Pontificia Universidad Católica Madre y Maestra

Nombre:

Analía Severino De León

ID:

10160900

Asignatura:

Laboratorio de Microbiología

Profesora:

Sandra G. Lagunes

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 Practica No. 2

Manejo del área de trabajo en Laboratorio de Microbiología y

Prueba de esterilidad de materiales

(Resultados, observaciones y conclusiones en las páginas 8, 9, 10)

Organización del puesto de trabajo

Medidas: 60 cm de ancho por 1.50m de largo

Debe ser de una superficie clara de preferencia, lisa, no combustible, resistente a ácidos,
antisépticos o bases y a los colorantes

Dos puestos de trabajo pueden ser dispuestos: uno, en donde tendremos la tina de
coloración, que contendrá un portalaminas, una piseta de agua destilada y una reserva de
portaobjetos y cubreobjetos. El segundo puesto destinado a la manipulación de muestras
estériles, que debe contener un mechero Bunsen mínimo, que asegurará las condiciones de
esterilidad del puesto, colocándolo a unos 25cm del borde de la meseta; El material a
trabajar deberá ser colocado a la izquierda del mechero (productos a estudiar, cultivos y
líquidos de dilución). Los materiales e instrumentos necesarios para trabajar deberán estar
situados a la derecha del mechero Bunsen (pipetas, asas para siembra, pinzas, utilizando
para sostenerlos recipientes de vidrio con boca ancha para mejor manejo y disponer
también de un recipiente conteniendo solución antiséptica para colocar las pipetas usadas
o los portaobjetos usados.

En la parte posterior de la meseta, deberá colocarse, en caso necesario, otro mechero

Bunsen con un tripeé, que servirá para poder calentar baño María, para colocar los medios
de cultivo que necesitasen mantenerse calientes.

Todo el material debe estar accesible para que no haya necesidad de alejarse del puesto.
Debe estar dispuesto sin que nada se interponga entre el usuario y la flama.

Características principales de la práctica microbiológica

Para lograr los fines de trabajo del usuario, es necesario que las muestras y las siembras
realizadas se realicen en las mejores condiciones de asepsia.

Todos los instrumentos que se utilicen deben estar estériles. Generalmente se puede lograr
esta esterilidad pasando el material por la flama del mechero Bunsen inmediatamente
antes de su utilización y manteniéndolo siempre dentro del área estéril. El área estéril se
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considera el espacio de 15 cm alrededor de la flama de un mechero Bunsen colocado en
intensidad media.

Los tubos o matraces abiertos no serán colocados verticalmente, sino de forma oblicua, con
la abertura dirigida hacia la flama. Las pipetas deberán también estar colocadas con la punta
hacia el área estéril del mechero.

Generalmente, la mano derecha, que mantendrá el asa de siembra o la pipeta (estéril o con
material a sembrar) en la zona estéril, no deberá desplazarse. Todo el material necesario
como tubos con medio de cultivo, líquidos de dilución, tubos estériles o eventualmente
portaobjetos deben ir de la mano izquierda a la derecha.

Para evitar quema de material al aire se debe restringir el desplazamiento durante el

trabajo, y los movimientos bruscos que generen corrientes de aire.

Para disminuir el riesgo de contaminación y por medida de seguridad personal, el usuario

deberá evitar hablar, comer y fumar durante los trabajos. Deberá utilizar una bata cerrada
al frente, suficientemente larga para cubrir las vestimentas y el largo del brazo.

Ciertas manipulaciones particularmente peligrosas deberán realizarse bajo estrictas

condiciones de esterilidad, en las cuales deberán usarse guantes, mascarilla, doble bata,
cofia. Las manos y uñas cortas deben mantenerse siempre limpias y los cabellos en caso de
ser largos, correctamente recogidos.

Organización del trabajo

A) Antes de la manipulación

1.- Escoger el material de trabajo.

Deberán considerarse no solamente los líquidos de dilución y medios de cultivo sólidos o

líquidos, también los reactivos bioquímicos o serológicos y los colorantes necesarios, así
como los ingredientes en caso de requerirse para preparar algunos medios de cultivo al
momento.

Se seleccionarán todos los objetos e instrumentos con los que debemos trabajar como:
material de cristal, cajas Petri, pipetas, asas de siembra, pinzas, portaobjetos y
cubreobjetos, gradillas, limas corta-ampolletas, etiquetas y marcador de tinta para vidrio

2.-Preparación

Una parte del material podrá necesitar una preparación o una verificación particular

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 a) Preparación de medios de cultivo

Ciertos medios deben deberán colocarse en baño María para llevarse a ebullición.

Medios sólidos o líquidos destinados a cultivos en anaerobiosis, deberán ser preparados

y eliminarse todo el oxígeno presente mediante ebullición prolongada (30 a 45 minutos).

Los medios sólidos en frascos o tubos pueden ser utilizados en posición inclinada,
puestos en caja Petri, pueden adicionárseles al momento de servirse reactivos que no
soportan la autoclave (azucares, sangre, suero, alcohol, etc).

b) Preparación de instrumentos para siembra

Las pipetas Pasteur, pipetas serológicas o rotores deberán estar previstas y preparadas,
estériles

Las asas de siembra deben ser verificadas, eliminar toda presencia de oxido o restos de
material y ser esterilizada llevándola a calentamiento hasta rojo incandescente.

