BIOTECNOLOGIA
Enzimas de restriccin
Endonucleasas que reconocen dianas
especficas en el ADN
Protegen a cada cepa de bacterias de otro ADN
que no pertenece al sistema
El ADN propio est protegido porque las dianas
de restriccin estn metiladas (metilasa)
Clasificacin
Tipo I
Tipo II
Tipo III
Otros tipos
Enzimas de restriccin de tipo II
Son las mejor estudiadas
Cortan en el mismo lugar que reconocen
Las secuencias diana son palindrmicas (capica):
PCR Reaccin en Cadena de la Polimerasa
RT-PCR
Electroforesis de ADN
Electroforesis de Protenas
BLOTTING
SOUTHERN (DNA)
NORTHERN (RNA)
WESTERN (protenas)
Southern Blot
Northern Blot
INGENIERA GENTICA
Amplificacin de secuencias y
obtencin de ADN recombinante
Clonaje
Utilizacin de una unidad replicativa procaritica
para obtener grandes cantidades de un
fragmento de ADN de inters.
La unidad replicativa constituye el vector.
El fragmento amplificado se denomina inserto.
Proceso de clonaje
1) Generacin del fragmento de ADN
2) Eleccin del vector conveniente
3) Unin del fragmento (inserto) al vector
4) Introduccin de la construccin en un organismo
en el que se pueda reproducir
5) Seleccin del recombinante
Vectores procariticos
Plsmidos
Csmidos
Bacterifagos
Cromosomas artificiales de bacterias
Plsmidos
Molculas de ADN circular
extracromosmico, presentes
naturalmente en bacterias.
Se replican autnomamente
utilizando las enzimas de la
bacteria.
El nmero de copias por bacteria
es variable.
Plsmido para
expresin en E. coli
Electroforesis de ADN en gel de agarosa 1%. Calle 3:
marcadores de peso molecular; Calle 4: plsmido
pET-3a cortado con PstI; Calle 5 pET-3a cortado con
PstI y XbaI; Calle 6 : el pET-3a cortado con PstI y
NdeI.
INGENIERA GENTICA
VEGETAL
METODOLOGA
Para qu plantas transgnicas?
Rendimiento y calidad nutricional
Biorreactores
Estudio de procesos biolgicos
Rasgos introducidos
Resistencia a:
insectos
herbicidas
virus, hongos, bacterias
Retraso de senescencia, tolerancia a estrs
Mejora del valor biolgico (protenas, lpidos)
Produccin de polipptidos de uso farmacolgico.
Mtodos de transferencia
Plsmido Ti (Agrobacterium tumefaciens)
Bombardeo de microproyectiles
Agrobacterium tumefaciens
Bacteria del suelo gram negativa
provoca tumores (Agalla de corona)
afecta slo dicotiledneas
modifica genticamente las clulas que infecta
Caractersticas de la infeccin
por A. tumefaciens
La enfermedad que produce es la consecuencia de la
transferencia, integracin y expresin de un segmento de
DNA bacteriano en las clulas de las plantas.
Este segmento se denomina T-DNA, y est contenido en un
plsmido natural de la bacteria llamado plsmido Ti.
El plsmido Ti contiene adems los denominados genes vir
Qu son los genes vir?
Codifican factores esenciales para la transferencia e
integracin del T-DNA dentro del genoma de la planta.
Estn ubicados en una regn de 35 kb del plsmido Ti
fuera de la regin del T-DNA.
Hay 25 genes vir distribudos en 7 operones.
Responden a un metabolito secundario exudado por las
plantas cuando se les provoca una herida
(acetosiringona)
Vectores derivados del
plsmido Ti
Componentes necesarios:
Marcador de seleccin (resistencia a
kanamicina)
Origen de replicacin (para que se replique en
[Link])
Borde derecho de la secuencia T-DNA
Polylinker (regin de multiple clonaje)
Tipos:
binarios
cointegrados
(binario)
Manipulacin de la expresin
gnica
Promotores:
constitutivos (35S del virus del mosaico del coliflor)
tejido especficos (FBPasa - Rubiscom)
inducibles
Secuencias enhancer
Intrones que estabilizan el mRNA producido
Secuencia terminadora (nopalina sintasa)
Manipulacin post-
transcripcional
Antisentido
Se transfiere un gen que codifica para un
RNA complementario (asRNA) al mRNA de
inters.
Al transcribirse ambos genes se forma un
hbrido asRNA-mRNA que impide la
traduccin del ltimo.