NORMA TCNICA NTC
COLOMBIANA 4458
1998-09-23
MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS Y ALIMENTOS
PARA ANIMALES.
GUA GENERAL PARA EL RECUENTO DE
COLIFORMES. TCNICA DE RECUENTO DE
COLONIAS
E: MICROBIOLOGY OF FOOD AND ANIMAL FEEDING
STUFFS. GENERAL GUIDANCE FOR THE ENUMERATION
OF COLIFORMS COLONY COUNT TECHNIQUE.
CORRESPONDENCIA: esta norma es equivalente (EQV) a la
ISO 4832.
DESCRIPTORES: anlisis microbiolgico; microbiologa.
I.C.S.: 07.100.30
Editada por el Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin (ICONTEC)
Apartado 14237 Bogot, D.C. - Tel. 6078888 - Fax 2221435
Prohibida su reproduccin
PRLOGO
El Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin, ICONTEC, es el organismo nacional
de normalizacin, segn el Decreto 2269 de 1993.
ICONTEC es una entidad de carcter privado, sin nimo de lucro, cuya Misin es fundamental
para brindar soporte y desarrollo al productor y proteccin al consumidor. Colabora con el sector
gubernamental y apoya al sector privado del pas, para lograr ventajas competitivas en los
mercados interno y externo.
La representacin de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalizacin Tcnica
est garantizada por los Comits Tcnicos y el perodo de Consulta Pblica, este ltimo
caracterizado por la participacin del pblico en general.
La NTC 4458 fue ratificada por el Consejo Directivo en 1998-09-23.
Esta norma est sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en
todo momento a las necesidades y exigencias actuales.
A continuacin se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a travs
de su participacin en el Comit Tcnico 000031 Microbiologa.
ACEGRASAS
ASINAL
BIOASESORAS
BIOQUILAB LTDA
CALIDAD MICROBIOLGICA
CARULLA Y CA S.A.
CICOLAC
COLFRIGOS
COLSUBSIDIO
CONDIMENTOS EL REY
CREPES & WAFFLES
GASEOSAS LUX
INDEPENDIENTE
IVONNE BERNIER LABORATORIO
JUAN BANDERA Y CA
NESTL DE COLOMBIA
POSTOBN
RICA RONDO
UNIVERSIDAD JORG TADEO LOZANO
Adems de las anteriores, en Consulta Pblica el Proyecto se puso a consideracin de las
siguientes empresas:
ALPINA S.A.
ASEBIOL LABORATORIO LTDA
BAVARIA S.A.
CASA LUKER
CERVECERA LEONA S.A.
CONGELAGRO
DISA
INGENIO PROVIDENCIA S.A.
INGENIO RIOPAILA
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
INVIMA
LABORATORIOS GRAM
LLOREDA GRASAS S.A.
MEALS S.A.
MERCK
NULAB LTDA
QUIOS LTDA
SUIZO NOEL-ZEN
TRES M COLOMBIA S.A.
ICONTEC cuenta con un Centro de Informacin que pone a disposicin de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales.
DIRECCIN DE NORMALIZACIN
NORMA TCNICA COLOMBIANA NTC 4458
1
MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS Y DE ALIMENTOS PARA ANIMALES.
GUA GENERAL PARA EL RECUENTO DE COLIFORMES.
TCNICA DE RECUENTO DE COLONIAS
1. OBJETO
Esta norma da directrices generales para el recuento de microorganismos presentes en productos
destinados al consumo humano o alimentacin de animales, por medio de la tcnica de recuento
de colonias en un medio slido despus de incubacin a 35 C 2 C.
2. NORMAS QUE SE DEBEN CONSULTAR
Las siguientes normas contienen disposiciones que, mediante la referencia dentro de este
texto, constituyen disposiciones de esta norma. En el momento de su publicacin eran vlidas
las ediciones indicadas. Todas las normas estn sujetas a actualizacin; los participantes,
mediante acuerdos basados en esta norma, deben investigar la posibilidad de aplicar la ltima
versin de las normas mencionadas a continuacin.
ISO 6887:1983, Microbiology. General Guidance for the Preparation of Dilutions for Microbiological
Examination.
