevarn a cabo visualmente asignando
un score de crecimiento.
Score para medios slidos:
0 no hubo crecimiento
1 hubo crecimiento dbil
2 hubo buen crecimiento.
Score para medios lquidos:
0 no hubo turbidez
1 hubo turbidez muy tenue
2 hubo buena turbidez
Bqca. Alicia Irene Cuesta

61

SELECTIVIDAD:
Para llevar a cabo la prueba de la selectividad,
el medio de cultivo selectivo a evaluar y un medio de la
referencia se inoculan con un microorganismo y nivel
apropiado.
Se emplea una suspensin del microorganismo
de no-target que contiene 104cfu a 106cfu por ml se
inocula en la placa o en el tubo de medio.

Bqca. Alicia Irene Cuesta

62

Certificado de control
de calidad de un medio de
cultivo no selectivo

Bqca. Alicia Irene Cuesta

63

Reactivos
EVALUACIN DE LA CALIDAD DE LOS REACTIVOS:
El laboratorio debe asegurarse que
la calidad de los reactivos utilizados sea
apropiada para los ensayos realizados.
Ejemplo: Reactivos usados para revelar pruebas bioqumicas
Realizo controles positivo y negativo utilizando
microorganismos que sean trazables a colecciones de
cultivos nacionales o internacionales reconocidas.
Bqca. Alicia Irene Cuesta

64

Sntesis
En microbiologa se le da especial nfasis a la calidad de los
medios de cultivo y reactivos, tal que aquella sea apropiada
para los ensayos realizados.
Un punto crtico a tener en cuenta a la hora de implementar y la ISO
17025 y acreditar el laboratorio es la preparacin, esterilizacin y
evaluacin de la calidad de los medios de cultivo empleados para
realizar el ensayo.
Las recomendaciones internacionales de organismos de acreditacin
se basan en la Norma ISO/TS 11133-1:2000 y ISO/TS 111332:2000.
Esto implica una revisin de las prcticas cotidianas realizadas por
el laboratorio y a su vez la seguridad que los medios usados son
adecuados a la finalidad prevista.

Bqca. Alicia Irene Cuesta

65

Aseguramiento de calidad
Norma ISO 17025
CULTIVOS DE REFERENCIA

Cultivos de referencia: REQUISITO Para acreditar o mantener la

acreditacin de un ensayo, el laboratorio de microbiologa debe contar
con cultivos de referencia.
El nmero y la eleccin del gnero y especie de las mismas depender
de los ensayos que se efectan y las necesidades particulares de estos
ltimos.
El laboratorio debe elaborar e implementar un procedimiento
documentado para el uso y manejo de cultivos de referencia. Es
NECESARIOS PARA DEMOSTRAR TRAZABILIDAD.
Definicin de Material de referencia : Material o sustancia que
posee valores de una o ms propiedades suficientemente
homogneas y bien conocidas para permitir su uso en la calibracin
de aparatos, la evaluacin de un mtodo de medicin o la atribucin de
valores a estos materiales.
( COGUANOR NGR/ISO/IEC 43-1)
66
Bqca. Alicia Irene Cuesta

 Para qu son necesarios

los cultivos de referencia ?
Evaluacin de la calidad de los medios de cultivo.
Realizar controles de calidad interno durante la
ejecucin de los ensayos.
Realizar controles de calidad de reactivos.
Pruebas confirmatorias.
Ejemplo prueba de CAMP
Validar mtodos microbiolgicos.
Aseguramiento de la calidad de los resultados de
ensayo de mtodos microbiolgicos.

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67

Cultivos de referencia:
Definicin:
Trmino colectivo que se refiere
a cepas de referencia, cepas de reserva y cepas de trabajo.
Requisitos:
Clulas microbianas capaces de crecer (VIABILIDAD).
Cepas de referencia: Las colecciones suministran las cepas
con instrucciones para su recuperacin.
Se debe tratar de un cultivo puro .(PUREZA).
Genticamente estables.( ESTABILIDAD)
( mantenimiento de caractersticas genotpicas y fenotpicas)
Bqca. Alicia Irene Cuesta

68

CEPAS DE REFERENCIA:
PARA DEMOSTRAR
LA TRAZABLIDAD DEBEN OBTENERSE DIRECTAMENTE
DE UNA COLECCIN NACIONAL O INTERNACIONAL DE
CULTIVO DE REFERENCIA RECONOCIDO.
Son microorganismos definidos:
 Por lo menos a nivel de gnero y especie.
 catalogados.
 muy caracterizados.
 de origen conocido.
[ISO 11133-1:2000]
Se comercializan liofilizadas.
Los organismos de acreditacin deben considerar vlida
la fuente de dnde provino la cepa.
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69

En la prctica para cumplir con el requisito prevenir

mutaciones, deterioro o alteracin de las caractersticas
tpicas de las cepas de
el nmero de repiques a partir de la cepa de referencia
debe ser limitado
( en general es aceptado hasta 5 repiques a partir de la
cepa de referencia )
Si una cepa se adquiere por cualquier va que no sea la
propia coleccin, NO se puede mencionar utilizando el
nmero que tienen en esa coleccin, sino solamente como
derivada de la cepa de coleccin.
Bqca. Alicia Irene Cuesta

70

Cepas de coleccin
de referencia
[Link]

Bqca. Alicia Irene Cuesta

71

CEPAS DE REFERENCIA:

REGISTRO DE
CEPAS DE REFERENCIA:

Identificacin de la cepa.

Gnero y especie del microorganismo

TIPO y N de coleccin.

N de lote.

Fecha de recepcin.

Control de calidad de la cepa de
referencia Conforme (SI/NO).

Fecha de caducidad de la cepa.

Personal responsable.

Reconstitucin de las cepas de referencia:

Las Cepas de referencia ingresan al laboratorio de microbiologa se registran
en planilla segn procedimiento.
Las Cepas de referencia se almacenan entre 0-5 C hasta su uso.
Las Cepas de referencia se reconstituyen y se siembran utilizando el medio
de cultivo, las condiciones de incubacin y el procedimiento indicado en las
instrucciones para cada tipo de microorganismo del organismo proveedor de
las cepas.
En paralelo, a las Cepas de referencia, se les realiza un control de calidad
de pureza y viabilidad y se registra.

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72

Control de calidad
de pureza y viabilidad:
Se realiza a diferentes niveles del proceso. CADA VEZ QUE HAGO UN

REPIQUE.
Su finalidad es asegurarse que las cepas conservan su viabilidad y sus
caracteres bioqumicos.
Frecuencia de realizacin de este control: para las cepas de reserva
almacenadas el laboratorio la establecer en cada caso.
Registro de Control de calidad de pureza y viabilidad de las cepas:
Fecha del control.
Identificacin de la cepa. Gnero y especie del microorganismo. TIPO y N
de coleccin.
Tipo de cepa (Cepa de referencia, reserva o trabajo).
Pruebas a realizar (depende del microorganismo): Coloracin de Gram,
Caractersticas de las colonias en medios selectivos, Pruebas bioqumicas y
serolgicas, etc.
En caso de no presentar las caractersticas establecidas se ejecuta la
Acciones correctivas establecida en el procedimiento.

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Cepas de reserva:
Definicin: Cepas idnticas obtenidas mediante
un nico subcultivo de una cepa de referencia.
[ISO 11133-1:2000].
Las cepas de reserva son una serie de alcuotas de
cultivos idnticos obtenidas en el laboratorio por
subcultivo de la cepa de referencia.
CREF

REPIQUE UNICO

Cres

Cres

Cres

Cres

Cres

Cres

Las cepas de reserva las prepara y conserva el laboratorio.

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74

MTODOS
PARA
LA PRESERVACIN
Y MANTENIMIENTO
DE
CEPAS DE RESERVA
obtenidas a partir
de cepas de referencia :

A)LIOFILIZACIN.
B) CONGELACIN
A BAJAS
TEMPERATURAS.

