Prácticas Microbiología MEHU-UPAO
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE HONGOS DERMATOFITOS
(DERMATOMICOSIS)
OBJETIVOS
Objetivo general
Realizar el aislamiento e identificación de los principales géneros de hongos que
producen infecciones micóticas superficiales (dermatomicosis)
Objetivos específicos
Recolectar muestras clínicas (piel, cabello o uñas) aplicando técnicas adecuadas de
asepsia para evitar contaminaciones.
Aislar hongos dermatofitos mediante la siembra en medios de cultivo selectivos y
diferenciales apropiados para su crecimiento.
Observar las características macroscópicas de las colonias desarrolladas,
considerando color, textura, forma y velocidad de crecimiento.
Identificar las estructuras microscópicas de los hongos mediante el uso de técnicas
como el examen con hidróxido de potasio (KOH) y coloraciones específicas.
Diferenciar los principales géneros de dermatofitos (como Trichophyton,
Microsporum y Epidermophyton) en base a criterios morfológicos.
Interpretar los resultados obtenidos correlacionando los hallazgos macroscópicos y
microscópicos para lograr una identificación confiable
INTRODUCCIÓN
Los dermatofitos son un grupo de hongos queratinolíticos responsables de la mayoría de las
micosis de tipo superficial (piel, uñas y pelo). A estas infecciones se les denomina “dermatofitosis”
o también conocidas como tiñas. Estructuralmente, son hongos filamentosos, septados y
hialinos. Se conforman principalmente por micelio y diferentes tipos de conidios (esporas), los
cuales en su estado asexual se clasifican en macroconidios (grandes, con múltiples tabiques),
microconidios (pequeños, unicelulares) y artroconidios (estructuras infecciosas de hifas). La
capacidad de los hongos para detectar y adaptarse al hospedero es crucial para una infección
exitosa. Las células fúngicas colonizan las estructuras queratinizadas en un proceso que se basa
en reordenamientos mecánicos y bioquímicos. Fisiopatológicamente, la infección por
dermatofitos implica, en primer lugar, la adherencia de los artroconidios a la epidermis, los cuales,
dentro de las dos a seis horas posteriores al contacto, comienzan a crecer hacia el estrato córneo
formando hifas que crecen en múltiples direcciones. El pH en el sitio de la infección se vuelve
más básico a medida que el dermatofito degrada la queratina, lo que facilita la actividad de las
proteasas fúngicas que hidrolizan las proteínas de la matriz extracelular, incluidas la queratina y
el colágeno, cuya descomposición a su vez proporciona nutrientes para el hongo. Las hifas
continúan creciendo e invadiendo los tejidos queratinizados y comienzan a producir artroconidios
dentro de los siete días posteriores a la infección, facilitando que se propague a otros sitios del
mismo hospedero o a otras personas al contaminar superficies como pisos, duchas, etc.
La taxonomía de los dermatofitos y su identificación rutinaria en el laboratorio de Micología clínica
se basa fundamentalmente en criterios morfológicos, macro y microscópicos, relacionados con
la fase de reproducción asexual (fase imperfecta, anamorfo, mitospórico) de estos hongos. Los
géneros que agrupan a las especies productoras de dermatofitosis son: Epidermophyton,
Microsporum y Trichophyton
En la actualidad, aproximadamente unas 40 especies se encuentran incluidas en estos géneros.
El número de especies se reduce a unas 30 cuando se considera únicamente a las productoras
de dermatofitosis (verdaderos dermatofitos). Estas especies no se suelen aislar con la misma
frecuencia en todos los laboratorios, ya que existe una clara variabilidad climática, geográfica,
socioeconómica etc., que origina cambios en los patrones de distribución de los agentes
etiológicos de las dermatofitosis. Algunas especies son de distribución geográfica limitada: T.
concentricum se encuentra fundamentalmente en Oceanía o T. soudanense en África. No
obstante, los flujos de emigración pueden hacer ocasionalmente frecuentes los aislamientos de
algunas especies en países en los que no se aíslan habitualmente. Otras especies se distribuyen
de forma más o menos regular por todo el mundo. En efecto, tan sólo 10 especies (Tabla 1) se
aíslan con una frecuencia elevada en la mayoría de los laboratorios de Micología clínica humana,
representando el 99% de los cultivos positivos. De estas, únicamente seis especies: E.
floccosum, M. canis, M. gypseum, T. rubrum, T. mentagrophytes y T. tonsurans, pueden
llegar a ser las responsables de más del 90% de los casos. Algunos de estos dermatofitos (ej. T.
mentagrophytes, M. gypseum) son en realidad complejos de especies (“species complex”) que
incluyen distintas variedades o incluso grupos de especies.