Las pinzas deberán ser limpiadas con alcohol y no deberán estar presentes fibras de
algodón en las puntas o ranuras presentes

Una vez las preparaciones listas, el material debe ser retirado de la meseta de trabajo y esta
deberá ser limpiada antes de comenzar las manipulaciones propiamente dichas.

B) Durante la manipulación

La organización del trabajo variará evidentemente de una práctica a otra, pero debe
considerarse de forma general:

1.- Permitir la utilización de inevitables tiempos muertos: secado de portaobjetos,

tiempo de contacto de los colorantes, enfriamiento de medios de cultivo listos para
servirse.

2.- No comprometer la supervivencia de las bacterias por un mantenimiento dentro de

medio de cultivo en condiciones desfavorables

3.- Evitar todo riesgo de confusión: etiquetar todos los tubos y matraces, cajas Petri;
trabajar en un orden determinado, en general de la izquierda hacia la derecha, dejando
siempre espacio libre entre tubos sin sembrar y tubos limpios

4.- Evitar riesgos de contaminación

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A todas estas precauciones se añadirá una limitación de movimientos a realizar: la toma de
una sola muestra para sembrar muchas cajas, así como jalar tapones de algodón desde la
punta para tener mayor comodidad al trabajar, el tapar los tubos correctamente después
de la toma de muestras, etc.

Todo lo que se realice en una sesión de laboratorio deberá reportarse en una bitácora o
cuaderno de laboratorio, que podrá ser en todo momento revisado por su jefe de
laboratorio o autoridades que lo requieran.

La redacción de la bitácora de laboratorio debe:

- Ser suficientemente precisa para retomar o reproducir el trabajo en curso por otra
persona sin el riesgo de confusión
- No debe jamás hacer uso solo de la memoria, porque los olvidos pueden tener
graves consecuencias. Los resúmenes o comentarios deben estar redactados desde
el momento mismo de finalizar la manipulación o las observaciones

C) Después de la manipulación

El material de trabajo usado será dirigido a destinaciones diferentes

1.- Los medios de cultivo sembrados se deben llevar a la estufa de cultivo o incubadora a la
temperatura optima de crecimiento del microorganismo en cuestión. En ocasiones
deberemos colocar diferentes series en condiciones de cultivo específicas para cada una de
ellas. Dependiendo de la importancia del trabajo realizado y de las dimensiones de la
incubadora, se podrá colocar los medios de cultivo sembrados en gradillas o en tambores.
Algunos medios pueden colocarse todos juntos dentro del mismo tambor, cumpliendo la
condición de estar todos bien sellados al momento de ser colocados, para evitar
contaminaciones posteriores.

2.- Los frotis coloreados pueden ser conservados después de etiquetarse en cajas para
preparaciones microscópicas. Si se dispone una conservación a largo plazo, el montaje
correcto del portaobjeto debe considerarse.

3.- Los productos a estudiar de cualquier tipo (muestras de cultivos, productos naturales,
cultivos puros) deberán ser conservados hasta el final de su estudio.

4.- Todo el material de estudio contaminado que no será utilizado posteriormente deberá
ser esterilizado

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 a) Los tubos de siembra y cajas Petri, las suspensiones y diluciones bacterianas, los
productos estudiados después de la verificación o colecta de resultados deben ser
esterilizados en autoclave

b) Las preparaciones microscópicas para examen al estado fresco, deberán ser

autoclaveadas si se considera necesario, o colocadas dentro de una solución de cloro

c) Las pipetas Pasteur o serológicas serán sumergidas en solución de cloro durante un

tiempo suficiente

d) Las asas de siembra son esterilizadas por calentamiento durante la manipulación, al

finalizar la siembra

e) Los animales sacrificados deben ser incinerados, los instrumentos de autopsia

esterilizados en estufa

f) Los materiales una vez recogidos, la meseta deberá ser limpiada con agua y jabón y
posteriormente con agua con cloro y paño limpio

Prueba de esterilidad de materiales

I. Objetivo:
Que el alumno conozca los principios generales de las técnicas de esterilización de
materiales de vidrio y medios de cultivo de uso común en el laboratorio. Observará el
efecto de las condiciones de asepsia en el control de la contaminación microbiana en el
laboratorio.

II. Introducción:
Los microorganismos como otros seres vivos, son susceptibles a los cambios de las
condiciones ambientales y en la medida que se han podido adaptar a estos cambios, se
han distribuido en una gran diversidad de hábitats, incluyendo los de condiciones
extremas, sobre todo de tipo físico y químico.

Se han desarrollado y aplicado procesos de desinfección y esterilización para limitar su

presencia o eliminarlos. La esterilización elimina totalmente todo tipo de microorganismo
mientras que la desinfección solamente elimina las formas vegetativas de estos.