Uso
de agentes
Crioprotectores

Cepas de reserva: Dentro del laboratorio (ver plano del laboratorio)

Debe haber un lugar destinado a almacenar las cepas de reserva.
Debe estar claramente sealado que se trata de cepas potencialmente
peligrosas y su manipulacin restringida a personal autorizado.

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75

MTODOS PARA LA PRESERVACIN Y MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA

A) LIOFILIZACIN. Definicin: es un proceso de

desecacin desde el estado congelado.

Agentes Crioprotectores:
Leche descremada de calidad microbiolgica
( esterilizacin por vapor fluente) al 10% o 20% P/V.
Pueden adicionarse Aditivos como por ejemplo inositol.
PRODUCTO: se puede conservar en refrigeracin o a
temperatura ambiente por aos.
B) CONGELACIN A BAJAS TEMPERATURAS:
Agentes Crioprotectores:
Leche descremada de calidad microbiolgica
( esterilizacin por vapor fluente) al 10% o 20% P/V.
Pueden adicionarse Aditivos como por ejemplo inositol.
Glicerol al 10%
Caldo BHI con glicerol 20%. Bqca. Alicia Irene Cuesta

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MTODOS PARA LA PRESERVACIN Y MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA

B) CONGELACIN A BAJAS TEMPERATURAS:

Proceso de congelacin:
Equipamiento o insumos para lograr la congelacin
(Congelador o cmara o uso de Nitrgeno lquido).
Temperaturas de congelacin:
Deseable a -70 o -80 C o menores temperaturas.
A temperaturas ms altas como -20 C no es lo ideal pero
tal vez sea la nica forma posible. Es preferible a -40 C.
Envases: Uso criovial o tubo estril.
PRODUCTO: se puede conservar en a temperatura
congelacin por aos.
Inconveniente: problemas y prdida de las cepas la falta
de suministro de energa, falta de insumos o avera del
equipamiento.
Bqca. Alicia Irene Cuesta

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LA PRESERVACIN Y MANTENIMIENTO
DE CEPAS DE RESERVA

MTODOS PARA LA PRESERVACIN Y MANTENIMIENTO DE

CEPAS DE RESERVA !! Es muy importante un buen mtodo de
conservacin de modo de mantener los microorganismos vivos, puros y
la cepa microbiana autntica!!
Para lo cual se debe tener en cuenta los conocimientos bsicos de
Microbiologa.
Proveer condiciones adecuadas para cada tipo de microorganismo.
Las instrucciones del fabricante de los sistemas de preservacin de
cepas disponibles comercialmente deben ser rigurosamente respetados
y observados.

En el caso de descongelamiento de las cepas de reserva no deben
volver a congelarse.

El criovial vencido se elimina del cepario y se registra.

Las cepas liofilizadas una vez reconstituidas no se pueden volver a
usar
Bqca. Alicia Irene Cuesta

78

FACTORES QUE AFECTAN

LA VIABILIDAD DE LA CEPA
La viabilidad de las cepas, sometidas a un proceso de congelacin
(para su almacenamiento), est determinada por los siguientes factores:
a)Tipo de cepa. Ejemplo las bacterias Gram positivas resisten mejor que las
Gram negativas.
b) El cultivo debe estar en las mejores condiciones posibles antes de ser
expuesto a bajas temperaturas.
Condiciones necesarias antes de ser expuesto a bajas temperaturas:
1. La EDAD DEL CULTIVO puede afectar la capacidad del microorganismo de
sobrevivir.
Cultivos demasiados jvenes o demasiado viejos son menos resistentes al
shock trmico.
Ideal es fin etapa logartmica principio fase estacionaria tiene mayor
probabilidad de recuperacin.
( en bacterias en general es 24 horas de incubacin a 37 C)
2. Las CONDICIONES DE DESARROLLO tambin juegan un papel importante
Ejemplo; Las levaduras que crecen aireadas y agitadas tienen mayor resistencia
a la temperatura que aquellas que desarrollan en un medio slido

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79

Ejemplo: Supervivencia de los microorganismos

almacenados a 20 C en Mast Cryobank
Referencia: Mast Cryobank TM, ETICOR

Microorganismo
Enterobacter aerogenes
Pseudomona aeruginosa
Salmonella typhimurium
Staphylococcus aureus
Listeria monocytogenes
Listeria ivanovii
Rhodococcus equi
Bacillus cereus
Clostridium perfringes

Supervivencia en
meses
48
18
48
48
48
48
48
24
48

Bqca. Alicia Irene Cuesta

80

Cepas de trabajo:
Subcultivos de microorganismos obtenidos a partir de las
cepas de reserva para ser utilizados en los ensayos que lo
precisen.
Obtencin de cepas de trabajo:
Los cultivos de trabajo se obtienen a partir de la Cepas de
reserva sobre un medio slido o lquido no selectivo adecuado
utilizando un ansa estril e incubando en condiciones adecuadas.
 Las cepas de trabajo no deben ser subcultivadas.

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81

CEPA DE REFERENCIA
Reconstitucin
Cultivada una sola vez

*
Obtencin de CEPAS DE RESERVA
Conservacin por distintos mtodos
( liofilizacin y congelacin)
(especificar tiempo y condiciones de almacenamiento)

Esquema de
cultivos de
referencia:
*Controles de
pureza y pruebas
bioqumicas de la
cepa.
Referencia:
Gua ENAC-04

Descongelacin/reconstitucin

CEPAS DE TRABAJO
(especificar tiempo y condiciones de almacenamiento)

Utilizacin en el control de calidad, validacin, etc de los ensayos

Bqca. Alicia Irene Cuesta

82

PASOS a seguir para el

manejo de los cultivos de referencia:
PROVEEDOR DE CEPA

LABORATORIO

LABORATORIO

LABORATORIO

Adquisicin de cepa de referencia (C Ref):

-Requisitos de compra y Registro de la cepa adquirida.
Subcultivo de C Ref:
-Control de pureza y viabilidad (REGISTRO).
Preparacin de la cepa de reserva (Cres)
-Control de pureza y viabilidad peridicos (REGISTRO).
-Registro de cada frasco de la nueva cepa de reserva
Incorporada al cepario.
CONDICIONES CONTROLADAS DE
ALMACENAMIENTO DE LA CEPA DE RESERVA
Subcultivo la cepa de reserva (C t):
-Control de pureza y viabilidad (REGISTRO).
USO PARA CONTROLES DE CALIDAD

Bqca. Alicia Irene Cuesta

83

Aseguramiento de calidad
Norma ISO 17025
EQUIPOS
REQUISITOS: EQUIPOS

El laboratorio debe estar provisto de todos los equipos

necesarios para la correcta ejecucin del ensayo.
Los equipos y su soporte lgico usados en la realizacin del
ensayo y muestreo deben permitir lograr la EXACTITUD
REQUERIDA y cumplir con las especificaciones establecidas
para los ensayos.
Hay equipos cuya exactitud es clave en el impacto sobre la
incertidumbre de los resultados, por lo que es imprescindible que
cumplan siempre con las especificaciones ms relevantes del
mtodo.