Tabla 1. Dermatofitos asilados frecuentemente en humanos
Género Especies
Epidermophyton E. floccosum
Microsporum M. canis
M. gypseum
M. audounii
Trichophyton T. rubrum
T. mentagrophytes
T. tonsurans
T. verrucosum
T. violaceum
T. schoenleinii
No todos los dermatofitos se aíslan con la misma frecuencia en las distintas localizaciones que
pueden presentar las dermatofitosis en el hombre. En la Tabla 2 se incluyen las principales
especies según la localización o tipo, indicando su denominación. Aunque otras especies no
incluidas en esta tabla pueden participar en estos procesos, conocer la distribución de las más
frecuentes puede ser de utilidad a la hora de realizar la identificación.
Tabla 2. Dermatofitosis humanas. Principales agentes etiológicos según tipo y/o
localización.
Tinea capitis: cuero cabelludo, cejas, pestañas.
•T. tonsurans, M. canis, T. violaceum, M. audouinii
Tinea corporis: piel lampiña del tronco, cuello, brazos, piernas y dorso de las manos y
los pies.
•T. rubrum, E. floccosum, T. mentagrophytes, T. tonsurans , T. verrucosum
Tinea cruris: ingles, perineo, región perianal.
•T. rubrum, E. floccosum, T. mentagrophytes
Tinea unguium:uñas.
•T. rubrum, E. floccosum, T. mentagrophytes
Tinea facei: piel glabra de la cara.
•T. rubrum, T. mentagrophytes
Tinea barbae: barba y bigote.
•T. mentagrophytes, T. violaceum, T. verrucosum, T. rubrum
Tinea pedis (pie de atleta): planta del pie, dedos y región interdigital.
•T. rubrum, T. mentagrophytes, E. floccosum
Tinea manuum: región interdigital y palmas de las manos.
•T. rubrum, T. mentagrophytes, E. floccosum
Tinea favosa (favus)a: cuero cabelludo y piel glabra.
•T. schoenleinii, T. mentagrophytes var. quinckeanum
Tinea imbricata: (Tokelau, circinada tropical)b
•T. concentricum.
a: Delimitada geográficamente fundamentalmente a Europa, Asia y África.
b: Delimitada geográficamente a determinadas islas del Pacífico en Oceanía, Sudeste asiático y determinadas
zonas de México, América Central y Sudamérica
IDENTIFICACIÓN DE HONGOS DERMATOFITOS
A. TOMA DE MUESTRAS
En primer lugar, es fundamental una correcta toma de muestras. Para ello se deberán
retirar los tratamientos antifúngicos al menos 2 semanas antes de obtener la misma. En
lo posible se deberá utilizar un instrumental adecuado al tipo de muestra (fig. 1). En las
lesiones húmedas es mejor el empleo de escobillones o hisopos, y para lesiones secas
son útiles las hojas de bisturí. En el caso de las muestras ungueales es práctico el uso
de alicates de manicura (o unas tijeras curvas en su defecto) y del «cuchillo de Le Cron»,
de uso habitual en Odontología.
Fig. 1 Instrumental para toma de muestras en dermatomicosis
También puede ser de utilidad la toma de lesiones cutáneas con moqueta estéril (trozo
de tapiz) – Fig. 2., que permite la impronta en los medios de cultivo y la posibilidad de
infecciones o sobreinfecciones bacterianas. Esto es importante en la tinea pedis, que no
pocas veces coexiste con intertrigo por Pseudomonas u otras bacterias gramnegativas,
o en infecciones por Candida. No obstante, la toma con moqueta hace dificultoso realizar
el examen directo.
Fig. 2 Instrumental para toma de muestras en dermatomicosis
Previamente a la toma de muestras debe realizarse una limpieza de la zona frotando suavemente
con una gasa o un algodón impregnados en alcohol de 70o. La muestra debe tomarse del borde
de la lesión (zona más activa). En las tiñas del cuero cabelludo debemos además procurar coger
algunos folículos pilosos (habitualmente se encuentran fragmentos de pelos afectos, que
característicamente se desprenderán con facilidad al raspar en la zona, sin necesidad de
arrancarlos). Ante la sospecha de onicomicosis distal procuraremos recortar el área de onicólisis
más distal para tomar la muestra más proximalmente1.
Siempre se procurará recoger una cantidad suficiente de material. Una parte del material
obtenido se depositará en el centro de un portaobjetos limpio (o si la muestra se obtuvo mediante
escobillón se frota un poco del mismo) y luego se depositará una gota de la tinción elegida en su
superficie. La más utilizada en la actualidad es la solución de Swartz-Lamkins (tinta
Parker® permanente negra a partes iguales con potasa al 20%), si bien existen otras como las
que combinan potasa y calcoflúor. Posteriormente se colocará el cubreobjetos.
