LABORATORIO Nº.

ESTERILIZACION Y DESINFECCION
EFECTO DE AGENTES FISICOS Y QUIMICOS SOBRE LAS BACTERIAS

OBJETIVOS

1) Probar la efectividad de los diferentes agentes físicos y químicos de tipo comercial

para uso doméstico y de laboratorio para inactivar la reproducción bacteriana.
2) Demostrar las propiedades desinfectantes de varios agentes físicos y químicos y sus
limitaciones, tanto de uso de laboratorio como doméstico.
3) Comparar la efectividad entre varios desinfectantes, tomando en cuenta la naturaleza
de los microorganismos.

INTRODUCCIÓN

La inhibición o la destrucción de los microorganismos se puede conseguir mediante el

empleo de agentes físicos y químicos que les son nocivos, algunos se limitan a inhibir el
crecimiento y la actividad metabólica mientras que otros destruyen efectivamente las
células llamándose microbiostáticos y microbicidas respectivamente.

En odontología con frecuencia se desea un químico

para una rápida desinfección a temperatura ambiente
sobre todo para diferentes objetos que pueden
dañarse al aplicarles calor, como por Ej. Piezas de
mano, condensador de amalgama, jeringa de
aire/agua, entre otros. Para esto existe varios
compuestos químicos, halógenos y detergentes,
compuestos de amonio cuaternario, calor y
compuestos clorados, etc.

Algunos de los caracteres que deben considerarse para

evaluar a los desinfectantes utilizando en la práctica
son: toxicidad para los microorganismos en baja
concentraciones y a temperatura ambiente, solubilidad
en agua o líquidos tisulares, estabilidad, inocuidad
para el hombre y animales, homogeneidad, capacidad
de penetración, no ser corrosivos, etc.

Naturalmente es difícil que reunan todas las condiciones, y así algunos son muy eficaces
en algunos casos, pero tienen poco o ningún valor en otros. Para exponer un ejemplo, un
agente químico adecuado para desinfectar utensilios contaminados, puede ser totalmente
impropio para aplicarlo sobre la piel, porque puede ocasionar gran perjuicio a las células
de los tejidos.
Métodos de esterilización y desinfección:

Seco Flameado
Horno
1- Calor
Autoclave
Húmedo Agua hervida
Método físico
Pasteurización
2- Filtración
3- Radiación
4- Gas (oxido de etileno)

Alcoholes 70 %
oxidantes (H2O2)
Yodóforos (Yodo 2%)
Halógeno (Cloro 5%)
Métodos Químicos Fenoles 1 a 2%
Formaldehidos
Glutaraldehido
Metales pesados = Nitrato de plata 1%
Sulfato de cobre 1/1000
Mercuriocrómo 0.1 (Mertiolate)

Materiales:
- Cultivo de caldo nutritivo de 24 - 3 tubos con 5 ml, de desinfectante
horas de Escherichia. coli. (por duplicado) para cada grupo.
- Cultivo en caldo nutritivo de 72 - Tubos de caldo estéril
horas de Bacillus subtilis. - Gradillas
- Cultivo en caldo nutritivo de 24 - Pipetas estériles de 2 ml
horas de Klebsiella spp. - Asas bacteriológicas
- Platos petri MacConkey y agar - Mechero
nutritivo. - Incubadora
- 6 tubos de caldo nutritivo para cada - Autoclave
grupo de trabajo. - Horno
- Pinza metálica
DESARROLLO
ACTIVIDAD Nº 1:
Efecto de los agentes físicos sobre las bacterias
Incineración (Flameado).

Se emplea para esterilizar asas microbiológicas de metal, consiste en

someter directamente a la llama de un mechero el material, a esterilizar
hasta que adquiere un color rojo. Actúa provocando una
desnaturalización masiva de proteínas celulares.
Procedimiento:
1- Flamee la punta del asa.
2- Enfriar el asa en la periferia del medio de cultivo.
3- Tome una asada del medio de cultivo, flamee de nuevo el asa conteniendo el
inóculo, seguidamente introducir el asa en el medio de cultivo (agar nutritivo)
4- Incube por 24 horas 37ºC
5- Compare con el control inoculado.

ACTIVIDAD Nº 2:
Calor Seco: Horno

Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto

grado, a la acción del calor. El calor provoca
desnaturalización de proteínas, fusión y desorganización de
las membranas y/o procesos oxidativos irreversibles en los
microorganismos. Se requiere de un período de tiempo más
largo y temperaturas más elevadas 160-180ºC, por 1 – 2
horas.