Bqca. Alicia Irene Cuesta

84

Equipos habituales
de un laboratorio microbiolgico :
Material de uso general: Material de vidrio o plstico
(Ejemplo: tubos de ensayo, placas de Petri, etc.),
instrumentos de muestreo, ansas de siembra, etc.
Equipos volumtricos como pipetas, distribuidores
automticos, sembradores en espiral, etc.
Instrumentos de medida: termmetros, cronmetros,
balanzas, medidor de pH, contadores de colonias, etc.
Estufas, autoclaves, baos termostticos, heladeras,
congeladores, campanas de flujo laminar, equipos de
filtracin, etc.
Bqca. Alicia Irene Cuesta

85

Calibracin.
Definicin: Conjunto

de operaciones que
PERMITEN ESTABLECER,
en condiciones especificadas,
LA RELACIN EXISTENTE ENTRE :
los valores indicados por
el instrumento de medida o
un sistema de medida
o un material de referencia
y
los correspondientes valores conocidos del
mensurando.(valores de una magnitud obtenidos
mediante un patrn de referencia)
Bqca. Alicia Irene Cuesta

86

Calibracin:

Formas de establecer esta relacin es mediante:

Tablas de correccin
Rectas o curvas de calibracin
otras
CALIBRACION
Elimina el error
CORRECCION

Incertidumbre
Bqca. Alicia Irene Cuesta

87

Ejemplo:
Calibracin de un termmetro
Qu hago?
[Link] n veces a una
Temperatura y completo la
TABLA 1.
[Link] lo realizo para
diferentes temperaturas (Ti)
segn los requerimientos.
3. Calculo la correccin e
incertidumbre para cada
punto.
Tx

TABLA 1
Termmetro a calibrar (Tx)
Termmetro patrn (Tp)
Termmetro
a calibrar
(C)

Termmetro
patrn
(C)

Tp

Bao de agua
Bqca. Alicia Irene Cuesta
El bao se pone a Ti

88

Certificado de calibracin
de un termmetro
Ejemplo de resultados

Indicacin del
termmetro
( C)

Correccin
( C)

Incertidumbre
( C)

5.5

-0.4

+0.1

30.0

0.2

+0.2

36.8

0.2

+0.2

42.1

0.0

+0.3

Bqca. Alicia Irene Cuesta

89

Certificado de calibracin
de un termmetro
Debe figurar:

Descripcin e identificacin del
instrumento que se calibr.

Fecha de calibracin.

Fecha de emisin del certificado de
calibracin nombre del cliente

Metodologa empleada para calibrar.

Rango de calibracin.

Resultados: correccin e incertidumbre
para cada temperatura.

Bqca. Alicia Irene Cuesta

90

Incertidumbre de la medicin. Definicin: Parmetro

asociado al resultado de la medicin, que caracteriza la
dispersin de los valores que podran ser razonablemente
asignados al mensurando. INDICA LA CALIDAD DE UNA
MEDICIN.

Tolerancia. Definicin: Indica el rango de variabilidad

aceptable para un dado valor. Es un concepto asociado con
la especificacin.
Relacin de exactitud (RE)
RE = Especificacin
Incertidumbre

ISO 100012 recomienda RE>3:1, preferiblemente hasta 10:1

Bqca. Alicia Irene Cuesta

91

VERIFICACIN.
Definicin: Confirmacin por examen y provisin de
evidencia de que los requerimientos especificados han
sido satisfechos.
Ejemplo: Verificar diariamente una balanza con una pesa calibrada.
Verificacin del instrumento de medicin
VERIFICACIN
Asignar a la
tarea de medicin
TOMO
DECISION

Reparar/ ajustar

Usarlo para otro equipo

Declararlo fuera de uso
Bqca. Alicia Irene Cuesta

92

REQUISITOS: EQUIPOS (cont)

Antes de poner en servicio un equipo se lo debe calibrar o
verificar con el fin de asegurar que responde a las exigencias
especificadas del laboratorio y est conforme a las
especificaciones normalizadas pertinentes.
El equipo debe ser verificado o calibrado antes de su uso.
El laboratorio debe documentar e implementar Programas
para calibracin y/o verificacin limpieza, mantenimiento y
esterilidad de los equipos cuando sea necesario. (Los que
tengan una influencia directa en los resultados de los ensayos).
REQUISITOS PROVEEDORES DE CALIBRACION DE
EQUIPOS:
La calibracin de los equipos debe ser llevada a cabo por
laboratorios de calibracin que demuestren su competencia y
su capacidad de medicin y trazabilidad (Laboratorio acreditado o
aceptado por el organismo de acreditacin).
Bqca. Alicia Irene Cuesta

93

Tipo de Equipamiento

Requisitos
Recalibrado y plenamente
trazable
Recalibrado y plenamente
trazable
Frente a un termmetro de
referencia en punto de
congelacin y/o rangos de
temperatura de trabajo
Frente a un termmetro de
referencia en punto de
congelacin y/o rangos de
temperatura de trabajo
Calibracin plenamente
trazable

Frecuencia sugerida

Pesas de calibracin

Calibracin plenamente
trazable

Bianualmente/
Anualmente.

Pesas de control

Frente a pesa calibrada o

verificar en la balanza
Anualmente.
inmediatamente despus de
la calibracin trazable

Microscopios

Calibracin trazable al
micrmetro (cuando sea
apropiado)

Inicialmente

Centrifuga

Calibracin trazable o
verificacin con un
tacmetro independiente

Anualmente.

Cronmetro

Frente a la hora oficial

Anualmente.

Termmetro de referencia
Termocupla de referencia

Termmetro de trabajo

Termocupla de trabajo

Balanza

Cada 5 aos
Anualmente.

Anualmente.

Directrices para calibracin

de equipos en el laboratorio
de microbiologa.

Anualmente.

Anualmente.

G-ENAC-04. Gua para la

acreditacin de laboratorios
que realizan anlisis
microbiolgicos

Bqca. Alicia Irene Cuesta

94

REQUISITOS: EQUIPOS (cont)

Es de primordial importancia que el laboratorio cuente con un programa
formal, documentado e implementado de mantenimiento de equipos.
El mantenimiento de los equipos esenciales debe realizarse a intervalos
especificados.
(por el departamento de mantenimiento, por el proveedor, fabricante, etc).
En el documento ISO 7218: 1996 (E), se facilitan directrices sobre el
mantenimiento de los equipos.
PARA CADA EQUIPO UTILIZADO EN LOS ENSAYOS EL LABORATORIO
DEBE TENER:

Identificacin inequvoca y registro del equipo (con su soporte lgico o
software).

Los resultados de las calibraciones y verificaciones.

Las instrucciones actualizadas de uso y mantenimiento del equipo
disponibles (incluido el manual suministrado por el fabricante) para el uso del
personal del laboratorio.

Bqca. Alicia Irene Cuesta

95

Autoclave
Los controles biolgicos:
Evalan la efectividad de la totalidad del proceso de
esterilizacin.
Contienen esporas
de gnero Bacillus.
En todos los casos los resultados obtenidos de
controles qumicos y biolgicos se deben registrar.

Bqca. Alicia Irene Cuesta

96

Verificacin de la
temperatura de trabajo:
Registro de control de
temperatura:

Se realiza un monitoreo
continuo de las
temperaturas de las estufas,
-Equipo.
heladeras, congeladores
usados para la realizacin
-N de inventario.
del ensayo.
-Instrumento:
Correccin e
La temperatura del bao
incertidumbre del
termosttico se registra
termmetro.
antes de su uso.
-Rango de aceptacin.
-Tolerancia.
Bqca. Alicia Irene Cuesta

97

Aseguramiento de calidad
Norma ISO 17025
MANIPULACIN DE LAS MUESTRAS

El laboratorio debe tener procedimientos para :

El transporte

La recepcin

La proteccin, el almacenamiento.