En caso de que el material sean escamas es útil calentar ligeramente la preparación a la llama
de un mechero, y/o presionar suave y repetidamente sobre el cubre, hasta que el material
queratinoso se haya disuelto. Posteriormente se procede a la observación al microscopio,
utilizando primero los aumentos
IDENTIFICACIÓN MEDIANTE SU MORFOLOGÍA
B. CARACTERÍSTICAS MACROSCOPICAS
A partir de los cultivos realizados en medios selectivos para el aislamiento de dermatofitos
(medios tipo SDA+ antibiótico+ cicloheximida) se pueden identificar las especies más
frecuentes. Los dermatofitos son hongos hialinos que forman colonias que presentan en
general colores claros, con gamas de color restringidas a tonos blanquecinos, amarillentos y
marronáceos (Figura 3). En pocas ocasiones se observan colonias con colores oscuros u
otras tonalidades (azules, verdosas, negras, etc.) (Figura 4). Si bien la coloración de las
colonias y su textura puede ayudar a identificar estas especies, las características
microscópicas son las que determinan su identificación en la mayoría de los casos.
Fig. 3. Primocultivo de una muestra de dermatofitosis. Se observan colonias de T.
mentagrophytes en cultivo puro desarrollándose sobre los pelos inoculados.
Fig. 4. Primocultivo de una muestra de dermatofitosis. Se observan colonias amarillentas
(dermatofitos) y otras de diversos colores más oscuros (hongos contaminantes).
C. CARACTERÍSTICAS MICROSCOPICAS
Existen diferentes estructuras microscópicas a tener en cuenta para la identificación de
estos hongos (clamidosporas, distintos tipos de hifas, etc.). No obstante, la forma y
distribución de macroconidios y microconidios es fundamental a la hora de definir los
géneros y especies (Figura 5).
Para determinar la presencia de estas estructuras a partir del cultivo, se realiza una
preparación entre porta y cubre con un pequeño fragmento de una de las colonias con
el fin de observarla al microscopio. Se aconsejan líquidos de montaje tipo lactofenol de
Amman, lactofenol azul de algodón o lactofucsina. En algunos casos, especialmente en
el primocultivo y en caso de utilizar medios de cultivo con actidiona (incorporada en la
mayoría de los medios selectivos para dermatofitos), es difícil observar la formación de
estos conidios. O bien no presentan la forma característica, o simplemente no se han
formado.
En este caso se deberá realizar paralelamente un subcultivo en un medio carente de
inhibidores (tipo SDA, PDA) y/o un microcultivo con el fin de observar más adecuada
mente la conidiogénesis.
Existen especies que no forman, o lo hacen raramente, macroconidios y/o microconidios
(ej. T. violaceum). Por otra parte, algunas cepas pertenecientes a determinadas especies
identificables morfológicamente por producir algún tipo de estas estructuras, no las
suelen producir. Así, por ejemplo, aislamientos de T. mentagrophytes o T. rubrum pueden
no formar macroconidios.
Cuando existen dificultades en la identificación de estos hongos utilizando sus
características morfológicas, ya sea por semejanza entre las especies o por falta de
estructuras útiles para su identificación, se suelen utilizar otros caracteres distintos a los
morfológicos, haciendo uso de técnicas que incluyen pruebas bioquímicas, fisiológicas,
ensayos nutricionales, ensayo de perforación del pelo in vitro, etc.
Figura 5. Diferentes tipos de macroconidios (a-f), microconidios (g-j), clamidosporas (k-
m) e hifas (n-p)
Microsporum canis
Microsporum gypseum
Trichophyton mentagrophytes
Trichophyton rubrum
Epidermophyton floccosum
D. METÓDO DIRECTO CON HIDRÓXIDO DE POTASIO AL 10%
Fundamento del método
El hidróxido de potasio al 10%, es una solución que disuelve la queratina y
se utiliza para muestras clínicas con abundantes células y restos celulares,
sin afectar la morfología de los elementos fúngicos, permitiendo una mejor
visualización de estos.
Tipo de muestra
Muestras clínicas de piel, uña y cabello.
Secreciones: vaginal, ótica, heridas.
Equipos requeridos
Microscopio binocular.
Mechero Bunsen.
