Ttulo: procedimientos para observacin de ADN
Autor: Brand Diego.
Estudiantes del Programa de licenciatura en biologa y qumica, Facultad de ciencias de la
educacin, Universidad del Atlntico, Ciudadela Universitaria Km. 7 Va Puerto Colombia,
Barranquilla, Colombia 10 de junio del 2014.
RESUMEN
En el siguiente informe se logr observar el DNA por medio de la tcnica de salting-out para extraccin
de DNA de clulas nucleadas humanas y por otro lado la electroforesis en geles de agarosa. Ambos
procedimientos nos permitieron visualizar el ADN.
INTRODUCCION
Composicin del genoma humano
La palabra genoma contiene la raz griega gen
que significa origen y la extensin tambin
griega oma empleada en sustantivos del
vocabulario biolgico y medico (Winkler, 1920;
Riger 1991; Riera 1992). El termino gen ha
sufrido transformaciones en su definicin.
Actualmente una de las definiciones ms
amplias seria secuencia de informacin que
produce un producto funcional (Carlson 1991),
Normalmente se sobrentiende como una
secuencia d DNA con todos sus elementos
reguladores de la transcripcin que da lugar a
una protena o a un RNA. Genoma puede
definirse como el contenido total de material
gentico caracterstico de una especie (Oliva
1986; Cummings 1995; Thompson 1996; Oriola
y Oliva 2001). Tambin se utiliza para indicar el
material gentico presente en virus.
Al nivel ms elemental de todos los genomas
humano est compuesto por cuatro tipos
distintos de bases: adenina (A), timina (T),
citosina (C), y guanina (G). Dado que las bases
son complemtarias dos a dos (T:A y C:G), cada
hebra de DNA viene apareada con otra hebra
complementaria. Ambas hebras se enrollan
formando estructuras tpicas de doble hlice. Es
precisamente la secuencia de bases de estas
molculas de DNA contenida en los
cromosomas que componen el genoma humano
en donde se halla la informacin necesaria
(genes) para determinar todas las caractersticas
con base hereditaria del ser humano. La
molcula de DNA se organiza en forma de
cromosomas. El ncleo de una clula diploide
contiene 23 pares de molculas de DNA. (Oliva,
etal.2004)
METODOLOGA EXPERIMENTAL.
Procedimiento Salting- out
Esta prctica consiste en extraer los cidos
nucleicos de sangre perifrica a travs de un
procedimiento rpido de desproteinizacin,
haciendo salting-out de las protenas
celulares, por deshidratacin y precipitacin
con una solucin saturada de Acetato de
Amonio, bajo condiciones de esterilidad,
con el fin de obtener una pureza y
concentracin adecuada, para estudios a
nivel del genoma humano.
EXTRACCIN DE ADN
A. PREPARACIN DE CLULAS A
PARTIR DE SANGRE PERIFRICA
1. Recolectar de 5 a 7 ml de muestra
sangunea en un Tubo vacutainer con
EDTA. Conservar la muestra a 4 C si es
necesario, mximo por dos das, para la
extraccin de ADN.
La sangre a recolectar fue extrada minutos
antes de la realizacin de la prctica, fue
donada por uno de los integrantes del grupo.
2. Antes de utilizar la muestra para la
extraccin tomar 1 ml como contramuestra y
almacenar a -70 C. ( paso opcional ).
La cantidad de sangre tomada para la
realizacin de la prctica, era apenas la
mnima, por lo que este paso fue omitido.
3. Repartir los 5 ml de sangre en 10
tubos eppendorf (0.5 ml de sangre por tubo).
La cantidad de sangre solo pudo ser
repartida en 8 de los tubos, puesto que del
total de la sangre una pequea parte resulto
coagulada y no pudo ser utilizada en la
prctica.
4. Agregar Solucin de Lisis de
Glbulos Rojos (LGR) a cada tubo
eppendorf, la cual debe estar bien fra, hasta
completar 1.5 ml, mezclar bien por suave
inversin y guardar en el refrigerador por 10
minutos.