La manipulacin

La conservacin o la disposicin final de las
muestras a ensayar.
Bqca. Alicia Irene Cuesta

98

MANIPULACIN DE LAS MUESTRAS

Requisitos:
MUY IMPORTANTE: El laboratorio debe tener un sistema
para la identificacin unvoca de las muestras a ensayar.
La identificacin debe ser conservada a lo largo de la vida
de la muestra en el laboratorio.
El sistema debe ser diseado y operado de modo tal que
asegure que las muestras no puedan ser confundidas
fsicamente o cuando se haga referencia a ellas en registros u
otros documentos.
El laboratorio debe tener procedimientos e instalaciones
apropiadas para evitar el deterioro, la prdida o dao de
las muestras durante su manipulacin, preparacin y
almacenamiento.
Bqca. Alicia Irene Cuesta

99

MANIPULACIN DE LAS MUESTRAS

REQUISITOS:
RECEPCIN DE LAS MUESTRAS: Las condiciones de llegada al
laboratorio de las muestras deben ser verificadas por el personal
perteneciente al mismo.
Si la muestra es:
Insuficiente o
se encuentra en mal estado por deterioro fsico, temperatura
inapropiada, envase roto o etiquetado defectuoso.
El laboratorio debe consultar con el cliente antes de decidir si analiza o
rechaza la muestra.
Debe indicar su estado en el informe del ensayo.
Una vez recibidas las muestras se analizarn lo antes posible.
La preparacin de las muestras y porciones de ensayo realizado por el
laboratorio inmediatamente antes del ensayo debe efectuarse conforme a
procedimientos documentados basados en normas nacionales o
internacionales, si es que existen, o a mtodos internos validados.
Los procedimientos de preparacin de las muestras y porciones de
ensayo deben disearse teniendo en cuenta las directrices generales
contenidas en los documentos en ISO 6887 e ISO 7218.
Bqca. Alicia Irene Cuesta

100

MANIPULACIN DE LAS MUESTRAS

REQUISITOS:
Se debe llevar los registros del desarrollo del trabajo.
Las muestras que se encuentren a la espera de ser analizadas
deben almacenarse en condiciones adecuadas para reducir al
mnimo cualquier modificacin en la poblacin microbiana presente.
Debe existir un procedimiento documentado para la conservacin
y eliminacin de muestras.
Las muestras deben conservarse hasta que se hayan obtenido
los resultados del ensayo, o ms tiempo segn sea necesario.
Cuando se sepa que algunas porciones de muestras de ensayo
del laboratorio estn altamente contaminadas, deben
descontaminarse antes de su eliminacin.

Bqca. Alicia Irene Cuesta

101

Los tiempos lmites de almacenamiento

dependern del tipo de producto
Referencia: Norma ISO 7218:1996 (E)

(1) Si no se puede procesar

en ese tiempo, las muestras
se pueden congelar por
debajo -18 C.
Esto debe ser mencionado en
el informe de ensayo.
Precaucin: En algunos
productos el congelamiento
produce un cambio de la
composicin de la flora.

Tipos de Productos

Estables

Fresco o refrigerados
Pasteurizados y
productos similares
Unidades estables
daadas

Tiempos lmites de
almacenamiento (horas)
Tan rpido como sea
posible y
antes de su fecha de
vencimiento
dentro de 24 horas de la
recepcin la muestra (1)
Tan rpido como sea
posible y
antes de su fecha de
vencimiento
Tan rpido como sea
posible y dentro de 48
horas

Bqca. Alicia Irene Cuesta

102

Aseguramiento de calidad
Norma ISO 17025
ENSAYOS INTRALABORATORIOS
ENSAYOS INTERLABORATORIOS

CONTROL DE CALIDAD: Es la combinacin de sistemas, procedimientos,

actividades, instrucciones y estudios que realiza la organizacin para
controlar y mejorar las operaciones llevadas a cabo. Ejemplo: monitoreo
del ambiente, capacitacin del personal, evaluacin de la calidad y esterilidad de los medios
de cultivo, calibracin, verificacin y mantenimiento de equipos

ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD: Es un sistema de actividades que

dan confianza que los sistemas de control de calidad funcionan y
permiten con eficacia obtener resultados analticos de alta calidad.
Es un programa de actividades llevadas a cabo por el laboratorio con la
finalidad de verificar que los resultados obtenidos tienen una precisin y
exactitud aceptable
y mejorar en conjunto el funcionamiento del mismo.
Estos programas son planificados y revisados peridicamente
Ejemplo es participacin en ensayos intralaboratorios e interlaboratorios

Bqca. Alicia Irene Cuesta

103

ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD
DE LOS RESULTADOS
Dicho programa debe abarcar todos los ensayos incluidos en el
alcance de acreditacin del laboratorio.
La frecuencia de realizacin de cada uno de estos Programas queda
establecida por el laboratorio.
ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DE LOS RESULTADOS DE
ENSAYO: El laboratorio debe tener procedimientos de control de
calidad para monitorear la validez de los ensayos llevados a cabo.
Son las actividades que se deben realizar para todos los ensayos
acreditados.
Comprenden:
1. Control interno: Un programa de controles peridicos es necesario
para demostrar que se controla la variabilidad (por ejemplo, entre
analistas y entre equipos o materiales, etc.). Permite la evaluacin
continua del trabajo el laboratorio.
2. Control externo (intercomparaciones):
La participacin en Ensayos de Aptitud Interlaboratorio (Proficiency
Testing) permite la evaluacin del sesgo de forma que el laboratorio
pueda demostrar que se mantiene dentro de los criterios de
aceptacin definidos por normas, reglamentos, por el cliente o por el
laboratorio.
104
Bqca. Alicia Irene Cuesta

Control interno:
El principal objetivo es asegurar la coherencia de los resultados
obtenidos diariamente y el cumplimiento de los criterios establecidos.
Control de las condiciones de trabajo: proporciona informacin
sobre la buena prctica en la realizacin de los ensayos y sobre la
esterilidad de los medios y materiales auxiliares utilizado. Evala la
posible contaminacin cruzada. Ejemplo: muestras estriles o control de
esterilidad.

ENSAYOS CUANTITATIVOS
Control de la precisin: muestras naturales sin inocular y/o
muestras naturales inoculadas con materiales de referencia.
Control de recuperacin: muestras inoculadas con materiales de
referencia.
ENSAYOS CUALITATIVOS
 El Control de la calidad interno debe incluir actividades que
garanticen un adecuado control del lmite de deteccin.
Bqca. Alicia Irene Cuesta

105

Control interno:
Uso de cepas de referencia: Empleo de cepas de referencia
durante la realizacin del ensayo como control positivo, negativo,
muestras inoculadas para control.
ENSAYOS INTRALABORATORIO: Son las verificaciones de calidad
para evaluar el desempeo de los analistas del laboratorio en un
ensayo.
Mtodos cuantitativos: Se comparan los resultados obtenidos :
 Por cada analista perteneciente al laboratorio que realiza por
duplicado el anlisis de la muestra (repetibilidad de cada analista).
 Entre analistas del mismo laboratorio para un ensayo
(reproducibilidad entre analistas).
Mtodos cualitativos: verifico que los resultados entre analistas sean
concordantes y conformes.
Se comparan los resultados obtenidos entre analistas del mismo
laboratorio para un ensayo.
Bqca. Alicia Irene Cuesta

106

ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD
DE LOS RESULTADOS

LOS CONTROLES DE CALIDAD INTERNOS NO SON

SUFICIENTES.
No puedo determinar mediante ellos el Valor verdadero!!
Realizo un Control de calidad externo.
Definiciones:
Valor verdadero : valor en consistencia con la definicin de una
magnitud (concepto abstracto, no realizable).
Valor asignado o valor de referencia: es el valor
convencionalmente verdadero.
Exactitud de una medicin: Proximidad entre el resultado de una
medicin y el valor verdadero del mensurando.

Bqca. Alicia Irene Cuesta

107

Ejemplo:
Precisin. Justeza y Exactitud

Resultados imprecisos y justos:

No exactos

Resultados precisos y No justos:

No exactos

Resultados precisos y justos:

exactos
108
Bqca. Alicia Irene Cuesta

Resultados imprecisos y No justos:

No exactos

Clculo del valor de referencia o valor asignado:

 Uso un material de referencia certificado.
Casi nunca son estos los casos en ensayos microbiolgicos.
 Se considera que el valor medio obtenido por el conjunto de
laboratorios luego de eliminar los outliers en el propio ejercicio puede
utilizarse como valor de referencia o valor verdadero.
Ensayos de Aptitud Interlaboratorio (Proficiency Testing) :
Los programas de ensayos de aptitud organizados externamente por
un proveedor de ensayos interlaboratorio
CONSTITUYEN UN MEDIO INDEPENDIENTE por el cual un
laboratorio se puede EVALUAR OBJETIVAMENTE
y demostrar la veracidad y precisin de los resultados obtenidos por
sus mtodos analticos.