NTC 4206:1997, Microbiologa de alimentos y de alimentos para animales. Reglas Generales para
los anlisis microbiolgicos. (ISO 7218:1997).
3. DEFINICIN
Para los propsitos de esta norma se aplica la siguiente definicin.
Coliformes: Bacterias que a la temperatura especificada (35 C 2 C) forman colonias
caractersticas en el medio agar - lactosa - bilis - rojo neutro - cristal violeta, o cualquier otro de
caractersticas similares, bajo las condiciones de ensayo especificadas en la presente norma.
4. PRINCIPIO
4.1 Se realizan siembras usando un medio de cultivo selectivo y usando una cantidad
especificada de la muestra de ensayo si el producto inicial es lquido, o una cantidad especificada
de una suspensin inicial en el caso de otros productos.
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Se realizan otras siembras en las mismas condiciones, usando diluciones decimales de la muestra
de ensayo o de la suspensin inicial.
4.2 Se incuban las placas a 35 C 2 C durante 24 h.
4.3 Se calcula el nmero de coliformes por mililitro o por gramo de muestra a partir del nmero
de colonias obtenido en las cajas seleccionadas (vase el numeral 10.1).
5. MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTE
5.1 GENERALIDADES
Para los procedimientos de laboratorio corrientes, vase la NTC 4206 (ISO 7218).
5.2 DILUYENTE
Vase la norma ISO 6887 y la norma especfica relacionada con el producto sometido a anlisis.
5.3 MEDIO SELECTIVO SLIDO: AGAR-LACTOSA-BILIS-ROJO NEUTRO-CRISTAL
VIOLETA, VRBL
Nota. Se utiliza el medio VRBL o cualquier otro similar preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Composicin del medio VRBL
Peptona 7,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Lactosa 10,0 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Sales biliares 1,5 g
Rojo neutro 0,03 g
Cristal violeta 0,002 g
Agar 12 g a 18 g
1
Agua destilada o desionizada 1 000 ml
Preparacin
Se procede como se indica a continuacin, para conservar la capacidad selectiva y especificidad
del medio.
Se mezclan muy bien en agua, los componentes o el medio completo deshidratado, y se dejan
reposar durante varios minutos. Se ajusta el pH de tal modo que despus de la esterilizacin sea
7,4 C a 25 C.
Se permite que ebulla durante 2 min y se enfra inmediatamente el medio en un bao de agua
(vase el numeral 6.5) a 45 C.
Se debe evitar el calentamiento excesivo del medio.
1
De acuerdo con la resistencia del gel del agar.
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3
En consecuencia, no se debe esterilizar en autoclave y se debe verificar la esterilidad del medio
en el momento de su uso. (vase el numeral 9.2.2)
El medio se debe usar dentro de un lapso mximo de 3 h desde el momento de su preparacin.
6. EQUIPO Y MATERIAL DE VIDRIO PARA LABORATORIO
Nota 1. El equipo y material desechable es una alternativa aceptable frente al material de vidrio reutilizable si cumple con
las especificaciones adecuadas.
Se utiliza el equipo y material usual de laboratorio microbiolgico y, en especial, lo siguiente.
6.1 APARATO PARA ESTERILIZACIN EN SECO (HORNO) O ESTERILIZACIN EN
HMEDO (AUTOCLAVE)
Vase la NTC 4206 (ISO 7218).
6.2 INCUBADORA
Con capacidad de operar a 35 C 2 C.
6.3 CAJAS DE PETRI
De vidrio o plstico, con dimetro de 90 mm a 100 mm.
6.4 PIPETAS DE SUMINISTRO TOTAL
Con capacidad nominal de 1 ml.
6.5 BAO DE AGUA
O aparato similar, con capacidad de operar a 45 C 0,5 C.
6.6 EQUIPO DE RECUENTO DE COLONIAS
Consistente en una base iluminada y un contador digital mecnico o electrnico.
6.7 MEDIDOR DE pH
Con aproximacin a 0,1 unidad de pH a 25 C.
7. MUESTREO
El muestreo se debe haber efectuado de acuerdo con la norma especfica apropiada para el
producto que se estudia. Si no existe una norma especfica, se recomienda que las partes
interesadas lleguen a un acuerdo sobre este aspecto.
