Introducción:
• Van a escuchar de nuevo las mismas clases (algunos ya familiarizados con
MLPA y array CGH).
• Para los que se enfrentan por primera vez, pregunten todo.
• Técnicas del día: MLPA y array CGH.
• Objetivo común: Evaluar dosis (ganancia o pérdida de material genético).
• Gran diferencia:
o MLPA: Hay que tener una sospecha más dirigida. Se evalúa una
región particular del genoma.
o Array CGH: Cubre todo el genoma.
Contexto histórico y técnico:
• Técnicas surgidas entre 2000 y 2010, incorporadas al ICCN (libro de
nomenclatura de citogenética y citogenómica) recién entre 2009 y 2013.
• Cuatro grandes técnicas en citogenómica para evaluar dosis:
1. FISH (ya la vieron)
2. MLPA
3. Array CGH (a ver hoy)
4. Mapeo óptico (mencionado, no en el curso)
MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification):
• Es uno de los gold standards para ver cambios de dosis en una región
determinada del genoma.
• Fabricante: MRC Holland (monopolio de la técnica). Hay más de 400 kits
disponibles para casi todas las patologías por ganancia o pérdida de
material.
• Cantidad de sondas: Hasta 60 sondas por kit, que pueden evaluar hasta 60
loci (pueden estar en un mismo gen, una misma región cromosómica, o en
múltiples cromosomas).
• Ventaja: Técnica sencilla. Se necesita un termociclador (común en cualquier
laboratorio de biología molecular). En una tarde (día 1) y una mañana (día 2)
está terminada.
Componentes del kit de MLPA:
• Reactivos comunes (Kit K1, K2, etc.): Se compran una vez. Son comunes a
cualquier kit de sondas.
• Sondas específicas: Se compran aparte. Vienen en un tubo y contienen
hasta 60 hemisondas (vienen fragmentadas a la mitad).
[Página 2 - Estructura de las hemisondas]
Estructura de cada hemisonda (de 5' a 3'):
1. Región azul (hibridación): Secuencia que hibrida específicamente con el
ADN del paciente en la región de interés.
2. Secuencia Stuffer (rosada): Le confiere un tamaño diferente a cada sonda.
Es lo que permite separar los fragmentos en electroforesis capilar.
3. Región negra (cebadores universales): Secuencia donde hibridan los
primers específicos del kit. Es la misma para todas las sondas de todos los
kits. No hibrida con ningún lugar del genoma humano.
Primers universales: Son fluorescentes (vienen en tubo color caramelo para
protegerlos de la luz). Es el mismo par de primers para amplificar todas las sondas
de cualquier kit.
[Página 3 - Procedimiento de MLPA: Preparación e
Hibridación]
Preparación de las muestras:
• Cuantificación: Se llevan todas las muestras a una misma concentración.
• Cantidad de ADN: 100 ng (poco comparado con array o NGS, que
requieren ~500 ng).
• Referencias: Se deben incluir al menos 3 referencias (ADN sin pérdidas ni
ganancias para las regiones evaluadas).
o Por qué 3: El programa de análisis promedia las referencias. Si una
sola falla, no hay con qué comparar.
o Se incluye también un blanco.
Procedimiento (Día 1 - Hibridación overnight):
1. Desnaturalización: Se desnaturaliza el ADN (100 ng en 5 µL) en un
termociclador por unos minutos.
2. Hibridación: Se añade la mix de sondas específicas. Se incuba
a 60°C durante 16-18 horas (overnight).
o Todas las sondas de los 400 kits están diseñadas para hibridar a 60°C.
o Hibridan las hemisondas que encuentran su secuencia blanco en el
ADN del paciente.
o Si el paciente tiene una deleción en homocigosis, la hemisonda no
hibrida.
o Si tiene una deleción en heterocigosis, la hemisonda hibrida en la
mitad de la cantidad comparada con las referencias.
[Página 4 - Procedimiento de MLPA: Ligación, PCR y
Electroforesis]
Procedimiento (Día 2 - Ligación y PCR):
1. Ligación: Se añade ligasa al termociclador (15-20 minutos a la temperatura
óptima). Es el paso crítico.
o Solo liga lo que ha hibridado. Si no hibridó, los dos fragmentos de la
hemisonda quedan flotando y no se ligan.