Bqca. Alicia Irene Cuesta

109

Ensayos de Aptitud Interlaboratorio (Proficiency Testing) :

Constituye una herramienta para la evaluacin externa de la calidad
de los resultados de ensayo o desempeo del laboratorio.
La participacin en estos ensayos PERMITE AL LABORATORIO
COMPARAR SUS RESULTADOS FRENTE A LOS DE OTROS
LABORATORIOS.
Los laboratorios deben participar regularmente en ensayos de
aptitud relacionados con el alcance de su acreditacin, dando
preferencia a los programas de ensayos de aptitud que utilicen
matrices apropiadas.
Cuando los resultados de los ensayos NO resultan dentro del
intervalo de conformidad o se visualice una tendencia determinada
tomar respectivamente acciones correctivas o preventivas, siguiendo
los lineamientos establecidos en el Procedimiento Reclamos,
sugerencias, no conformidades, acciones correctivas y acciones
preventivas.

Bqca. Alicia Irene Cuesta

110

fa
ct
o

Clasificacin
Satisfactorio
Cuestionable
Insatisfactorio

in
sa
tis

Valor de Z-score:
lzl<2
2 < lzl < 3
lzl >3

Z-

cu
rio
es
tio
na
bl
sa
e
tis
fa
ct
or
sa
io
tis
fa
ct
or
sa
io
tis
fa
ct
or
cu
io
es
tio
na
in
bl
sa
e
tis
fa
ct
or
io

Ensayos de Aptitud
Interlaboratorio
Mtodos cuantitativos
(Proficiency Testing) :

STAPHYLOCOCCUS aureus - cereal

Z-score-2=5257ufc/g valor asignado=21000ufc/g
score+2=83891ufc/g
80
70
60
50
40
30
20
10
0

Bqca. Alicia Irene Cuesta

111

Ensayo:
Matriz:

Proveedor del
Ensayo
Interlaboratorio

Registro Ensayos de Aptitud Interlaboratorio

Ensayos cualitativos (Proficiency Testing) :

Identificacin
de las
Muestras

Fecha de
anlisis
de las
muestras

Analista

Metodologa
usada por el
laboratorio

Resultado
obtenido
por el
laboratorio

Valor
asignado

Clasificacin
obtenida
Satisfactorio
/Insatisfactorio

Bqca. Alicia Irene Cuesta

Firma del
responsable

112

IMPORTANTE!!!
Los datos obtenidos a
travs
del programa el
aseguramiento de la calidad
deben ser registrados en
forma tal
que se puedan detectar las
tendencias
y aplicar tcnicas
estadsticas
para la revisin de los
resultados.
Bqca. Alicia Irene Cuesta

113

Periodicidad de las actividades

de control de calidad
Se deben establecer considerando diversos factores:
La robustez del mtodo utilizado ( en funcin de los
controles especficos incluidos en el mismo, empleo de
placas duplicadas, mtodo de referencia o de rutina,
datos de validacin, etc)
La frecuencia con la que el laboratorio ejecuta dichos
ensayos.
Los resultados histricos de control de calidad y
aseguramiento de calidad.

Bqca. Alicia Irene Cuesta

114

Validacin de los mtodos

microbiolgicos
Norma ISO 17025

Objetivos Generales a desarrollar:

Intentaremos contestar las siguientes preguntas:

Qu es validar un mtodo?
Por qu y para qu valido un mtodo?
Cmo valido un mtodo?
Cundo valido un mtodo?

Bqca. Alicia Irene Cuesta

115

Ejemplo: Un laboratorio dise una nueva metodologa

para la deteccin de E coli O157:H7 basada en el uso de
anticuerpos monoclonales para evaluar la inocuidad y
calidad de alimentos crnicos.

Qu caractersticas tendrn que tener los resultados
que arroja dicho mtodo?

Puedo emplearlo inmediatamente para emitir
resultados que impliquen una decisin de conformidad o
no con las especificaciones alimentarias vigentes?

Bqca. Alicia Irene Cuesta

116

La respuesta es:
Antes de usar un mtodo debo asegurarme que haya sido validado

Necesito que el mtodo sea:
Adecuado para el propsito.
Los datos que arroja un ensayo le permiten al usuario
tomar decisiones tcnica y administrativamente correctas
para un propsito preestablecido.
La Norma ISO 17025 en el punto 5.4.2 establece que El laboratorio debe
utilizar mtodos de ensayo que satisfagan las necesidades del cliente y sean
apropiadas para el uso previsto
Definiciones:
Validacin: Confirmacin, mediante el aporte de pruebas objetivas, de que
se han cumplidos los requisitos para el uso pretendido o una aplicacin
especfica.[ISO 9000: 2000]
Verificacin: Confirmacin, mediante el aporte de pruebas objetivas, de que
se han cumplido los requisitos establecidos. [ISO 9000:2000]
Demostracin por experimento que un mtodo establecido funciona de
acuerdo con las especificaciones en las manos del usuario.

Bqca. Alicia Irene Cuesta

117

 Por qu y para qu
es necesario
validar un mtodo?
Respuesta:
El laboratorio microbiolgico tiene la responsabilidad de garantizar
que los resultados que l produce son exactos, validos y confiables
de modo de proporcionar informacin til acerca de la inocuidad y
calidad sanitaria de los alimentos.
Si el resultado de un ensayo no es confiable, el ensayo no
presenta ninguna utilidad y sera mejor no realizarlo.
Cuando un cliente recurre a un laboratorio microbiolgico a solicitar
un anlisis, lo hace porque necesita resolver un problema
y no puede hacerlo por s mismo y espera poder confiar en los
resultados.
PARA SABER SI ESE ENSAYO SIRVE PARA LO QUE LO
QUIERO USAR.
PARA CONOCER EL COMPORTAMIENTO DEL MTODO.
Bqca. Alicia Irene Cuesta

118

Evidencias objetivas: Cmo puedo aportarlas?

En el marco de un adecuado criterio microbiolgico, tengo
dos herramientas fundamentales que permiten sacar
conclusiones:

Diseo de experimentos estadsticamente vlidos.

Anlisis de los resultados usando mtodos estadsticos.
Antes de realizar la validacin se deben especificar:
ALCANCE:

Matriz

Concentracin en la que se aplica.
Se deben declarar los CRITERIOS DE APTITUD PARA
LOS FINES (teniendo en cuenta los requisitos particulares
para un uso especfico previsto).
Bqca. Alicia Irene Cuesta

119

Buenos resultados del ensayo

Se identifican 6 principios de la prctica analtica, los cuales cuando se
implementan simultneamente conducen a una buena prctica:
[Link] mediciones analticas deben hacerse de forma tal que satisfagan
un requerimiento acordado (un objetivo definido)
[Link] realizarse utilizando mtodos y equipos que hayan sido
probados para asegurar que son aptos para un determinado
propsito.
[Link] personal que realiza las mediciones debe ser competente y
estar calificado.
Debe haber una verificacin independiente (externa) y peridica de
la competencia tcnica del laboratorio.
5. Las mediciones analticas realizadas en un laboratorio deben ser
consistentes con las que se realizan en cualquier otro lugar.
6. Los laboratorios que realicen ensayos deben tener procedimientos
bien definidos de control de calidad y de aseguramiento de la
calidad.
Bqca. Alicia Irene Cuesta

120

MTODO DE REFERENCIA. Definicin:

Mtodo investigado a fondo, que describe con claridad y
exactitud las condiciones y los procedimientos
necesarios para medir los valores de una o ms
propiedades.