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8. PREPARACIN DE LA MUESTRA DE ENSAYO
La muestra de ensayo se debe preparar de acuerdo con la norma que trate acerca del producto
que interese. Si no existe norma especfica, se recomienda que las partes interesadas lleguen a
un acuerdo sobre este punto.
9. PROCEDIMIENTO
9.1 MUESTRA DE ENSAYO, SUSPENSIN INICIAL Y DILUCIONES
Vase la norma ISO 6887 y la norma especfica apropiada para el producto que interese.
9.2 INOCULACIN E INCUBACIN
9.2.1 Se toman dos cajas de Petri estriles (vase el numeral 6.3). Usando una pipeta estril
(vase el numeral 6.4), se transfiere a cada caja 1 ml de la muestra de ensayo, si el producto es
lquido, o 1 ml de la suspensin inicial en el caso de otros productos.
Se toman otras dos cajas de Petri estriles. Usando otra pipeta estril, se transfiere a cada caja 1 ml
de la primera dilucin decimal (10
-1
) de la muestra de ensayo, si el producto es liquido, 1 ml de la
primera dilucin decimal (10
-2
) de la suspensin inicial en el caso de otros productos.
Se repite el procedimiento descrito con las diluciones adicionales, usando una pipeta estril para
cada dilucin decimal.
9.2.2 Se vierten aproximadamente 15 ml del medio (vase el numeral 5.3), a 45 C 0,5 C, en
cada caja de Petri. El tiempo transcurrido entre el final de la preparacin de la suspensin inicial (o de
la dilucin 10
-1
si el producto es lquido) y el momento en que el medio (vase el numeral 5.3) se
vierte en las cajas no debe ser mayor de 20 min.
Cuidadosamente se mezcla el inculo con el medio y se deja solidificar la mezcla, estando las
cajas de Petri sobre una superficie horizontal fra.
9.2.3 Despus de que se complete la solidificacin, se vierten aproximadamente 4 ml de medio
VRBL (vase el numeral 5.3) a 45 C 0,5 C, sobre la superficie del medio inoculado. Se deja
solidificar como se describi anteriormente. Se pretende dejar una doble capa para visualizar
mejor las colonias.
9.2.4 Se invierten las cajas preparadas y se incuban a 35 C 2 C durante 24 h 2 h.
9.3 RECUENTO DE LAS COLONIAS
Despus del perodo especificado de incubacin (vase el numeral 9.2.4), se cuentan las colonias
coliformes caractersticas en cada caja que contenga no ms de 150 colonias
2
, ya sean
caractersticas o no usando el equipo para el recuento de colonias.
Nota 2. Despus de la incubacin durante 24 h, las colonias caractersticas son de color rojo prpura con un dimetro de
0,5 mm o mayor, y algunas veces estn rodeadas de una zona rojiza de bilis precipitada.
2
Por encima de este nmero existe el riesgo de que las colonias coliformes tengan una apariencia atpica.
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10. EXPRESIN DE LOS RESULTADOS
10.1 MTODO DE CLCULO
10.1.1 Caso general - Cajas que contengan entre 15 y 150 colonias caractersticas
Se seleccionan las cajas que contengan no ms de 150 colonias caractersticas en dos diluciones
consecutivas. Es necesario que una de estas cajas contenga al menos 15 colonias caractersticas.
Se calcula el nmero N de colonias por mililitro o por gramo de producto, dependiendo del caso,
usando la siguiente ecuacin:
)d
2
n 0,1
1
(n
C
N
+
=
Donde:
C = es la suma de colonias contadas en todos los platos retenidos;
n
1
= es el nmero de platos retenidos en la primera dilucin;
n
2
= es el nmero de platos retenidos en la segunda dilucin;
d = es el factor de dilucin correspondiente a la primera dilucin.
Se redondea el resultado calculado con dos cifras significativas.
Se toma como resultado el nmero de unidades formadoras de colonias, UFC/ml o UFC/g de
producto, expresado como un nmero entre 1,0 y 9,9 multiplicado por 10
x
donde x es la potencia
apropiada de 10.