2. PCR fluorescente: Se usa un único par de primers universales (el forward
está marcado con fluorescencia).
o Se amplifica la sonda ligada, NO el ADN del paciente. La cantidad
de sonda amplificada es indirectamente proporcional a lo que ocurre
en el ADN del paciente.
o Todos los amplicones tienen distinto tamaño (gracias a la
secuencia stuffer), generalmente entre 50 y 500 pb.
3. Chequeo en gel de agarosa: Se corre un gel para verificar que haya un
"chorreadito" entre 50 y 500 pb en las muestras, y que no haya nada en el
blanco. Si está bien, se procede a la electroforesis capilar.
Electroforesis capilar y análisis:
• Resultado: Electroferograma con picos para cada amplicón (entre 50 y 500
pb). En verde la referencia, en celeste la muestra.
• Programa de análisis: COFFALYSER (se descarga gratis de la página de
MRC Holland).
o Convierte los picos (ordenados por tamaño) en puntos ordenados
por posición cromosómica.
o Normalización: El programa ubica la dosis normal (igual a la
referencia) en 1 (entre líneas azul y roja).
o Deleción en heterocigosis: puntos en 0.5 (por debajo de la línea
roja).
o Deleción en homocigosis: no hay pico, estaría en 0.
o Duplicación en heterocigosis: puntos en 1.5 (por encima de la línea
azul).
o Duplicación en homocigosis: puntos en 2.
[Página 5 - Controles de Calidad en MLPA]
Controles internos del kit de MLPA:
• D-fragments (4 picos bajos, control de desnaturalización):
o Son 4 hemisondas que hibridan en islas CpG (regiones ricas en C y G,
más difíciles de desnaturalizar por tener 3 puentes de hidrógeno).
o Si estos D-fragments amplificaron, significa que la desnaturalización
fue eficiente en regiones difíciles, por lo que el resto también lo hizo.
• Q-fragments (4 picos altos en el blanco, control de cantidad de ADN):
o Son 4 sondas que ya vienen ligadas (independientes de la muestra).
Siempre amplifican.
o En el blanco (sin ADN), solo amplifican los Q-fragments (se ven altos).
o En las muestras, los Q-fragments vienen en baja dosis y son
despreciables si se puso la cantidad correcta de ADN. Si los Q-
fragments se ven altos en la muestra, indica que se puso poco
ADN (error de pipeteo).
[Página 6 - Resolución, Nomenclatura y Versiones del
Genoma]
Resolución del MLPA:
• Depende del kit. Pueden tener todas las sondas en un mismo gen (ej. BRCA),
en una región cromosómica (ej. síndrome de Williams o DiGeorge), o en
múltiples cromosomas (ej. subtelomérico).
Nomenclatura de una deleción en MLPA (según ICSN):
• Ejemplo: arr[GRCh36] 22q11.2(18,894,000-21,456,000)x1
• Comienza con arr, luego entre corchetes la versión del genoma (GRCh36 es la
versión 36, del año 2006).
• Importante: MRC Holland sigue usando la versión 36 del genoma de
referencia (a pesar de que existen la 37, 38 y T2T).
• Problema: Diferentes técnicas pueden usar diferentes versiones del genoma
(MLPA usa 36, array usa 37 o 38, NGS usa 38). Para unificar resultados, hay
que convertir coordenadas usando herramientas como Liftover (UCSC o
Brody Institute). La versión 36 ya no aparece en algunas herramientas.
• Nomenclatura extendida: Se usa cuando hay mucha distancia entre la
última sonda normal y la primera afectada. Se pone la sonda anterior y
posterior en dosis normal, y la región delecionada entre guiones.
[Página 7 - MLPA de Subtelómeros y de Metilación]
MLPA de regiones subteloméricas:
• Kit con una sola sonda por cada brazo corto y largo de cada cromosoma.
Útil para ver rearreglos cromosómicos.
• Ejemplo: deleción en heterocigosis en 6p y duplicación en heterocigosis en
10p → sugiere un cromosoma derivado. Se confirmaría con FISH (permite
ver la posición).
MLPA de metilación:
• Uso: Regiones sujetas a imprinting (ej. Prader-Willi, Angelman, Beckwith-
Wiedemann, Silver-Russell).