Que ha demostrado tener una exactitud y una precisin
apropiadas para el uso que pretende hacerse del
mismo, de manera que puede utilizarse para evaluar la
exactitud de otros mtodos empleados para realizar la
misma medicin y, en particular, para caracterizar un
material de referencia.

En general se trata de un mtodo normalizado nacional
o internacional.
Bqca. Alicia Irene Cuesta

121

En nuestro caso ejemplo:

La presencia de [Link] O157:H7 en un alimento puede ocasionar, para
un determinado grupo poblacional, enfermedad y muerte.
Tambin, cuando se desee comercializar, la partida de alimento ser
rechazada en los sitios de control provocando un dao econmico y de
prdida de imagen. PROBLEMAS DE INOCUIDAD Y CALIDAD.
Por lo tanto, este mtodo propio desarrollado por el laboratorio debe
ser capaz de:

Detectar ese microorganismo.

Detectar la presencia del microorganismo en muy pequeas
cantidades.

Dar los mismos resultados cuando lo repito.

Detectar la presencia de ese microorganismo y no de otro.
Bqca. Alicia Irene Cuesta

122

Validacin Mtodos de
ensayo microbiolgicos
CUALITATIVOS
1 Descripcin detallada del mtodo de ensayo.
Deben ser validados estimando, cuando sea apropiado:

LMITE DE DETECCIN
SENSIBILIDAD

ESPECIFICIDAD

DESVIACIN POSITIVA Y DESVIACIN NEGATIVA

EFECTO MATRICIAL

EXACTITUD RELATIVA
REPETIBILIDAD Y REPRODUCIBILIDAD
Bqca. Alicia Irene Cuesta

123

Validacin
Mtodos de ensayo microbiolgicos
CUANTITATIVOS
1 Descripcin detallada del mtodo de ensayo.
Deben ser validados estimando, cuando sea apropiado:
LMITE DE CUANTIFICACIN.

EXACTITUD
REPETIBILIDAD Y REPRODUCIBILIDAD
DESVIACIN POSITIVA Y DESVIACIN NEGATIVA

SENSIBILIDAD

ESPECIFICIDAD
Bqca. Alicia Irene Cuesta

124

LMITE DE DETECCIN

Definicin: Es el nmero mnimo de microorganismos

que pueden ser detectado por el mtodo, pero en
cantidades que no pueden estimarse con precisin.
(Aplicado a anlisis microbiolgicos cualitativos)

Los resultados de los anlisis cualitativos deben
expresarse como : detectado/no detectado en una
cantidad o volumen definidos.

Determino el lmite de deteccin antes de evaluar la
sensibilidad.

Bqca. Alicia Irene Cuesta

125

Ejemplo: DISEO DE EXPERIMENTO

MTODO MICROBIOLGICO
Matriz naturalmente o artificialmente
contaminada

Mtodo a
validar

Mtodo de
referencia

Target 1

Target 2

Target 3

Target 4

Target 5

NO Target 1

NO Target 2

NO Target 3

NO Target 4

NO Target 5

Bqca. Alicia Irene Cuesta

126

Ejemplo: DISEO DE EXPERIMENTO

MTODO MICROBIOLGICO

Resultado del
mtodo
a validar
Positivo

Resultado
asignado
POSITIVO*

Resultado
asignado
NEGATIVO *

Total

+/+ (PV)

+/- (DP)

PV + DP

Negativo

-/+ (DN)

-/- (NV)

DN + NV

Total

PV + DN

DP + NV

*por mtodo de referencia o

por inoculacin de cepa de referencia.

Bqca. Alicia Irene Cuesta

127

Desviacin negativa (DN). Definicin: Ocurre cuando

el mtodo a validar da un resultado negativo sin confirmacin y
el mtodo de referencia da un resultado positivo.
Esta desviacin se convierte en un resultado negativo falso cuando
puede demostrarse que el resultado verdadero es positivo.
DESVIACIN POSITIVA (DP). Definicin: Ocurre cuando:
el mtodo a validar da un resultado positivo sin confirmacin y
el mtodo de referencia da un resultado negativo.
Esta desviacin se convierte en un resultado positivo falso cuando
puede demostrarse que el resultado verdadero es negativo.
FALSOS POSITIVOS: es la probabilidad que el ensayo arroje un
resultado positivo cuando la muestra no contiene el analito.
F + = DPc/ DP + NV = 1- ESPECIFICIDAD
FALSOS NEGATIVOS: es la probabilidad que el ensayo arroje un
resultado negativo cuando la muestra contiene el analito.
F - = DNc/ DN + PV = 1- SENSIBILIDAD
Bqca. Alicia Irene Cuesta

128

SENSIBILIDAD:
Definicin: Fraccin del nmero total de cultivos o colonias POSITIVOS
que son correctamente asignados con el mtodo
utilizado. [ISO 13843:2000]
Sensibilidad %= PV/(DN c + PV) x100
Capacidad del mtodo de dar positivo cuando las muestras tienen el
analito
Resultado del caso ejemplo: Sensibilidad %= 3/5x100= 60%

ESPECIFICIDAD:
Definicin: Fraccin del nmero total de cultivos o colonias
NEGATIVOS que son correctamente asignados con el mtodo
utilizado. [ISO 13843:2000]
Especificidad %= NV/(DPc + NV) x100
Capacidad del mtodo de dar negativo cuando las muestras no tienen el
analito
Resultado del caso ejemplo: Especificidad %= 4/5x100= 80%
Bqca. Alicia Irene Cuesta

129

EXACTITUD RELATIVA.
Definicin: Grado de concordancia entre los resultados
del mtodo evaluado y los obtenidos utilizando un mtodo
de referencia reconocido
EXACTITUD RELATIVA %= PV + NV/(PV + NV + DN + DP) x100

LMITE DE CUANTIFICACIN.
Definicin: Nmero mnimo de microorganismos dentro
de una variabilidad definida que puede determinarse en
las condiciones experimentales del mtodo evaluado.
Tengo en cuenta la incertidumbre del mtodo para valores
bajos.
(Aplicado a anlisis microbiolgicos cuantitativos)
Bqca. Alicia Irene Cuesta

130

Repetibilidad (r). Definicin: Grado de

concordancia entre los resultados de sucesivas
mediciones del mismo mesurando realizadas en las
mismas condiciones de medicin.
Reproducibilidad (R). Definicin: Grado de
concordancia entre los resultados de sucesivas
mediciones del mismo mesurando realizadas en
diferentes condiciones de medicin.
El ensayo se realiza sobre el mismo material de ensayo
pero en diferentes condiciones.

Bqca. Alicia Irene Cuesta

131

ROBUSTEZ definicin: insensibilidad de un mtodo

analtico a pequeos cambios en el procedimiento. Para
examinar la robustez es aconsejable abusar del mtodo en
un camino controlado.
ESTIMACIN DE LA INCERTIDUMBRE DE MEDICIN
EN MICROBIOLOGA: la incertidumbre de medicin es un
parmetro asociado al resultado de la medicin,
que caracteriza la dispersin de los valores que
podran ser razonablemente asignados al
mesurando.(mtodo cuantitativo)

Bqca. Alicia Irene Cuesta

132

INCERTIDUMBRE DE MEDICIN Y
CUMPLIMIENTO DE ESPECIFICACIONES

A Declaracin de no cumplimiento con la especificacin.

B y C Limitarse a informar los resultados y su incertidumbre
(INDETERMINADO)
D Declaracin de cumplimiento con la especificacin.

