PCR
Reacción en cadena de la polimerasa
Polimerace Chain Reaction
PCR
Desarrollada en 1986 por Kary mullis
Marca un antes y después de la biología molecular
PCR
Para cada paso se requiere un gradiente de
temperaturas
Clave es la enzima Taq polymerase
Enzima termoestable de la bacteria Thermus
aquaticus
PCR
Técnica para la replicación del ADN “in vitro”.
• Amplificación enzimática en ciclos repetidos.
• Fragmento de ADN específico.
• Basada en el proceso de replicación in-vivo Este proceso
sucede manera permanente en los seres vivos
• Duplicación del ADN in vivo:
• 1) desnaturalización
• 2) duplicación
• 3)Reaparamiento.
PCR
Técnica enzimática en vitro.
Amplifica selectivamente una secuencia determinada.
Amplifica (hace copias) cíclicamente. Emula la replicación.
Consta de tres pasos:
1
1. Desnaturalización
2. Hibridación
3. Extensión
3
PCR
El gradiente de temperatura va de mayor a menor:
Desnaturalización: 92-95° C para romper los puentes de hidrogeno
Hibridación o annealing: entre 40-60° C para unión de 2 cebadores/iniciadores
complementarios.
Extención: Optima aprox. 72°C Taq polimera copia la cadena molde.
Se emula la replicación
Variantes de PCR
• Hot Start
• Multiplex
• In situ
• Anidado
• Touchdown
• Transcriptasa reversa RT-PCR
• rt-PCR q-PCR Tiempo real
PCR
Replicación in vivo Replicación in vitro
Segmento a copiar .
Enzimas
Cebadores
Presenta fragmentos de
Okasaki
Función correctora
PCR
Termociclador
PCR
.
PCR
Amplificación exponencial
235
34000 millones de
22 23 copias
21
PCR
Los ciclos se repiten entre 20-45
Tras 20 ciclos 1 millón de copias
Tras 30 ciclos 1000 millones y así...
Cada ciclo lleva de 3-4 minutos
PCR
Elementos que se requieren en la síntesis del ADN por PCR
1)Templado 2) Enzima 3) Cebadores 4) Nucleotidos 5) amortiguador Mg
Master Mix
1) ADN Templado (target)
2) ADN Polimerasa:
Taq PolimerasaThermus aquaticus
Estable a 95°C (desnaturalización del ADN)
3) Cebadores (primers): secuencia corta de
*5 nucleótidos complementaria a la hebra templado.
4) dNTPs : desoxirribonucleótidos tri-fosfatados
(ATP, GTP,СТР, ТТР)
5) Buffer (TrisHCI, KCI) con Mg2+ (1-2.5mM) y PH 8
PCR
Es un cofactor
enzimático que
influye en la
especificidad de
la reacción.
PCR
. Master Mix
(vol x N°
muestras)
Evitar error de pipeteo
PCR
PCR
[Link]
es/products/pcr/taq-
polymerase/gotaq-dna-
polymerase/?catNum=M3001
.