Antes de llevar a la centrifuga, a los 0.5 ml
de sangre en cada tubo se le agregaron 1 ml
de solucin de lisis de glbulos rojos para
romper sus paredes membranosas,
recordemos que los glbulos rojos no nos
interesan, puesto que estos carecen de
ncleos.
5. Centrifugar a 3000 rpm por 15
minutos.
Esto con la finalidad de precipitar la muestra
con la que trabajaremos, y eliminar los
eritrocitos.
6. Descartar el sobrenadante
(Eritrocitos lisados) golpear el pellet para
desprender de las paredes del tubo.
Una vez centrifugados, el sobrenadante fue
eliminado, recordemos que este
sobrenadante son eritrocitos lisados con los
que no vamos a trabajar. Luego se le da unos
golpes al pallet para desprender restos en las
paredes del tubo.
7. Repetir el lavado con 1.0 ml de
Solucin de Lisis de Glbulos Rojos.
Este procedimiento se repiti buscando la
lisis completa de eritrocitos.
8. Centrifugar a 2000 rpm por 15
minutos.
Este procedimiento se repiti buscando
precipitar la muestra a utilizar y eliminar a
los eritrocitos en el sobrenadante.
9. Descartar el sobrenadante, golpear el
pellet.
10. Repetir el lavado con 0.5 ml de
Solucin de Lisis de Glbulos rojos.
11. Centrifugar a 2000 rpm
12. Descartar el sobrenadante.
13. Se realizan los lavados que sean
necesarios hasta que el sobrenadante est
totalmente claro. Descartar el sobrenadante
y proceder a la fase de lisis de glbulos
blancos.
Se realizaron alrededor de 5 lavados totales,
y fue entonces cuando la muestra se
consider libre de eritrocitos y de esta
manera con la muestra precipitada se
proceder a realizar la lisis de glbulos
blancos.
B. LISIS DE GLBULOS BLANCOS
Y DIGESTIN PROTEICA
1. Resuspender el botn celular en 0.3
ml de Lisis de Glbulos Blancos. Para que
las clulas lisadas sean digeridas adicionar:
2. 5 l de SDS al 10%.
3. 2.5 l de Solucin de Proteinasa K
(20mg/mL). Resuspender.
4. Incubar toda la noche a 37 C.
C. PRECIPITACION CON
ISOPROPANOL
Despus que la digestin se complet
durante toda la noche, se observa una
solucin espesa y gomosa. Cuando ms
gomosa sea se espera que haya ms DNA.
1. Agregar 80 l de Acetato de Amonio
(7.5 M) a cada tubo eppendorf.
2. Agitar vigorosamente por 15
segundos.
3. Centrifugar a 3000 rpm por 25
minutos.
4. El sobrenadante de los 10 tubos
eppendorf que contiene el DNA se transfiere
a un tubo Falcon de prolipropileno de 15 ml,
se descarta el botn proteico
precipitado.(Tener mucho cuidado de no
remover el botn proteico mientras se
transfiere el sobrenadante)
5. Adicionar igual volumen de
isopropanol frio y mezclar por suave
inversin varias veces hasta observar el
precipitado del DNA.
6. Descartar el isopropanol y transferir
el precipitado de DNA a un tubo eppendorf.
7. Lavar el DNA con etanol al 70% y
centrifugar a 13000 rpm por 1 minuto, para
eliminar el isopropanol.
8. Secar el DNA dentro de la cmara de
Flujo Laminar por 4 horas aproximadamente
con el fin de remover todo el etanol.
9. Resuspender el DNA, cuando est
completamente seco, en 100 l de Buffer TE
1X. Si se observa poco DNA se diluye en
20-50 de TE 1X.
10. Incubar a 37 C con agitacin toda la
noche o incubar a 65 C por una hora.
