EFECTO DEL SUSTRATO EN ACTIVIAD DE LA CATALASA

Univ. SOLIZ RIOS ROGER FRANZ

Medicina, Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad Mayor de San Andres
Aux. Diego Soza Dra. Noemí Tirado

1 INTRODUCCIÓN

Las reacciones bioquímicas que ocurren en los organismos vivos son fundamentales para el
mantenimiento de la homeostasis y la continuidad de la vida; sin embargo, muchas de ellas poseen barreras
de energía de activación tan elevadas que, en condiciones fisiológicas normales de temperatura y presión,
ocurrirían a velocidades excesivamente lentas. Para solventar esta limitación cinética, las células emplean
biocatalizadores altamente especializados denominados enzimas. Estas macromoléculas, mayoritariamente
de naturaleza proteica, incrementan la velocidad de las reacciones químicas hasta en varios órdenes de
magnitud sin consumirse en el proceso ni alterar el equilibrio termodinámico de la reacción. Su
funcionamiento molecular se basa en la unión específica y complementaria con un sustrato en una región
tridimensional denominada sitio activo, disminuyendo la energía libre del estado de transición y facilitando
la conversión de reactivos en productos.

En el contexto del metabolismo celular aerobio, la reducción parcial del oxígeno molecular (O2) da lugar a
la formación continua de subproductos citotóxicos e inestables conocidos como especies reactivas del
oxígeno (ERO). Entre estas moléculas destaca el peróxido de hidrógeno (H2O2), el cual es generado de
forma fisiológica por diversas rutas metabólicas endógenas, tales como la beta-oxidación de ácidos grasos
en los peroxisomas y la fuga de electrones en la cadena respiratoria mitocondrial. A pesar de cumplir
funciones cruciales de señalización celular y respuesta inmune a concentraciones basales homeostáticas, la
acumulación descontrolada y el aumento de la concentración del H2O2 desencadenan estrés oxidativo
severo. Este estado patológico daña componentes estructurales celulares mediante la peroxidación de lípidos
de membrana, la inactivación cruzada de proteínas y la fragmentación irreversible del ácido
desoxirribonucleico (ADN).

Para contrarrestar este peligro citotóxico potencial, los sistemas biológicos han evolucionado desarrollando
una sofisticada y redundante red de defensas antioxidantes, tanto enzimáticas como no enzimáticas. Una de
las enzimas más eficientes, ubicuas e importantes en esta primera línea de defensa celular es la catalasa (EC
[Link]). Esta enzima, clasificada dentro de la familia de las oxidorreductasas, estructuralmente es una
proteína tetramérica compuesta por cuatro subunidades idénticas, cada una de las cuales contiene un grupo
prostético hemo con un átomo de hierro (Fe +3) en su centro activo. La catalasa se encarga de catalizar con
alta especificidad la reacción de dismutación del peróxido de hidrógeno, convirtiéndolo en agua y oxígeno
molecular gaseoso según la siguiente ecuación química:

Esta vía de destoxificación destaca en la naturaleza por presentar una de las constantes cinéticas de recambio
(kcat) más altas conocidas en la enzimología, permitiendo que una sola molécula de catalasa degrade
millones de moléculas de sustrato por segundo. No obstante, la velocidad de esta reacción enzimática no es
constante; se encuentra estrictamente supeditada a diversas variables fisicoquímicas y operacionales del
entorno, entre las que destacan el pH, la temperatura, la concentración de la enzima y, de manera crucial
para este estudio, la concentración del sustrato disponible en el medio.
De acuerdo con los principios de la cinética de Michaelis-Menten, la velocidad inicial de una reacción
aumenta de forma proporcional a la concentración del sustrato en concentraciones bajas, hasta alcanzar una
meseta de saturación donde los sitios activos de la enzima están completamente ocupados. El estudio
experimental y cuantitativo de este comportamiento en la catalasa permite comprender de forma práctica
las leyes fundamentales que rigen la catálisis y la bioenergética biológica.