Rango de especificacin

Bqca. Alicia Irene Cuesta

133

En nuestro caso ejemplo:

Ensayo de Deteccin de [Link] O157:H7 en un alimento
Dijimos que:

Necesito un mtodo capaz de detectar ese
microorganismo=Sensibilidad

Necesito un mtodo capaz de detectar la presencia del
microorganismo en muy pequeas cantidades.= Lmite
de deteccin

Realizo muchas veces el mtodo y los resultados del
ensayo se repitan = repetibilidad y reproducibilidad

Necesito un mtodo capaz de detectar la presencia de
ese microorganismo y no de otro = Especificidad

Bqca. Alicia Irene Cuesta

134

PROTOCOLO DE VALIDACIN

El laboratorio acuerda con el cliente el mtodo a usar
para realizar un ensayo.

El laboratorio debe usar los mtodos y procedimientos
ms apropiados dentro de su alcance para todos los
ensayos.
Caractersticas que se tienen en cuenta para
seleccionar el mtodo de ensayo:

Propiedades analticas: precisin, exactitud,
especificidad, sensibilidad, el lmite de cuantificacin y/o
de deteccin, los efectos matriciales

Facilidad de uso o automatizacin.

Rapidez de anlisis o respuesta.

Costo.

Mtodo normalizado
Bqca. Alicia Irene Cuesta

135

PROCESO DE VALIDACION

METODO A VALIDAR

DISEO Y
EJECUCION
DE ENSAYOS

DATOS

METODO VALIDADO
COMPARACION
CON
REQUISITOS
DE USO
PREVISTO

ANALISIS
ESTADISTICO
Bqca. Alicia Irene Cuesta

136

Definicin de mtodo alternativo:

Es un mtodo de anlisis que demuestra o estima un
analito (un microorganismo, sus componentes o su
producto), para una categora dada de productos, como lo
hace su correspondiente mtodo de referencia.
El mtodo alternativo exhibe atributos apropiados a las
necesidades de los usuarios, por ejemplo:
- la velocidad de anlisis y/o respuesta;
- la facilidad de ejecucin y/o automatizacin;
- las propiedades analticas (la precisin, exactitud, el
lmite de deteccin, etc.);
- la miniaturizacin;
- el reduccin de costo.
Bqca. Alicia Irene Cuesta

137

Qu mtodos se validan?
LOS MTODOS basados en normas.
LOS MTODOS QUE DISEA O DESARROLLA EL LABORATORIO.
LOS MTODOS NORMALIZADOS EMPLEADOS FUERA DEL
ALCANCE PREVISTO.
Verifico USO MTODOS OFICIALES, MTODOS NORMALIZADOS O
MTODOS DE ORGANISMOS NACIONALES O INTERNACIONALES
RECONOCIDOS.
es recomendable la utilizacin de mtodos normalizados o de
referencia,
siempre y cuando stos estn disponibles
y sean apropiados
Bqca. Alicia Irene Cuesta

138

Bsqueda de informacin sobre datos de validacin

previa.
CUANDO HAY GRAN INFORMACIN SOBRE UNA
METODOLOGA LOS ENSAYOS PARA VALIDAR
SON RELATIVAMENTE SENCILLOS,
SI LA EXPERIENCIA ES ESCASA LA VALIDACIN
SER EXTENSA.

Bqca. Alicia Irene Cuesta

139



MTODOS DESARROLLADOS
POR EL LABORATORIO:

Debe ser :
Una actividad planificada (PROCEDIMIENTO)
Ser asignada a personal calificado
Proveer los recursos necesarios.

Los planes deben ser actualizados a medida que avanza

el desarrollo y deben asegurar que la comunicacin sea
eficaz entre todo el personal involucrado.
En este caso, el proceso de validacin es mucho ms
arduo, ya que se debe demostrar que cada paso elegido
responde a lo esperado.
Bqca. Alicia Irene Cuesta

140

LOS MTODOS NORMALIZADOS

EMPLEADOS FUERA DEL ALCANCE PREVISTO

Mtodos normalizados aplicados a matrices que no se

especifiquen en el procedimiento normalizado.

Ampliaciones y modificaciones de los mtodos
normalizados.
Para demostrar que una versin modificada de un mtodo
cumple las mismas especificaciones que el mtodo
original, deben realizarse comparaciones utilizando
replicados.

Bqca. Alicia Irene Cuesta

141

Sistemas de ensayo comerciales (kits)

Los laboratorios deben conservar los datos sobre la
validacin de los sistemas de ensayo comerciales (kits)
que utilicen.

Estos datos pueden obtenerse de ejercicios de
intercomparacin o de datos sobre validacin remitidos
por los fabricantes y sujetos a la evaluacin de una
tercera parte (p. ej., AOAC). [Link]

Si no se dispone de datos sobre validacin o si stos no
son plenamente aplicables, el laboratorio ser
responsable de completar la validacin del mtodo.
Bqca. Alicia Irene Cuesta

142

MTODOS NORMALIZADOS:

Antes de analizar cualquier muestra, los laboratorios
debern verificar su capacidad para cumplir de forma
satisfactoria todos los requisitos establecidos en
dichos mtodos.
El laboratorio debe confirmar que puede operar
correctamente los mtodos normalizados antes de
introducir los ensayos.

Se debe mantener actualizadas las normas.

Si el mtodo normalizado cambia, se debe repetir la
confirmacin.
Bqca. Alicia Irene Cuesta

143

LA VALIDACIN DE LOS MTODOS DE ENSAYO DEBE:

REFLEJAR LAS CONDICIONES REALES DE ENSAYO.
(USANDO PREFERENTEMENTE MATRICES NATURALMENTE
CONTAMINADAS).
LA EXTENSIN DE LA VALIDACIN NECESARIA DEPENDER
DEL MTODO Y SU APLICACIN.
LA DEBE REALIZAR PERSONAL CALIFICADO PARA ESA
ACTIVIDAD.
EN TODOS LOS CASOS UN PARMETRO PARA LA
VALIDACIN DE ENSAYOS MICROBIOLGICOS ES LA
DESCRIPCIN DEL MTODO DE ENSAYO.

Bqca. Alicia Irene Cuesta

144

Uso de muestras naturalmente contaminadas

y preparacin de muestras artificialmente
contaminadas en estudios de validacin
Anexo C ISO 16140:2003

1ra opcin: Muestras naturalmente

contaminadas
2da opcin: Contaminacin por mezcla.
3ra opcin: Muestras inoculadas (el nivel de
microflora debe representar la contaminacin de
las muestras naturalmente contaminadas).
4ta opcin: Materiales de referencia
Bqca. Alicia Irene Cuesta

145

Validar mtodos microbiolgicos requiere:

Comparar con un MTODO DE REFERENCIA.
REFERENCIA

Usar cepas de referencia y cepas de referencia
certificadas.(Material de referencia).

LA EVALUACIN SISTEMTICA DE FACTORES.

Ensayos Interlaboratorios.
Interlaboratorios

La estimacin de la incertidumbre.
Bqca. Alicia Irene Cuesta

146

El PROTOCOLO INCLUYE:
Primera FASE: Estudios precolaborativos o
validacin interna (estudios comparativos):
 Defino la aplicabilidad (concierne al analito de inters y a las
categoras de alimentos a las que se aplica el mtodo).
(TABLA: Clasificacin de categoras de alimentos para
estudios de validacin Anexo A AOAC).

Segunda FASE: Estudios o ensayos colaborativos

 Cuando la exigencia es de disponer de mtodos validados
plenamente, se considera habitualmente que la validacin
plena de un mtodo de anlisis comprende un examen de las
caractersticas del mtodo en un estudio del funcionamiento
del mtodo entre laboratorios .