PCR
Reactivos Concentración inicial Concentración final Volumenes por
reacción
GoTaq® DNA 5U/µl 1.25 U 0,125 µl
polimerasa
Buffer 5X 1X 5 µl
MgCl2 - 1,5mM
Primer 1 10µM 0,6 µM 1.125 µl
(0.1µM-1.0 µM)*
Primer 2 10µM 0,6 µM 1.125 µl
(0.1µM-1.0µM)*
dNTPs 2mM 0.2 mM 2.5 µl
Molde µg/ml 2ng(1pg-1µg)* 10 µl
H2O milli Q - - 5.125 µl
TOTAL de reacción 25 µl
C1*V1=C2*V2
10µM*x=0,6 µM*25 µl
x=(0,6 µM*25 µl)/ 10µM*
X=1,5ul
5U---------1ul
PCR 1.25U-----x ul
X=0.25
Reactivos Concentración Concentración final Volumenes por Volumen para
inicial reacción 11 reacciones
GoTaq® DNA 5U/µl 1.25 U 0.25 µl
polimerasa
Buffer 5X 1X 5 µl
MgCl2 - 1,5mM
Primer 1 10µM 0.6µM (0.1µM- 1.5 µl
1.0µM)*
Primer 2 10µM 0.6µM (0.1µM- 1.5 µl
1.0µM)*
dNTPs 2Mm 0.2 mM 2.5 µl
Molde µg/ml 2ng(1pg-1µg)* 10 µl
H2O milli Q - - µl
TOTAL de 25 µl
reacción
dNTPs
Con ayuda de la hoja de información del Set de dNTPs, indicar los
volúmenes de dNTP y de H20 necesarios para obtener 1 ml de una
mezcla de dNTPs de 10 mM
C1.V1 = C2.V2
dNTPs
Con ayuda de la hoja de información del Set de dNTPs, indicar los
volúmenes de dNTP y de H20 necesarios para obtener 1 ml de una
mezcla de dNTPs de 10 mM
C1.V1 = C2.V2
PCR
Llevar a 100 uM
1000 nmol……………...1 umol
22,5 nmol……………. x = 0,0225 umol
100 umol……………...1000 ml solución
0,0225 umol……………. X = 0,225 ml de solución
1 ml H20………………….1000 ul
0,225 ml h20……………x= 225 ul
PCR
1000 nmoles……………...1 umol 100 umoles……………...1000 ml solución
____ nmoles……………. = ____ umoles ____ umoles……………. = _____ml de solución
PCR
AF279916: S. stercoralis 18S rRNA
Par de cebadores específicos:
• Oligos foward de 28pb y Reverse de 23 pb
• Amplifican un producto de 101 pb para la secuencia específica.
( Repetto et al., 2013; Verweij et al., 2009)
La temperatura de fusión del cebador (Tm) se refiere a la temperatura a la cual los
cebadores se separan del ADN.
La temperatura de alineamiento (annealing) (Ta) es aquella en la que los cebadores se
unen con éxito.
Por lo tanto, la temperatura de alineamiento debe ser menor que la Tm de los
cebadores.
Generalmente, la temperatura de alineamiento es de 55-60˚C, pero si la bajamos, es decir, entre 45-
55˚C, se promueve la unión al ADN. Esta es la temperatura más favorable para la unión del ADN; sin
embargo, al mismo tiempo, aumenta el riesgo de unión inespecífica y la formación de dímeros de
cebadores. Por eso se utiliza un margen muy estrecho con condiciones estrictas. Si mantenemos la
temperatura de alineamiento muy cerca de la Tm del cebador, se evitará la unión inespecífica.
La Tm del cebador se puede identificar mediante el siguiente método:
[Link]ón de Wallace:[4˚C × (G+C) + [2˚C × (A+T)]
[Link]ón de Marmur y Doty:64.9 + [41 × (G+C) – 16.4] / (total de bases(A+T+G+C))
La temperatura de alineamiento (Ta) elegida para la PCR depende directamente
de la longitud y la composición de los cebadores. Generalmente, se recomienda
usar una temperatura de alineamiento aproximadamente 5°C por debajo de la
Tm de los cebadores. La temperatura de alineamiento óptima (Ta Opt) para un
par de cebadores en un objetivo particular se puede calcular de la siguiente
manera:
Ta Opt = 0.3 x (Tm del cebador) + 0.7 x (Tm del producto) – 14.9
donde Tm del cebador es la temperatura de fusión del par cebador-plantilla
menos estable, y Tm del producto es la temperatura de fusión del producto de
la PCR.
[Link]
scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-
biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/[Link]
PCR
Secuencia diana o blanco
Diseño de cebadores o primers
Selección de controles
Mezclas de reacción
Condiciones de ciclado
Detección del producto de amplificación
PCR Biología Molecular- PhDc Paola Vargas
✓ Espectrofotometría:
Concentración:
ADN 260nm UV
Proteína 280 nmUV
Pureza:
260/280= ≥2
PCR
Valoración y cuantificación de ADN
Figura 1. Espectro del perfil de Ácidos
Nucleicos con picos y valles típicos.
Fuente:[Link]
PCR
Valoración y cuantificación de ADN
Figura 2. Perfiles de las curvas de absorción de los productos de extracción de los métodos KC1: Kits Comercial 1, KC2: Kits
Comercial 2, IH1: In House 1, IH2: In House 2. La línea roja representa los 260 nm y las líneas azules 230 y 280 nm.