En el ámbito del laboratorio, la actividad de esta enzima extraída de tejidos vegetales —en este caso,
utilizando el tejido del plátano (Musa paradisiaca) como fuente biológica accesible de catalasa— puede
cuantificarse indirectamente midiendo el volumen de oxígeno gaseoso (O2) desprendido en un sistema
cerrado a lo largo del tiempo. Al recolectar y medir este gas mediante un sistema de desplazamiento
hidroneumático de agua a diferentes volúmenes del sustrato (H2O2), y aplicando la ecuación de estado de
los gases ideales (P*V = n* R*T), es posible calcular rigurosamente el número de moles de sustrato
transformados. Este enfoque metodológico proporciona una base analítica sólida para evaluar el impacto
directo de la disponibilidad del sustrato sobre la eficiencia catalítica, permitiendo correlacionar de manera
empírica los modelos teóricos de la cinética enzimática con variables físicas macroscópicas observables en
la práctica médica y bioquímica.

2 OBJETIVOS

 Evaluar el efecto de la concentración del sustrato (H2O2) sobre la actividad catalítica de la

enzima catalasa extraída del tejido de plátano (Musa x paradisiaca), mediante la cuantificación del
volumen de oxígeno molecular (O2) desprendido en un sistema de desplazamiento hidroneumático
de agua.
 Determinar cuantitativamente la velocidad inicial de la reacción enzimática a diferentes
volúmenes de sustrato (1, 2, 3, 4 y 5 mL), empleando la ecuación de estado de los gases ideales
P*V = n* R*T para calcular los moles de oxígeno generados en intervalos definidos de tiempo.
 Calcular y analizar los parámetros cinéticos fundamentales de la enzima (Velocidad
Máxima, Vmáx, y Constante de Michaelis, Km) mediante la construcción y comparación de las
curvas de saturación clásicas de Michaelis-Menten (v frente a [S]) y la transformación lineal de los
dobles recíprocos en la gráfica de Lineweaver-Burk (1/v frente a 1/[S]).

3 PARTE EXPERIMENTAL
Para comenzar con la parte experimental primero citaremos a todos los materiales que se
usarán en la práctica:

3.1 MATERIALES

REACTIVOS Y MUESTRA BIOLÓGICA:

 Muestra biológica: Plátano (fuente de la enzima catalasa).

 Sustrato: Peróxido de hidrógeno (H2O2).
 Solvente: Agua destilada (o agua común para la demostración).

MATERIALES Y EQUIPOS DE LABORATORIO / CASEROS:

 Recipiente principal para la reacción (con tapa perforada).

  Botella de recolección (preferiblemente pequeña y delgada) llena de agua.
 Recipiente o cubeta hidroneumática con agua (para el soporte y sellado hidráulico de la botella).
 Equipo de venoclisis (manguera con llave reguladora).
 Jeringa (para medir e inyectar 2 mL de peróxido de hidrógeno).
 Plastilina (para asegurar el sellado hermético de las conexiones).
 Mortero y pilón (o licuadora) para la homogenización.
 Cronómetro.
 Regla milimetrada (para medir la altura y el diámetro).

3.2 PROCEDIMIENTO

A. Preparación del Homogeneizado (Enzima)

1. Cortar un trozo de plátano de aproximadamente 2 cm de alto.

2. Moler el trozo de plátano utilizando un mortero (o licuadora si se requiere mayor volumen) junto
con 30 mL de agua hasta obtener una mezcla uniforme denominada homogeneizado.
3. Trasvasar el homogeneizado al recipiente de reacción y tapar herméticamente.

B. Montaje del Sistema de Desplazamiento de Agua

1. Llenar completamente una botella delgada

con agua.
2. Invertir rápidamente la botella dentro de un
recipiente mayor que contenga agua, cuidando
que no ingresen burbujas de aire al interior de
la botella (sello hidráulico).
3. Introducir un extremo de la manguera del
equipo de venoclisis dentro de la botella
invertida. Asegurarse de que la llave
reguladora esté cerrada.
4. Conectar el otro extremo de la manguera al
orificio de la tapa del recipiente que contiene
el homogeneizado.
5. Sellar minuciosamente todas las uniones y
conexiones con plastilina para evitar fugas de
gas.