Bqca. Alicia Irene Cuesta

147

Primera etapa de la validacin Ensayos selectivos

se usan cepas en estudios de( VALIDACION INTERNA):

INCLUSIVIDAD: diferentes microorganismos

pertenecientes al grupo deben ser detectados por
el mtodo.
SENSIBILIDAD

EXCLUSIVIDAD: diferentes microorganismos que

no pertenecen al grupo no deben ser detectados
por el mtodo.
ESPECIFIDAD

Bqca. Alicia Irene Cuesta

148

Cepas para ensayos de selectividad: ISO 16140:2003 ANEXO G

Categoras de Grupos Target:

Eleccin de microorganismos qu
cepas uso?

a) Un grupo Ejemplo Coliformes,

levaduras, bacterias acido-lcticas

Aquellas que dan reaccin tpica en el

mtodo de referencia.

b) De la Familia Ejemplo
Enterobacteriaceae

Incluir miembros representativos de

todos los gnero pertenecientes a la
familia

c) Gnero Ejemplo Salmonella spp

Incluir miembros representativos si es

posible de todas las especies
pertenecientes al gnero.

d) Especie Ejemplo Listeria

monocytogenes

Rango de cepas pertenecientes a la

especie

e) Cepa Ejemplo Listeria

monocytogenes 1a

Rango de fuentes de esta cepa

Bqca. Alicia Irene Cuesta

149

Cepas para ensayos de selectividad: ISO 16140:2003 ANEXO G

Categoras de Gruposno Target :

Eleccin de microorganismos

a) Un grupo no target

Aquellas que dan reaccin negativa

(segn microorganismo target)

b) De la Familia

Incluir cepas no pertenecientes a la

familia.

c) Gnero

Incluir cepas no pertenecientes al

gnero similar a la cepa target

d) Especie

Incluir cepas no pertenecientes a la

especie, incluidas en el gnero

e) Cepa

Incluir cepas no target, incluidas en

la especie.

Bqca. Alicia Irene Cuesta

150

Validacin mtodo cualitativo

Descripcin detallada del mtodo de ensayo.

LMITE DE DETECCIN
SENSIBILIDAD
ESPECIFICIDAD
DESVIACIN POSITIVA Y DESVIACIN
NEGATIVA
EFECTO MATRICIAL
Exactitud relativa
repetibilidad y reproducibilidad

Bqca. Alicia Irene Cuesta

151

Diseo de un estudio de validacin

mtodo cualitativo :
AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative
and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002)

Estudios precolaborativos o validacin interna (estudios

comparativos).
Compara el mtodo a validar con el mtodo de referencia.
Los realiza slo el laboratorio organizador.
[Link] MATRICES:
Nmero de matrices a ensayar: teniendo en cuenta Categoras de
alimentos a validar, analizar 20 o ms alimentos de cada categora.
Obtencin de muestras artificialmente contaminadas:
Inoculo una sola cepa (de inters) por matriz.
Segn proceso al que se somete al alimento uso:
-microoganismo estressado Alimentos procesados-microoganismo sin estress Alimentos no procesados-microoganismo liofilizado-productos en polvo.
Bqca. Alicia Irene Cuesta

152

Diseo de un estudio de validacin

mtodo cualitativo :
AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative
and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002)

Estudios precolaborativos o validacin interna

(estudio comparativos).
NIVEL DE INOCULO:
Nivel bajo (lmite de deteccin) 1-5ufc/25g de muestra
Nivel alto 10-50ufc/25g de muestra

 CONTROL: Para muestras artificialmente contaminadas.

Cada tipo de alimento se divide en dos, uno para control negativo y otro para
obtener distintos niveles inculo.

CUANTIFICACIN DE LOS NIVELES DE CONTAMINACIN

POR NMP: el mismo da que se analizan las muestras.
Nmero de ensayos por nivel de analito: 20

2. ESTUDIOS DE INCLUSIVIDAD Y EXCLUSIVIDAD: pruebo slo la

cepa.(cultivo puro)
Pruebo 50 o ms cepa target y 30 no target (mtodo a validar y mtodo de
referencia).

Bqca. Alicia Irene Cuesta

153

Diseo de un estudio de validacin

mtodo cualitativo :
AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative
and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002)

Estudios o ensayos colaborativos:

IMPORTANTE! Los laboratorios participantes acuerdan y estudian
minuciosamente el protocolo de ensayo.
Nmero de laboratorios:10 laboratorios (con datos vlidos) por tipo de
alimento.
Los laboratorios participantes no conocen los valores de las
muestras.(Muestras a ciegas)
Nmero de matrices a ensayar: teniendo en cuenta Categoras de
alimentos a validar.
Estudios o ensayos colaborativos:
PREPARACIN DE MUESTRAS:
a) Cepas inoculadas: Uso un cultivo puro cepa target.
b) Nivel bajo (lmite de deteccin) 1-5ufc/25g de muestra
Nivel alto 10-50ufc/25g de muestra
CONTROL. (Para muestras artificialmente contaminadas)
EL LABORATORIO QUE ORGANIZA DEBE ASEGURAR LA
HOMOGENEIDAD DE LAS MUESTRAS.
154
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Validacin mtodo cuantitativo

Descripcin detallada del mtodo de ensayo.

LMITE DE CUANTIFICACIN.
REPETIBILIDAD Y REPRODUCIBILIDAD
EXACTITUD
Desviacin positiva y desviacin negativa
sensibilidad
especificidad

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Diseo de un estudio de validacin

mtodo cuantitativo :
AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative
and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002)

Estudios precolaborativos o validacin interna (estudios

comparativos).
Comparacin del mtodo a validar con el mtodo de referencia.
Aplica lo visto anteriormente para mtodos cualitativos.
(tener en cuenta los estudios de inclusividad y exclusividad slo para
ensayos selectivos)
NIVEL DE INOCULO de las matrices:
se evalan 3 niveles de concentracin de microorganismo (bajo, medio y
alto) que abarquen todo el intervalo a validar.
Y un control sin inocular.
Uso fundamentalmente muestras naturalmente contaminados para ensayos
no selectivo (no realizo el control)
ESTUDIOS DE INCLUSIVIDAD Y EXCLUSIVIDAD: pruebo slo la
cepa.(cultivo puro)
Pruebo 30 o ms cepa target y 20 no target.(mtodo a validar y mtodo de
referencia)
ESTUDIOS O ENSAYOS COLABORATIVOS
Estimacin de desviacin aleatorias y sistemticas del mtodo.
Nmero de laboratorios: 8 laboratorios (con datos vlidos) por tipo de
alimento.

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Diseo de un estudio de validacin

mtodo cuantitativo :
AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative
and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002)

ESTUDIOS O ENSAYOS COLABORATIVOS:

a)Recuento de microorganismos especficos: inoculacin del microorganismo
especfico. SOLO PARA ENSAYOS SELECTIVOS
b) NIVEL DE INOCULO de las matrices:
se evalan 3 niveles de concentracin de microorganismo (bajo, medio y alto)
alto
que abarquen todo el intervalo a validar.
Y un control sin inocular.
Uso fundamentalmente muestras naturalmente contaminados para ensayos no
selectivo (no realizo el control)
Para cada tipo de alimento se analizan por duplicado (dos porciones) el
mtodo a validar y el mtodo de referencia.
Se realizan test para eliminar los outliers.
INDICADORES DE APTITUD:
Anlisis de varianza y t por tipo de alimento y nivel de inculo.
Sr, r, SR, R, RSDr y RSDR por tipo de alimento y nivel de inculo.
RSD es la desviacin estndar relativa.
Es independiente del valor del analito

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INFORME DE VALIDACION
El laboratorio debe registrar:
RESULTADOS OBTENIDOS.
Establecer el rango de validacin (es la parte del
intervalo de concentracin de un mtodo de anlisis
que ha sido validado). Todo esto debe ser
documentado y archivado.
PROCEDIMIENTOS USADOS.
Declaracin que el mtodo es apropiado para el
fin previsto.
Toda la informacin referida a la validacin debe
documentarse y archivarse.
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Extensin de la validacin
La extensin de la validacin necesaria depender del
mtodo y su aplicacin.
La validacin es siempre un equilibrio entre costos,
riesgos y posibilidades tcnicas.
Cada laboratorio establecer los requisitos que debe
cumplir el mtodo, con objeto de demostrar que son
adecuados para la finalidad establecida.

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