La efectividad del calor como método de esterilización

depende de:
1. Temperatura
2. Tiempo de exposición

Procedimiento:
1- En una tira de papel filtro, distribuye una asada de microorganismos del medio de
cultivo (E. coli, B. subtilis)
2- Coloque la tira el papel filtro en un plato de petri y déjalo secar al medio ambiente.
3- Introdúzcalo al horno por 1 hora
4- Haciendo uso de la pinza previamente esterilizada retire el papel filtro del plato.
5- Coloque la tira de papel dentro de un tubo de ensayo conteniendo caldo nutritivo e
incube por 24 horas a 37ºC.

ACTIVIDAD Nº3:
Calor húmedo

El calor húmedo produce desnaturalización y

coagulación de proteínas.

Actúa en la desnaturalización y coagulación de las

proteínas de los microorganismos, la humedad
favorece la distribución del calor. Se aplica
temperatura de 100°C por 30 minutos.

Ojo: No elimina esporas

 Procedimiento:
1- Con una asa redonda inocule en condiciones asépticas 2 tubos de caldo nutritivo :
a) E. coli
b) B. subtilis
2- Sométalo a agua hirviendo a 100ºC durante 30 minutos.
3- Déjelo enfriar, incube a 37ºC por 24 horas
4- Compare con control positivo.

ACTIVIDAD Nº4:
Autoclave

El vapor de agua saturado se difunde por ósmosis através de la

membrana celular y las esporas coagulando su protoplasma, fenómeno
que se acentúa cuando el vapor está saturado y a presión en un medio al
vacío. Se necesita 121ºC o 15 libras de presión durante 15 – 20 minutos.
Este es el método ideal para destruir microorganismos formadores de
esporas.

Procedimiento:
1- Inoculen en condiciones asépticas un medio de caldo nutritivo con el
microorganismo:
a) B. subtilis,
b) E. coli
c) Klebsiella spp.
2- Sométalo a esterilización por autoclave.
3- Déjelo enfriar e incúbelo durante 24 horas a 37ºC.
4- Compare los resultados con el control inoculado.

NOTA: La presencia de turbidez en el caldo nutritivo denota crecimiento bacteriano

SECCION DE RESULTADOS Y OBSERVACIONES

MICROORGANISMOS
METODO E. coli Klebsiella spp B. subtilis
Tubo 1 Incineración
Tubo 2 Horno
Tubo 3 Baño maría
Tubo 4 Autoclave
Tubo 5 Control inoculado

Actividad Nº 5:
Efectos de los aspectos químicos sobre las bacterias

Este ejercicio tiene por objeto demostrar que el término “Desinfectante”, puede tener
sólo un significado limitado. La desinfectación inadecuada de una pieza de mano, puede
hacer que se aislen agentes de enfermedades, por lo que siempre se sea posible se debe
recurrir al uso de autoclave o de la esterilización por calor seco.
Procedimiento:
Cada grupo de estudiantes recibirá una serie de tubos y por duplicado con desinfectante
o antiséptico (3) y una bacteria. La bacteria se alternará en la mesa y unos tendrán E.
coli y otros B. subtilis.

1- Use el cultivo de E. coli (o de B. subtilis), para probar la eficiencia de los

desinfectantes seleccionados. A cada tubo conteniendo un desinfectante agreque con
pipeta estéril 0.5ml del cultivo bacteriano. No deje que el caldo corra por las paredes
del tubo, sino que caiga directamente sobre el desinfectante.
2- Mezcle dando golpes suaves en el fondo del tubo y déjelo en reposo a temperatura
ambiente.
3- Transfiera una asada de cada una de las mezclas desinfectante-bactericida aun tubo
con caldo nutritivo estéril a los 10’ y a los 20’. En los duplicados hará lo mismo con
la otra bacteria.

NOTA: Marque cuidadosamente cada tubo, de manera que pueda identificar luego, la
especie de bacteria, el desinfectante y el tiempo de permanencia en éste
.
4- Incube los caldos a 37ºC por 48 horas.
5- Examine los resultados y anote la presencia (+) o ausencia (-) del crecimiento
bacteriano en el cuadro siguiente. Compare con los resultados de los compañeros
que hayan usado otros desinfectantes y otra bacteria.