Tabla II. Análisis espectrofotométrico del ADN de 25 Larvas L3 extraídos por 4 métodos de extracción y purificación
KC1: Kit Comercial 1, KC2:Kit Comercial 2, IH1: In House 1, IH2: In House 2.
*Promedio de 3 muestras. +Un cociente
260/280 de ~1.8
Concentración Coc.260/280 Coc.260/230 Rendimiento
N° Muestra * Abs260 Abs280 + + Factor
1 KC1 26.8 ng/µl 0.535 0.152 3.53 0.08 50 2.68 µg
0.81 µg
2 KC2 8.1 ng/µl 0.162 0.119 1.3 0.4 50
1.58 µg
3 IH1 15.8 ng/µl 0.315 0.195 1.62 0.14 50
28. g
4 IH2 2.8 ng/µl 0.056 0.043 1.3 0.68 50
PCR Biología Molecular- PhD Paola Vargas
[Link]
PCR
Figura 3. Electroforesis de los productos de extracción en gel de agarosa al 2.5%.
Calle1: KC1. Calle2: KC2, Calle 3: Bco, Calle 4: MPM, Calle 5: Bco, Calle 6:
IH2, Calle 7: IH1.
PCR
OJO este gel es de
integridad de ADN
NO de PCR
PCR
PCR
PCR
PCR
[Link]
PCR
Características de los primers:
✓ Ser específicos.
✓ De 18-25 bases (máximo 30)
✓ Temperatura se melting/anneling 50-60°
✓ Contenido de G-C 40-60% ( para estabilidad y
TM)
✓ Evitar mas 3 repeticiones consecutivas de una
base (AAAAUUUUU)
✓ La TM tiene que ser lo mas parecidas entre
ambos primers (max 5°dif).
✓ Observar los extremos 5” y 3” de cada primer
para que no sean complementarios (primer
dimer/dimeros de primers.
Loops/horquillas. Apareamiento entre si/dímeros/ primerdimer
Loops/horquillas. Apareamiento entre si/dímeros/ primerdimer
[Link]
PCR
[Link]
[Link]
PCR
[Link]
PCR
Para comenzar a buscar gen de interés:
Ojo tomar en cuenta
✓ Revisión bibliográfica
✓ Selecciono un gen, debe ser conservado ej: 18S
✓ Busco la secuencia en una base de datos ej: NCBI
✓ Normalmente encuentro un fragmento de gen con su código.
✓ Según el objetivo/uso selecciono la longitud del fragmento.
✓ De ese fragmento seleccionaré una secuencia mas pequeña
de mi interés llamado Blanco.
✓ Mi secuencia blanco estará flanqueada por 2 primes
antisentido, una llamado reverse y forward
✓ Debo revisar que no se formen dímeros de primer ni
loop/hoquillas
✓ Evaluó la sensibilidad y especificidad in sílico.
PCR
Secuencia diana o blanco
Cebadores o primers
Tabla III. Cebadores específicos para la región 18S rRNA S. stercoralis.
GEN Tamaño
(Cod. GenBank) Secuencia de primers del
producto
[Link] F 5´-GAATTCCAAGTAAACGTAAGTCATTAGC-3´ 101 pb*
18SrRNA
(AF279916)
R 5´-TGCCTCTGGATATTGCTCAGTTC-3´
PCR
[Link]
PCR
PCR IN SILICO S Y E
Código del gen:
Región:
Organismo:
Tamaño del producto de amplificación:
Primer foward:
Primer Reverse:
Amplicon o producto amplificado:
PCR
Sensibilidad (S): Capacidad de la prueba para
detectar a un sujeto enfermo.
Especificidad (E): Capacidad que tiene la prueba de
identificar como sanos (no enfermos) a los que
efectivamente lo son.
Criterio de verdad
Enfermos No enfermos Total
Prueba Positivos VP FP VP+FP
diagnóstica
Negativos FN VN FN+VN
Total VP+FN FP+VN N = (VP+FP+FN+VN)
PCR
BioEdit
[Link]
downloading
PCR
PCR
PCR