Insumos requeridos
Materiales
a. Lámina portaobjeto 75 x 25 mm, limpia y desengrasada.
b. Lámina cubreobjetos 22 x 22 mm.
c. Pipeta de transferencia estéril de 2 mL.
d. Frasco color ámbar y con tapa.
e. Asa de siembra.
f. Guantes estériles descartables.
g. Respirador N95.
h. Mandil o chaqueta.
i. Plumón marcador.
j. Bolsas de bioseguridad para eliminar residuos.
k. Contenedor para residuos sólidos.
l. Papel toalla.
m. Papel plastificado.
n. Contenedor de plástico para material punzocortante.
Reactivos
a. Hidróxido de potasio al 10% (KOH 10%).
b. Hipoclorito de sodio comercial.
Condiciones previas
Preparar el hidróxido de potasio al 10%
Procedimiento
a. Con un plumón marcador, escribir en el borde de la lámina portaobjeto el código de la
muestra clínica a examinar.
b. Dispensar una gota del KOH al 10% en el centro de la lámina portaobjeto.
c. Esterilizar a la llama el asa de siembra.
d. Agregar con el asa de siembra, sobre la gota del KOH 10%, una porción de la muestra
clínica a examinar.
e. Colocar una laminilla cubreobjetos encima de la preparación y dejar a temperatura
ambiente por tres minutos.
f. Observar al microscopio con objetivos de 10X y 40X
Resultados
Negativo: ausencia de elementos fúngicos
Positivo: se observa elementos fúngicos y se reporta de la siguiente manera:
● Presencia de hifas hialinas y tabicadas.
● Presencia de levaduras.
● Presencia de hifas y levaduras.
E. CULTIVO E IDENTIFICACIÓN DE HONGOS
Fundamento del método
El cultivo es un procedimiento de diagnóstico específico que nos permite tipificar con
certeza el género y la especie causal de la micosis causada por hongos filamentosos. El
diagnóstico se basa fundamentalmente en el uso de claves taxonómicas que aplica
criterios morfológicos, macro y microscópicos, relacionado con la fase de reproducción
asexual, que observamos en el cultivo.
Tipo de muestra
Muestras de piel, uñas, pelo, mucosa, úlcera, esputo, líquidos corporales,
material purulento, biopsia o cepa.
Equipos requeridos
a. Microscopio binocular.
b. Incubadora a 37 °C ± 0,5 °C
c. Mechero Bunsen.
Insumos requeridos
Materiales
a. Asa de siembra.
b. Tubo de cultivo de 13 x 100mm.
c. Algodón.
d. Plumón marcador.
e. Papel plastificado.
f. Respirador N95.
g. Papel toalla.
h. Contenedor para eliminar los residuos.
i. Bolsas de bioseguridad.
Medios de cultivo
a. Agar Sabouraud dextrosa (ASD).
b. Agar papa dextrosa (APD) u otro medio de cultivo especializado.
Reactivos
a. Hipoclorito de sodio comercial.
Condiciones previas
a. Preparar los medios de cultivo agar Sabouraud dextrosa (ASD) con cloranfenicol, agar
papa dextrosa (PDA) u otro medio de cultivo especializado.
Procedimiento
a. Procesar las muestras de forma inmediata, preferentemente.
b. Sembrar la muestra en cuatro tubos con el medio de cultivo elegido
c. Incubar entre 25 °C a 30 °C entre 7 a 30 días como máximo
Resultado
A partir de las colonias que han crecido en los tubos con el medio de cultivo elegido,
identificar el género y especie del hongo filamentoso.
Morfología macroscópica
● El color de las colonias presentan, en general, colores claros, desde tonos
blanquecinos, verdes, amarillentos a marrón claro o negro.
Morfología microscópica
● Las características microscópicas, determina su identificación en la mayoría de los
casos.
● Observar al microscopio a 40X y aplicar los criterios de identificación, de acuerdo con
lo explicado en teoría o la referencia bibliográfica consultada.
BIBLIOGRAFÍA:
1. Manual de procedimientos técnicos para el diagnóstico micológico / Elaborado por
Susana Zurita Macalupú y Flor Urcia Ausejo, con la colaboración de Alida Navarro
Mariñas .-- Lima: Ministerio de Salud, 2017
2. Elsevier: Toma de Muestras y Examen Directo en Dermatomicosis – Actasdermosifiliogr.
2016; 107(1):65-67
3. Cabañes, FJ., & Cabañes Saenz, F. J. (2001). Identificación de hongos dermatofitos.
En Guía práctica de identificación y diagnóstico en micología clínica (1 ed., Vol. 1, pp.
12-1-12-12).
4. Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn WC. Diagnóstico
microbiológico. 7a ed. Buenos Aires: Médica Panamericana; 2017.