Ejemplo:
Un recuento de coliformes dio los siguientes resultados:
- en la primera dilucin seleccionada (10
-2
): 83 y 97 colonias
- en la segunda dilucin seleccionada (10
-3
): 13 y 8 colonias
136 9
0,022
201
2 10 x ) 2 x 0,1 (2
8 13 97 83
d n2) 0,1 (n1
C
N = =
+
+ + +
=
+
=
Al redondear el resultado como se indic antes, se obtiene 9 100 9,1 x 10
3
UFC/ml o UFC/g de
producto.
10.1.2 Caso en el que cada caja contiene menos de 15 de colonias caractersticas
Si cada una de las cajas, seleccionadas contiene menos de 15 de colonias caractersticas, se calcula
el nmero estimado N
E
de coliformes usando la ecuacin presentada en el numeral 10.1.1.
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EJEMPLO.
Un recuento de colonias de coliformes dio los siguientes resultados:
- En una dilucin de 10
-4
: 140 y 145 colonias, de las cuales 5 y 3 respectivamente
fueron caractersticas.
- En una dilucin de 10
-5
: 11 y 8 colonias, de las cuales 0 y 1 respectivamente
fueron caractersticas.
000 40
4
10 x 2,2
9
4
10 x 2) x 0,1 (2
1 0 3 5
E
N =
+
+ + +
=
Al redondear el resultado como se especific en el numeral 10.1.1, da 4,0 x 10
-4
UFC/ml o UFC/g
del producto.
10.1.3 Estimacin de nmeros pequeos
Si las dos cajas, correspondientes a la muestra de ensayo (productos lquidos) o a la suspensin
inicial (otros productos) contienen menos de 15 colonias caractersticas, los resultados se reportan
as:
- < 15 UFC/ml (productos lquidos);
- < 15 x 1/d UFC/g (otros productos), en donde d es el factor de dilucin de la
suspensin inicial.
10.1.4 Colonias no caractersticas
Si las dos cajas correspondientes a la muestra de ensayo (productos lquidos) o a la suspensin
inicial (otros productos) no contienen colonias caractersticas, se informa el resultado como sigue:
- <1 UFC/ml (productos lquidos);
- <1 x 1/d UFC/g (otros productos), donde d es el factor de dilucin de la suspensin
inicial.
10.2 PRECISIN
10.2.1 Cajas que contengan entre 15 y 150 colonias caractersticas (vase el numeral 10.1.1)
Solamente por razones estadsticas, en el 95 % de los casos los lmites de confianza de este mtodo
varan desde 16 % hasta 52 % (Cowell y Morisetti, J. Sci. Fd. Agric., 1969, Vol. 20, p. 573). En la
prctica, se puede encontrar variacin an mayor especialmente entre resultados obtenidos por
diferentes microbilogos.
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10.2.2 Cada caja contiene menos de 15 colonias caractersticas (vase el numeral 10.1.2)
Consltese la Tabla A.1. Para obtener los lmites de confianza, se multiplican los lmites superior e
inferior dados por 1/d, en donde d es el factor de dilucin.
11. INFORME DEL ENSAYO
El informe del ensayo debe especificar el mtodo usado y los resultados obtenidos. Tambin se
deben mencionar todos los detalles operativos no especificados en la presente norma, o
considerados como opcionales, junto con detalles de cualquier incidente que pueda haber influido
en los resultados.
El informe de ensayo tambin debe incluir toda la informacin necesaria para la identificacin
completa de la muestra.
12. DOCUMENTO DE REFERENCIA
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Microbiology. General Guidance
for the Enumeration of Coliforms. Colony Count Technique. Geneva: ISO, 1991, 5 pp.
(ISO 4832-1991).
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Anexo A (Normativo)
Lmites de confianza para la estimacin de
nmeros pequeos de colonias
En la Tabla A.1 se dan los lmites de confianza al nivel del 95 % para la estimacin de nmeros
pequeos, cuando el nmero de colonias en las cajas seleccionadas es menor de 15.
Tabla A.1
Nmero de coliformes Lmites de confianza al nivel del 95 %
Inferior Superior
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
< 1
< 1
< 1
1
2
2
2
3
4
4
5
6
7
7
8
2
4
5
6
9
10
12
13
14
16
18
19
20
21
23