C. Ejecución de la Reacción y Medición

1. Cargar la jeringa con exactamente 2 mL de peróxido de hidrógeno.

 2. Introducir el sustrato al recipiente de reacción (a
través de la jeringa/conexión) y abrir
inmediatamente la llave del equipo de venoclisis
para permitir el paso del gas.
3. Iniciar el cronómetro de forma simultánea a la
inyección del sustrato.
4. Agitar de manera constante y suave el recipiente
de reacción para favorecer el contacto enzima-
sustrato.
5. Monitorear el desprendimiento de oxígeno
(observado a través del burbujeo y
desplazamiento del agua en la botella invertida).
Registrar el comportamiento a los 30 segundos y
al cumplirse 1 minuto.

*** Realizar esta ultimo procedimiento con 1, 2, 3, 4 y 5 mL de sustrato

D. Registro de Datos y Cálculos

1. Al finalizar el tiempo de reacción, medir con una regla la altura del volumen de agua desplazado
(oxígeno acumulado) y el diámetro de la botella.
2. Calcular el volumen de gas generado a partir de las dimensiones geométricas registradas.
3. Utilizar la ecuación de estado de los gases ideales (conocida coloquialmente como la fórmula del
"pavo ratón": P*V = n* R*T) para determinar el número de moles de oxígeno (n) producidos durante
la catálisis.

4 CÁLCULOS Y RESULTADOS
CUADRO N1
Valores volumétricos, molares y parámetros cinéticos de la dismutación del H2O2 por la catalasa de Musa
x paradisiaca a diferentes concentraciones de sustrato.

Recíproco Recíproco
Vol Diámetro H Moles O2 Veloc de
Vol O2 Sustrato Velocidad
[S] Botella Despl Producidos Reacción v
(mL) 1/[S] 1/v
(mL) (cm) (cm) (n) (mol/min)
(mL−1) (min/mol)
1 5.0 1.4 27.49 7.43 x 10-4 7.43 x 10-4 1.000 1345.9
2 5.0 1.7 33.38 9.02 x 10-4 9.02 x 10-4 0.500 1108.6
3 5.0 2.1 41.23 1.11 x 10-3 1.11 x 10-3 0.333 900.9
4 5.0 2.5 49.09 1.33 x 10-3 1.33 x 10-3 0.250 751.9
5 5.0 2.8 54.98 1.49 x 10-3 1.49 x 10-3 0.200 671.1

FUENTE: ELABORACION PROPIA

GRÁFICOS DE CINÉTICA ENZIMÁTICA

1. Cinética de Michaelis-Menten
Curva de saturación que representa la relación entre la concentración del sustrato y la velocidad de
reacción.
2. Representación de Lineweaver-Burk
Representación lineal de los dobles recíprocos para el análisis cinético enzimático.

5 DISCUSIÓN DE RESULTADOS

El análisis experimental de la catalasa extraída de Musa x paradisiaca (plátano) expuesta a concentraciones

crecientes de peróxido de hidrógeno (H2O2) permitió validar los postulados fundamentales de la cinética de
Michaelis-Menten. Los datos consolidados en el Cuadro N°1 demuestran cómo las variaciones geométricas
en la altura del volumen de agua desplazado guardan una relación proporcional directa con el incremento
volumétrico del sustrato aplicado, traduciéndose en una mayor generación molar de oxígeno molecular (O2).

Al evaluar la curva de saturación en la gráfica de Michaelis-Menten (Velocidad de reacción v frente a la

Concentración del sustrato (S), se aprecia el comportamiento hiperbólico característico de los
biocatalizadores saturables. A concentraciones bajas de sustrato (1 mL a 3 mL), la velocidad inicial exhibe
una cinética de primer orden, incrementándose de forma casi lineal (7.43 x 10-4 a 1.11 x 10-3 mol/min)
debido a la amplia disponibilidad de sitios activos libres. No obstante, al transicionar hacia los volúmenes
de 4 mL y 5 mL, la pendiente hiperbólica comienza a suavizarse notablemente, alcanzando una velocidad
de 1.49 x 10-3 mol/min. Este fenómeno denota una cinética de orden cero, lo cual indica que el sistema se
aproxima gradualmente a la saturación total de los centros activos tetraméricos con el grupo hemo de la
enzima.