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La esterilización con calor seco y húmedo son los procedimientos de mayor utilización en
microbiología. El calor seco desnaturaliza las enzimas y destruye a los microorganismos por
oxidación. Estos métodos se aplican principalmente en la esterilización de las asas de
inoculación y todo tipo de material de vidrio y quirúrgico.

Los procesos de calor húmedo se aplican para esterilizar medios de cultivo, soluciones y
cultivos bacterianos que se desechan, el más recomendable es la autoclave en el que se utiliza
vapor de agua a presión para alcanzar temperaturas de 121°C. El material se deja a esta
temperatura durante 15 minutos para asegurarse la destrucción de todos los microorganismos
presentes.

Cuando se requieren esterilizar soluciones o materiales sensibles al calor, como las vitaminas,
aminoácidos u otros, se ejecuta filtración en membranas estériles de 0.2 micras de diámetro y
para el caso de materiales plásticos es recomendable el uso de gases como el óxido de etileno
o con radiaciones gama. Las superficies generalmente se desinfectan con radiaciones U.V. o
compuestos químicos en forma líquida como los fenoles, compuestos de amonio cuaternario,
formaldehido, alcoholes, halógenos y detergentes.

Cada uno de estos métodos tienen ventajas y desventajas de uso, los sistemas de filtración
son muy eficientes y fáciles, pero solo pueden aplicarse a pequeños volúmenes.

Los fenoles y compuestos cuaternarios de amonio son efectivos para desinfección de

superficies, pero son muy corrosivos. Los detergentes y alcoholes tienen actividad limitada
contra esporas bacterianas y algunos virus por lo que solo son desinfectantes.

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 III. Materiales y Reactivos:
5 cajas Petri vacías

Agar para recuento de Mesófilas

Agua destilada

Autoclave

Mechero

Etanol

Detergente (Solución)

IV. Técnica
1.- Preparar y esterilizar el Agar para recuento de Mesófilos

2.- Colocar el agar en las cajas Petri, previamente esterilizadas, dejar enfriar y solidificar

3.- Colocar las cajas Petri con Agar sólido, en forma invertida, en una estufa de incubación
ajustada a 30 °C durante 24 a 48 horas

4.- Revisar las cajas Petri para detectar la presencia de contaminantes por la formación de
colonias microbianas en la superficie de los medios solidos

5.- Si no hay contaminación de los medios, se abrirá una de las cajas Petri durante 1
minuto en el laboratorio o zonas accesorias al mismo y se etiquetará como “Al Aire”

6.- Otra caja Petri se inoculará con un hisopo mojado en solución salina, el cual será
pasado por la pantalla de su celular y se etiquetará “Celular”

7.- Otra caja Petri se inoculará con un hisopo mojado en solución salina, el cual será
pasado por alguna de las mesas del laboratorio, equipos o el piso/paredes y
posteriormente frotado por la superficie del medio de cultivo, y se etiquetara “Superficie”.

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8.- Otra caja Petri se inoculará con un hisopo mojado en solución salina, el
cual será pasado por las manos de algún voluntario y posteriormente frotado
por la superficie del medio de cultivo, y se etiquetará “Manos”.

9.- Otra caja Petri se conservará y etiquetará como “Control” (Una caja para
todo su grupo).

V. Resultados
a.- Hacer la descripción morfológica de las colonias obtenidas en las cajas con
medio de cultivo y con los distintos tratamientos con relación a la caja control.

b.- Reportar el crecimiento en forma cualitativa: (-) no hay crecimiento; (+)

poco crecimiento; (++) crecimiento regular; (+++) crecimiento abundante

c.- Discuta los resultados y determine si la esterilización de las distintas zonas

tratadas fue adecuada, así como el manejo de materiales.

Descripción morfológica:

Primera superficie: Manija del baño: (+++)

• En esta muestra se puede notar un crecimiento

masivo y algunas colonias ancladas hacia los bordes.

• Las formas de las colonias se pueden ver circulares

e irregulares, especialmente en las colonias aisladas.

• Además, los bordes se ven ondulados e irregulares

en las masas grandes y enteros en las colonias
pequeños.

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Segunda superficie: Celular (+)

• Su crecimiento es escaso, solo

ocupando uno de cuatro cuadrantes.

• Pero a pesar de ser pocos se puede

ver una forma circular o puntiforme.

• Tiene un color entre gris, blanco y

translucido. Y todos sus bordes están
completos.

Tercera superficie: Aire del área social (piso 1) (+)

• La placa se observa casi limpia. Solo se

aprecia una única colonia aislada en el lado
izquierdo.

• Tiene una forma circular, pequeña, de color

blanquecino, borde entero y elevación plana o
ligeramente convexa.

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Cuarta superficie: Mano (+)

• La forma predominante de las colonias es

predominantemente puntiforme y circulares de
tamaño.

• Se pueden visualizar colonias aisladas y

dispersas por la superficie.

• Los bordes están enteros y definidos y se

puede notar un color blanquecino.

Esterilización de materiales: Con mi grupo hemos llegado a la conclusión de que nuestra

esterilización se llevó a cabo de la matera correcta, siguiendo los pasos indicados tanto
por la maestra como por el instructivo del laboratorio, así que los resultados de nuestras
colonias no se verán afectados por agentes externos.

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