• Procedimiento: Después de la hibridación overnight, se divide la muestra
en dos tubos:
o Tubo 1 (dosis): Ligaza → PCR. Da la dosis.
o Tubo 2 (metilación): Ligaza + enzima de restricción sensible a
metilación (ej. HhaI) → PCR.
▪ La enzima corta si la región no está metilada. Al cortar, separa
los sitios de unión de los primers y no hay amplificación.
▪ Si la región está metilada, la enzima no corta, hay
amplificación.
• Interpretación (para metilación, no dosis): El programa COFFALYSER
ubica:
o 1 = 100% metilado (se amplifica, no cortó).
o 0.5 = 50% metilado (un alelo metilado, el otro no).
o 0 = 0% metilado (cortó todo, no amplifica).
[Página 8 - MLPA de Metilación para Fragilidad del X]
Ejemplo en gen FMR1 (cromosoma X, ligado al sexo):
• Solo se usa en varones (un solo X). En mujeres, la metilación al azar del X
inactivado impide la interpretación.
• Referencia (varón normal): 0% metilado (la enzima corta, no amplifica). Los
picos de las sondas en la región promotora están en 0.
• Paciente con expansión (>200 repeticiones CGG): 100% metilado (la
enzima no corta, amplifica). Los picos están elevados.
• Mosaico de metilación: Los picos están en un valor intermedio (entre 0.5 y
1), indicando que no todas las células están metiladas.
[Página 9 - MLPA de Metilación para Prader-
Willi/Angelman]
MLPA de metilación para región 15q11.2 (Prader-Willi y Angelman):
• Región sujeta a imprinting: genes SNURF-SNRPN se expresan solo en el
alelo paterno (no metilado en el padre, metilado en la madre).
Gen UBE3A se expresa solo en el alelo materno.
• Interpretación (dosis + metilación):
o En una persona normal: 50% metilación (0.5) para los genes de
expresión paterna.
o Ejemplo de la figura: Deleción en heterocigosis en el bloque SNURF-
SNRPN (dosis en 0.5). En el panel de metilación, esas sondas están
en 1 (100% metilado). Esto indica que el alelo que queda es el
materno (está metilado). Por lo tanto, la deleción es en el
alelo paterno, y el paciente tiene síndrome de Prader-Willi.
o Las sondas que no tienen sitio de corte para la enzima de restricción
(sin [HhaI]) se ven en 1 en el panel de metilación porque no son
informativas para metilación.
[Página 10 - MLPA para Variantes Puntuales (Ejemplo:
Hiperplasia)]
MLPA y variantes puntuales:
• MLPA NO es una técnica para variantes puntuales. Pero a veces puede
confirmar una variante puntual ya vista por otra técnica, o dar una sospecha.
• Ejemplo: gen CYP21A2 (hiperplasia suprarrenal congénita)
o Gen y pseudogén (CYP21A1P) con 98% de identidad de secuencia.
o La causa más frecuente de la enfermedad es la conversión
génica (transferencia de variantes patogénicas del pseudogén al
gen).
o El kit de MLPA para CYP21A2 tiene sondas específicas para
el gen (secuencia wild type) y sondas específicas para
el pseudogén (con la mutación). Se evalúan ambas.
o Si un paciente tiene una mutación patogénica (transferida del
pseudogén), no va a amplificar la sonda wild type, pero va a
amplificar más la sonda del pseudogén.
o Conclusión: Es un caso particular. En general, no usar MLPA para
variantes puntuales.
[Página 11 - Regla General para una Sola Sonda
Delecionada]
Regla general para interpretar una sola sonda delecionada:
• Si en un síndrome típicamente causado por una deleción de un bloque de
sondas, solo una sonda está delecionada, puede deberse a una variante
puntual en el sitio de unión/ligación de esa sonda (y no a una deleción
real). Hay que confirmar por otra técnica (ej. secuenciación).
Transición al Array CGH:
• La expositora anuncia un corte y luego pasarán a ver Array CGH.
• Se va al baño y luego continúa.
[Página 12 - Introducción al Array CGH]
Array CGH (Comparative Genomic Hybridization):
• Objetivo: Evaluar dosis (ganancias/pérdidas de material genético) a lo largo
de todo el genoma.