11. Cuantificar el DNA y almacenarlo a
4 C. Si se desea conservar por aos la
muestra debe hacerse a temperatura de -80
C.
Lugo con el fin de separar los cidos
nucleicos del ADN se realiz la
electroforesis en geles de agarosa siguiendo
las instrucciones planteadas a continuacin.
PROCEDIMIENTO 1
A. Preparacin del gel de agarosa al 0.7
%
Se adiciona en un beaker 0.42 g de agarosa
en 60mL de tampn TAE 1X, luego se
calienta la mezcla en el horno microondas
hasta disolver la agarosa.
Nota: Calentar inicialmente por 60 s con
posterior agitacin. Luego calentar por 30s
evitando la evaporacin del tampn.
A continuacin, se adicionan 3L de
bromuro de etidio, se agita hasta disolver,y
finalmente el gel se vierte en la cmara de
electroforesis.
A.1. Preparacin de reactivos:
BUFFER DE ELECTROFORESIS
(TAE 10X)
Reactivo Cantidad
Tris-base 24.2g
cido
actico
glacial
4
5.7mL
EDTA pH
8.0
10mL
Agua C.S.P 500mL
NOTA: CABE MENCIONAR QUE ETA
PRIMERA PARTE DE ESTE PROCESO
FUE REALIZADA EN AUSENCIA DE
LOS ESTUDIANTES TIEMPO ANTES
DEL INICIO DE LA PRACTICA, ESTO
BUSCANDO AGILIZAR LOS PROCESOS
Y DE ESTA MANERA CONLUIR LA
EXPERIENCIA EN EL TIEMPO
ESTIPULADO.
B. PREPARACIN DE LA MUESTRA
Se mezclan 5L de cada muestra con 2 L
de buffer de carga, y aplicarlo en los
pocillos formados en el gel.
C. CONDICIONES DE SEPARACIN
La electroforesis se realiza manteniendo un
voltaje constante de (70V) durante un
tiempo de 90 minutos y a 400 mili-
amperios. Finalizada la electroforesis, las
bandas de ADN se visualizan en el gel,
utilizando el transiluminador de luz
ultravioleta.
PROCEDIMIENTO 2
1. Forrar la base de corrida o cmara
del gel con cinta de enmascarar y
nivelarla.
2. Preparar el gel de agarosa y verterlo
en caliente (50-60 C) en la base de
corrida (ver A).
3. Introducir el peine en la ranura
correspondiente de la cmara del gel.
4. Dejar enfriar el gel por mnimo 30
mn para que gelifique.
5. Retirar el peine del gel solidificado y
retirar la cinta de enmascarar.
6. Sumergir completamente la base de
corrida con el gel en 240 mL de
buffer TAE 1X.
7. Preparar la muestra (ver B) y
cargarla en los posillos del gel.
Tapar la cmara teniendo en cuenta
que los polos elctricos se
correspondan, negativo y positivo
respectivamente.
8. Encender la fuente de poder.
9. Programar el tiempo de corrida y el
voltaje (ver C), y poner a correr la
electroforesis.
10. Despus de trascurrido el tiempo de
corrida verificar que el ADN halla
corrido los suficiente, de lo contrario
puede colocar un poco ms de
tiempo.
11. Retirar el gel de la cmara y
trasladarlo al transiluminador UV
para observar la corrida y las
condiciones del ADN.
RESULTADOS Y DISCUSIN.
En la primera parte de toda la experiencia, la
tcnica Salting out, permitio que por medio de la
extraccin de efectiva de los Acidos Nucleicos
de la sangre de la sangre. Esto se obtuvo luego
de varias etapas, comenzando con la lisis celular,
donde se busc eliminar los glbulos rojos y
blancos.
Despues de haber realizado esta primera etapa,
la electroforesis permitio observar las bandas de
ADN.
Imag. 1: resultado del Salting out
Imag.2 Bandas obtenidas en el lab por medio
de electroforesis.
Imag.3: Imagen extrada de internet