Para determinar con precisión los parámetros cinéticos sin las limitaciones matemáticas de una estimación
visual, se analizaron los dobles recíprocos mediante la Representación de Lineweaver-Burk (1/v frente a
1/(S). A partir de la regresión lineal exacta ejecutada (y = 852.12x + 550.56), se logró calcular
matemáticamente la Velocidad Máxima (Vmáx) y la Constante de Michaelis (Km).

La Vmáx, despejada del intercepto en el eje de ordenadas (1/Vmáx = 550.56), arrojó un valor teórico de
1.816 x 10-3 mol/min bajo las condiciones locales de La Paz (0.65 atm y 20°C). Por otra parte, la constante
Km, determinada a partir del producto de la pendiente por la Vmáx, resultó en 1.547 mL. Desde una
perspectiva fisiológica, este bajo valor de Km denota una afinidad catalítica sumamente elevada de la
catalasa vegetal por el peróxido de hidrógeno. Esto corrobora su rol biológico crítico en la primera línea de
defensa antioxidante celular, asegurando una depuración eficiente del H2O2 citotóxico para prevenir el estrés
oxidativo y el daño irreversible al ADN celular.

Es pertinente señalar que la ligera dispersión observada en ciertos puntos experimentales respecto a la recta
ideal de Lineweaver-Burk puede atribuirse a variables operacionales propias del diseño metodológico
caserdo. Factores como fluctuaciones sutiles en la agitación manual del recipiente de reacción , variaciones
mínimas de la temperatura ambiente durante los ensayos sucesivos o el escape de gas debido a la elasticidad
de los sellos de plastilina constituyen fuentes potenciales de error experimental., asi mismo es referente el
validar la idoneidad de la catalasa de Musa x paradisiaca como modelo de estudio de la cinética enzimática
y la destoxificación metabólica aerobia.

6 CONCLUSIONES

 Se demostró con éxito el efecto directo de la disponibilidad del sustrato sobre la actividad de la catalasa
presente en el homogeneizado de Musa x paradisiaca (plátano). Se comprobó experimentalmente que un
incremento en el volumen de peróxido de hidrógeno H2O2 produce un aumento proporcional en el
desprendimiento de oxígeno molecular O2 gaseoso, validando el comportamiento hiperbólico típico y el
carácter saturable de los biocatalizadores celulares bajo el modelo cinético clásico.

 Se determinó cuantitativamente la velocidad inicial de la reacción para cada sistema empleando la

ecuación de estado de los gases ideales. Los cálculos cinéticos registraron velocidades que ascendieron
desde 7.43 x 10-4 mol/min (para 1 mL de sustrato) hasta un máximo de 1.49 x 10-3 mol/min (para 5 mL de
sustrato), evidenciando la transición de una cinética de primer orden a concentraciones bajas hacia una de
orden cero a medida que el sistema se aproximaba a la saturación.

 Se calcularon con precisión analítica los parámetros cinéticos fundamentales de la catalasa vegetal
mediante el método de los dobles recíprocos de Lineweaver-Burk. A partir de la ecuación lineal obtenida
(y = 852.12x + 550.56), se estableció una Velocidad Máxima (Vmáx) teórica de 1.816 x 10-3 mol/min y
una Constante de Michaelis (Km) de 1.547 mL. El bajo valor de Km obtenido confirma la alta afinidad de
la enzima por el H2O2, consolidando su importancia fisiológica celular en la depuración inmediata de
especies reactivas del oxígeno para la preservación de la homeostasis y la integridad molecular frente al
estrés oxidativo.

7 BIBLIOGRAFÍA

 Nelson DL, Cox MM. Lehninger Principios de Bioquímica. 7a ed. Barcelona: Ediciones Omega; 2018.

 Rodwell VW, Bender DA, Botham KM, Kennelly PJ, Weil PA. Harper. Bioquímica ilustrada. 31a ed.
México DF: McGraw-Hill Interamericana; 2018.

 Hall JE, Hall ME. Guyton & Hall. Tratado de fisiología médica. 14a ed. Barcelona: Elsevier; 2021.