• Soporte: Un vidrio (slide) con miles de oligonucleótidos (sondas) pegados,
cubriendo la mayor parte del genoma.
o Diferentes diseños: distinta cantidad de sondas (60.000, 180.000,
400.000, 1.000.000) y por ende, distinta resolución.
o Nuestro diseño: 8 pacientes por vidrio, 60.000 sondas por paciente.
• Principio: Es una técnica de competencia entre la muestra y una referencia
(a diferencia de MLPA, que es comparativa). La referencia compite con la
muestra por las sondas del vidrio.
Tipos de array:
• Array CGH (aCGH): Sondas de 60-80 nucleótidos. Evalúa solo dosis.
• Array de SNPs: Además de dosis, permite inferir pérdida de
heterocigosidad (LOH) y disomías uniparentales (UPD) (análogo a MLPA de
metilación, pero para todo el genoma).
• Array EPIC: Evalúa metilación en islas CpG en todo el genoma (mucho en
cáncer).
[Página 13 - Limitaciones y Requerimientos del Array
CGH]
Limitaciones comunes con MLPA (y del array CGH):
• No detectan rearreglos balanceados (ej. traslocaciones balanceadas).
• No detectan mosaicos bajos: El fabricante dice que no es bueno para
mosaicos <20-25%. Se ha detectado hasta un 13% en el mejor de los casos.
• El aCGH no detecta poliploidías (el software normaliza y no lo ve). El array
de SNPs sí puede detectarlas.
Requerimientos del array CGH (más exigente que MLPA):
• Cantidad de ADN: 500 ng (5 veces más que MLPA).
• Calidad del ADN:
o No debe estar fragmentado (chequeo en gel de agarosa).
o Pureza: relaciones 260/280 y 260/230 alrededor de 2 (medición en
Nanodrop).
• Método de extracción: Debe ser salting out o set out (manual, dos días,
pero preserva la integridad). No usar columnitas (fragmentan).
• Costo: Mucho más caro que MLPA (~400-500 USD solo en insumos).
[Página 14 - Procedimiento de Array CGH: Marcación]
Procedimiento del array CGH (protocolo de Agilent, que es el que usamos):
1. PCR de marcación (marcación fluorescente de todo el genoma):
o Es una PCR con random primers (mezcla de cebadores que hibridan
al azar en todo el genoma).
o Los dNTPs incluyen dTTP (timidina) marcado con un fluoróforo.
o Resultado: Se marca todo el genoma.
o Dos mixes: Muestras se marcan con un fluoróforo (ej. Cy3 = verde).
Referencias se marcan con otro (ej. Cy5 = rojo).
2. Purificación: Se purifica el ADN marcado usando columnas
invertidas (para que el ADN no atraviese la resina y no se fragmente). Se
elimina la polimerasa, primers no incorporados, etc.
3. Secado y resuspensión: Se seca el ADN al vacío y se resuspende.
4. Emparejamiento (pairing): Se mide la eficiencia de marcación. Se empareja
cada muestra con una referencia de eficiencia de marcación similar y del
mismo sexo. Se mezclan.
[Página 15 - Hibridación, Lavado y Escaneo]
Procedimiento (continuación):
5. Siembra en el vidrio (assembly):
o Se usa un vidrio con gomitas que crean 8 compartimentos (uno por
cada par muestra/referencia).
o Se carga la mezcla muestra+referencia en cada compartimento.
o Se hace un sandwich con el vidrio que contiene las sondas (60.000
por paciente).
6. Hibridación: Se incuba en un horno especial a 67°C durante 24 horas.
Todas las sondas están diseñadas para hibridar a 67°C.
7. Lavado: Se separa el sandwich y se lava el vidrio con las sondas para
eliminar lo que no hibridó.
8. Escaneo: Se carga el vidrio en un escáner de alta sensibilidad que detecta
cada punto fluorescente. Obtiene una imagen (archivo TIFF).
Software de análisis: Cytogenomics
• Convierte la imagen en datos.
• Parámetro de calidad más importante: DLRSD (debe ser <0.3). Si es >0.3,
hay mucha dispersión y no se puede analizar.
• Genera una tabla con las CNVs detectadas (cromosoma, coordenadas,
bandas, genes, tamaño, ganancia/pérdida, número de sondas, log ratio,
nomenclatura).