Desinfectante Klebsiella f Escherichia coli f Bacilus subtilisf

10’20’ 10’20’ 10’20’
Alcohol etílico 70%
Fenol 5%
Penisol
Tintura de iodo 1%
Mertiolate

Investigue:
1- ¿Cómo se define un desinfectante?
Es una sustancia química que se aplica sobre superficies u objetos inanimados con el fin
de destruir o inactivar la mayoría de los microorganismos patógenos, como bacterias,
virus y hongos, aunque generalmente no elimina todas las esporas bacterianas.

Según la definición microbiológica, la desinfección es el proceso mediante el cual se

reduce o elimina la carga microbiana de objetos y superficies hasta niveles que no
representen un riesgo para la salud.

Ejemplo de desinfectante: Antiséptico: se utiliza sobre

Hipoclorito de sodio (cloro) tejidos vivos (piel y mucosas).
Alcohol etílico o isopropílico al 70 %
Peróxido de hidrógeno (agua oxigenada) Desinfectante: se utiliza sobre
Amonios cuaternarios objetos y superficies
inanimadas.
Glutaraldehído

2- ¿Cómo se define un antiséptico?

Es una sustancia química que se aplica sobre tejidos vivos, como la piel y las mucosas,
para destruir o inhibir el crecimiento de microorganismos y prevenir infecciones.

La antisepsia consiste en la utilización de agentes químicos sobre tejidos vivos con el

objetivo de reducir la carga microbiana y evitar la proliferación de microorganismos
patógenos.
Resp 3. Los resultados varían según el
Ejemplos de antisépticos: microorganismo porque cada uno posee
 Alcohol etílico al 70 % diferentes características estructurales y
 Clorhexidina mecanismos de resistencia que determinan
 Povidona yodada (yodo povidona) su susceptibilidad a los agentes
 Peróxido de hidrógeno (agua oxigenada) antimicrobianos.
 Cloruro de benzalconio

3- ¿Por qué pueden variar los resultados en dependencia de cada

microorganismo?

Los resultados pueden variar dependiendo de cada microorganismo porque no todos

tienen la misma estructura, resistencia y capacidad de adaptación a los agentes
químicos o físicos utilizados para su control. Algunos microorganismos poseen
características que los hacen más resistentes, como paredes celulares más gruesas,
formación de esporas, cápsulas protectoras o mecanismos de resistencia específicos.

Además, factores como la concentración del agente antimicrobiano, el tiempo de

exposición, la temperatura y la cantidad inicial de microorganismos también pueden
influir en la efectividad del tratamiento.

4- ¿Qué es un microorganismo esporulado?

Un microorganismo esporulado es aquel que tiene la capacidad de formar esporas,

estructuras de resistencia que le permiten sobrevivir en condiciones ambientales
desfavorables, como altas temperaturas, desecación, radiación o la acción de algunos
desinfectantes.
Las esporas contienen el material genético del microorganismo rodeado por capas
protectoras muy resistentes. Cuando las condiciones vuelven a ser favorables, la espora
germina y da origen nuevamente al microorganismo activo.

Características de las esporas:

 Son altamente resistentes al calor, la sequedad y los agentes químicos.
 Pueden permanecer viables durante largos períodos.
 Constituyen un mecanismo de supervivencia, no de reproducción.

Ejemplos de bacterias esporuladas:

 Bacillus anthracis
 Clostridium tetani
 Clostridium botulinum
5- Mencione al menos 2 bacterias esporuladas de importancia médica y explique su
importancia clínica.

1. Clostridium tetani
Importancia clínica:
 Es el agente causante del tétanos.
 Sus esporas se encuentran en el suelo, polvo y heces de animales.
 Puede ingresar al organismo a través de heridas contaminadas.
 Produce una neurotoxina (tetanospasmina) que provoca rigidez muscular y
espasmos generalizados, pudiendo causar insuficiencia respiratoria y muerte si
no se trata adecuadamente.
2. Clostridium botulinum
Importancia clínica:
 Es responsable del botulismo.
 Sus esporas pueden encontrarse en alimentos mal conservados o en el suelo.
 Produce la toxina botulínica, una de las sustancias más potentes conocidas.
 Esta toxina provoca parálisis muscular flácida progresiva, que puede
comprometer los músculos respiratorios y poner en riesgo la vida del paciente.
3. Clostridium perfringens
Importancia clínica en la boca:
 Puede encontrarse en infecciones odontogénicas profundas y abscesos cuando
existen condiciones anaerobias.
 Produce enzimas y toxinas que favorecen la destrucción tisular y la propagación
de la infección.