[Página 16 - Interpretación de Resultados en aCGH]
Interpretación de los datos (escala logarítmica):
• Log2(2/2) = 0: Dosis normal. Puntos amarillos (mitad rojo, mitad verde).
• Log2(3/2) = 0.58: Duplicación en heterocigosis. Puntos verdes (más
muestra).
• Log2(1/2) = -1: Deleción en heterocigosis. Puntos rojos (menos muestra).
• Umbrales (por defecto para diseño 8x60k): >0.35 o <-0.35 para
considerar ganancia/pérdida.
• Criterio para reportar una CNV: Se requieren al menos 3 sondas
consecutivas por encima o por debajo del umbral.
Análisis visual:
• El programa muestra una línea azul (log ratio) y roja (inverso). Los puntos
por encima de 0 son azules, por debajo rojos.
• Una caída sostenida de puntos rojos indica una deleción.
[Página 17 - Artefactos y Falsos Positivos]
Artefactos y falsos positivos:
• CNVs de la referencia: La referencia comercial tiene sus propias CNVs
benignas. Si la referencia tiene una deleción, la muestra parecerá tener una
duplicación (y viceversa). El programa puede marcar en gris las CNVs que
coinciden con las de la referencia.
• Regiones problemáticas: Regiones muy polimórficas (ej. HLA en
cromosoma 6, región pericentromérica del 9) dan mucha dispersión y no
son informativas.
• Burbujas en el sandwich: Si queda una burbuja de aire durante la
hibridación, puede impedir la correcta circulación del líquido. Como las
sondas están distribuidas al azar (no por cromosoma), el impacto es menor
que si estuvieran concentradas.
[Página 18 - Herramientas para Clasificar CNVs]
Estrategia para clasificar una CNV candidata:
1. Descartar CNVs de la referencia y artefactos.
2. Consultar bases de datos:
o Bases de datos de pacientes (patogénicas): ClinVar,
DECIPHER, ClinGen (curada, más confiable).
▪ Se buscan CNVs iguales o más pequeñas que la nuestra,
clasificadas como patogénicas.
o Bases de datos poblacionales (benignas): gnomAD, DGV (Database
of Genomic Variants).
▪ Se buscan CNVs iguales o más grandes que la nuestra en
población general. Si existen, es benigna.
o OMIM: Genes dentro de la CNV asociados a enfermedades.
o UCSC Genome Browser: Integra muchas bases de datos. Permite
seleccionar tracks (ClinGen, ClinVar, DECIPHER, OMIM, etc.) y
sombrear la región de la CNV. Es poco amigable pero muy completo.
o ClinGen Dosage Sensitivity Map: Indica si una región o gen
es haploinsuficiente (la pérdida de una copia causa enfermedad)
o triplosensible (la ganancia de una copia causa enfermedad). Esto
da mucho peso.
3. Uso de predictores: Franklin, VarSome. Dan una clasificación guía, pero
siempre debe ser revisada por el operador.
[Página 19 - Clasificación de CNVs según ACMG]
Clasificación final de CNVs (según ACMG, 2020):
• 5 categorías: Benigno, Probablemente benigno, Incierto (VUS),
Probablemente patogénico, Patogénico.
• Criterios principales (para patogenicidad):
o La CNV contiene genes codificantes (más peso en deleciones que en
duplicaciones).
o La CNV contiene regiones/genes haploinsuficientes o triplosensibles.
o Evidencia familiar (segregación).
o Publicaciones previas.
Herramienta adicional: ClinGen Calculator
• Calculadora para pérdidas o para ganancias. Se van tildando las evidencias
encontradas y la calculadora propone una clasificación.
[Página 20 - Array de SNPs (SNP Array)]
Array de SNPs:
• Fundamento: Se interrogan miles de SNPs (polimorfismos de un solo
nucleótido) bialélicos (solo dos opciones, ej. A/G).
• Tecnología (Illumina): El vidrio tiene perlas (beads). Cada perla tiene un
oligo que termina justo antes del SNP a interrogar.
• Marcación: La opción A se marca en verde, la opción B en rojo.
• Resultado para cada SNP:
o Homocigota para opción A → solo verde.
o Homocigota para opción B → solo rojo.
o Heterocigota (A/B) → amarillo (mitad verde, mitad rojo).
• Gráfico: Se grafica la frecuencia del alelo B.
o Tres nubes de puntos: frecuencia 0 (A/A), 0.5 (A/B), 1 (B/B).
[Página 21 - Pérdida de Heterocigosidad (LOH)]
Pérdida de heterocigosidad (LOH):
• Visualmente, se pierde la nube del medio (frecuencia 0.5). Solo quedan las
nubes de frecuencia 0 y 1.
• Causas de LOH:
1. Deleción (pierde un alelo).
2. Disomía uniparental (UPD) (tiene dos alelos, pero son iguales,
ambos de un solo progenitor).
• Cómo diferenciar: Hay que mirar el panel de dosis (del aCGH).
o Si la dosis está afectada (deleción o duplicación): la LOH se debe a
la deleción/duplicación.
o Si la dosis es normal: la LOH se debe a una UPD.
Ejemplo de la figura:
• En una región sombreada en salmón, se pierde la nube del medio (LOH),
pero el panel de dosis está normal (todo en cero). Por lo tanto, se infiere
una disomía uniparental.
[Página 22 - Poliploidías y Array de SNPs]
Detección de poliploidías (solo con SNP array):
• En una triploidía (tres copias), hay cuatro frecuencias posibles del alelo B:
0%, 25%, 33%, 50%, 66%, 75%, 100% (dependiendo de la combinación de
alelos). Aparecerían cuatro nubes de puntos.
• El aCGH normaliza la señal total y no detecta poliploidías.
Ejemplo en la figura:
• Duplicación de una región: en el panel de dosis se ve elevado, y en el panel
de SNPs se ven cuatro nubes de puntos.
• Deleción de una región: en el panel de dosis se ve bajo, y en el panel de
SNPs se ven dos nubes (se perdió la del medio).
[Página 23 - Array EPIC (Metilación)]
Array EPIC (metilación en todo el genoma):
• Similar al array de SNPs, pero previo tratamiento con bisulfito.
o Bisulfito: Convierte citosinas no metiladas en uracilos. Las citosinas
metiladas están protegidas y siguen siendo citosinas.
• La sonda termina justo antes de la C (citosina) o U (uracilo).
• Hibridación diferencial:
o Si es C (metilada) → hibrida con G (marcada en rojo).
o Si es U (no metilada) → hibrida con A (marcada en verde).
• Resultado: verde (no metilada), rojo (metilada), amarillo (50% metilada).
[Página 24 - Caso Clínico Integrador]
Caso clínico (sospecha de Prader-Willi):
• Paciente: Características clínicas de piso y ponderar, retraso general del
desarrollo, hipotonía, anomalías estructurales.
• Paso 1 (MLPA TGR): No se tenía el MLPA específico de Prader-Willi (estaba
sin reactivos). Se usó un kit de MLPA para trastornos genómicos
recurrentes (TGR) que tiene 3-4 sondas para varios síndromes (incluyendo
Prader-Willi).
o Resultado: No se detectó deleción en Prader-Willi, pero se
detectó duplicación en las 3 sondas del gen MECP2 (cromosoma
X).
o El síndrome de duplicación de MECP2 explicaba la clínica.
o Limitación: Con el MLPA TGR no se podía determinar la extensión de
la duplicación (si solo involucraba MECP2 o más genes).
• Paso 2 (Array lavado): Para caracterizar la extensión de la duplicación, se
hizo un array CGH dirigido ("lavado", usando un vidrio ya usado para ahorrar
costos).
o Resultado:
▪ Duplicación terminal de 2 Mb en Xq28 que involucraba 93
genes (incluyendo MECP2).
▪ Además, una pequeña deleción en la región
pseudoautosómica PAR1 (Xp22.33/Yp11.32).
▪ El programa no puede distinguir si la deleción es en X o
en Y, por lo que la marca en ambos cromosomas (X e Y).
▪ En la nomenclatura, se escribe tanto el X como el Y con
sus coordenadas.
• Paso 3 (FISH): Para confirmar el rearreglo, se hizo FISH con una sonda
para PAR2 (otra región pseudoautosómica).
o Resultado: El cromosoma X tenía su PAR2 normal. El cromosoma Y
tenía PAR2 tanto en Q como en P, indicando que la duplicación de
Xq se había translocado al cromosoma Y (cromosoma derivado Y).
Conclusión: Integración exitosa de MLPA, array CGH y FISH para el diagnóstico.