00 Calidad de los ácidos nucleicos purificados

La calidad de los AANN viene determinada por tres parámetros: integridad, pureza y
concentración. Una buena calidad es clave para conseguir una buena funcionalidad de
los AANN en las diferentes técnicas de BM que se apliquen.

00.1 Integridad de los ácidos nucleicos

Una vez finalizado el proceso de purificación hay que determinar su integridad; si el
AANN conserva su tamaño original. La mejor manera de valorar la integridad es realizar
una electroforesis en gel de agarosa al 0,7%-1,2% (P/V). Resultados a esperar:

● ADN genómico
● En las muestras en las que el ADN haya mantenido su integridad, se obtendrá
una banda única de ADN perfectamente definida en la parte superior del gel.
● Si se degrada, aparecerá una estela fluorescente (smear) a lo largo de la calle de
electroforesis.
● Este patrón no es aplicable a las muestras FFPE.
● ADN plasmídico
● Lo ideal es obtener una única banda en la electroforesis, correspondiente al
plásmido. Pueden aparecer dos bandas más: una de una estructura relajada y
una de un dímero.
● ARN
● Aparece un ligero smear, debido al ARNm, con dos bandas nítidas (ARNr), y una
tercera banda más débil (ARNr y ARNt).

00.2 Pureza de los ácidos nucleicos

Para que los AANN mantengan su funcionalidad en las técnicas de biología molecular
se requiere determinado grado de pureza y reducir al mínimo los contaminantes.

La pureza es el parámetro que determina la ausencia de posibles contaminantes.

La medida del grado de pureza se basa en una de las propiedades de los ácidos
nucleicos: su máxima absorbancia a una longitud de onda de 260nm.
Cociente A260/A280

● Las proteínas y derivados fenólicos tienen máxima absorbancia a 280 nm.

● El cociente de ambas absorbancias da una idea del grado de contaminación.
● Para evitar errores, la absorbancia medida debe estar siempre en el rango de
medida lineal del espectrofotómetro; recomendándose entre 0,1 y 1,0. Por ello,
las medidas se realizan con muestras diluidas.

Valores del cociente A260/A280 en el ADN y correcciones

● Grado de pureza adecuado: A260/A280=1,7-2.

● Valores de 1,6 e inferiores indican contaminación excesiva de la muestra. Se
puede solucionar tratando con Proteinasa K.
● Valores superiores a 2 indican una concentración elevada de ARN, ya que la
absorbancia del ARN a 260nm es mayor que la del ADN. Se contrarresta con
ARNasas.

Valores del cociente A260/A280 en el ARN: 1,8-2,1

Cociente A260/A230

● Otro parámetro adicional. A 230 nm se detecta la máxima absorbancia de

contaminantes menores, como carbohidratos y sales.
● Se considera que el AN es puro cuando el cociente está entre 1,5-2,2.
● Un valor inferior a 1,5 puede indicar presencia de contaminantes, por lo que sería
conveniente precipitar y lavar de nuevo el AN con etanol y resuspenderlo.

Absorbancia a 320 nm

La absorbancia a una longitud de onda de 320 nm mide la turbidez de la solución; la

presencia de partículas en suspensión. Este valor se debería restar de las medidas a
260,280 y 230 antes de calcular los cocientes.
00.3 Concentración de ácidos nucleicos
La concentración es la cantidad de AN por unidad de volumen de solución final. Los
métodos más usados son:

Absorbancia a 260nm

Según la ley de Lambert-Beer; la absorbancia de una disolución es directamente

proporcional a la concentración del soluto en la disolución y al paso óptico de la
cubeta.

Aplicando esta ley a los AANN se obtiene las siguientes equivalencias cuando se mide
la absorbancia a 260 nm en cubetas de 10 mm de paso óptico:

● ADNds = Una unidad de absorbancia = 50 ng/μL o 50μg/mL

● ADNss = Una unidad de absorbancia = 33 ng/μL o 33μg/mL
● ARN = Una unidad de absorbancia = 40 ng/μL o 40μg/mL

Consideraciones

● La medida de absorbancia se realiza sobre una dilución de la muestra purificada.

● La medida de absorbancia obtenida debe estar incluida en el intervalo de
medida lineal del espectrofotómetro. Si está por encima hay que realizar
dilución mayor.
● El factor de dilución hay que tenerlo en cuenta.
● Para que sea exacto hay que corregir el valor de absorbancia a 260nm
restándole el valor a 320 nm.

CONCENTRACIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO = (A260 – A320) x factor de dilución x factor

de conversión.

CANTIDAD TOTAL DE ÁCIDO NUCLEICO PURIFICADO concentración de la solución en

ng/μg por el volumen de resuspensión en μL.

Conversión de unidades de picomoles a microgramos o viceversa

● Pm (pb)=660 g/mol ; Pm (nucleótido)=330 g/mol

000 Almacenamiento de los AANN purificados
Se almacenan para garantizar su integridad y asegurar su trazabilidad.

Condiciones para la integridad de las muestras

● Los AANN se almacenan en frío. El ADN en nevera a 4 grados (4-5 días) ó -20
grados o -80 grados. El ARN siempre se congela a -20 grados (tiempos cortos) o
a -80 grados (tiempos largos).

01 Reacción en cadena de la polimerasa

● La PCR es una técnica in vitro de amplificación de ADN que permite obtener
millones de copias iguales de un fragmento concreto de ADN, partiendo de una
cantidad mínima de ADN molde. Permite:
❖ Amplificar varios fragmentos distintos en una única reacción.
❖ Amplificar fragmentos de ARN.
❖ Cuantificar la concentración de una molécula concreta de ácido nucleico
presente en una muestra.
● Ventajas:
❖ Como técnica de amplificación. (Respecto a clonación ADN): ahorro de
tiempo y automatizado
❖ Como técnica de detección. (Respecto a hibridación): tamaño menor de
muestra y cuantificación.
● Aplicaciones:
❖ Diagnóstico de enfermedades
❖ Respuesta a tratamientos
❖ Estudios genéticos
❖ Estudios filogenéticos
❖ Medicina forense
02 Bases teóricas de la PCR
El fundamento de la PCR es un proceso enzimático, catalizado por una ADN polimerasa,
basado en la replicación del ADN. Se repiten secuencialmente ciclos de replicación de
ADN in vitro que termina amplificando la cantidad de ADN. Esto se debe a que las
copias nuevas obtenidas sirven también como molde para sintetizar nuevas copias,
produciéndose un aumento exponencial en el número de copias.

Para conseguirlo hay que solucionar dos problemas: conseguir que se replique
únicamente el fragmento que nos interesa y que no se produzca la inactivación de la
ADNp por la temperatura elevada que es necesaria para desnaturalizar el ADN molde.

02.1 Los cebadores o primers

Los cebadores son oligonucleótidos monocatenarios cuya secuencia es
complementaria a las regiones que flanquean el fragmento a amplificar.

● Se diseñan siempre por parejas y cada uno es complementario a una secuencia

adyacente a la región de interés pero en extremos y cadenas opuestas.
● Permiten definir y delimitar la región diana de una molécula de ADN que se va a
amplificar.
❖ El cebador que se une a la hebra molde que tiene dirección
3’→5’ se denomina cebador Forward.
❖ El cebador que se une a la hebra molde que tiene dirección
5’→3’ se denomina cebador Reverse.
● Los cebadores son el sustrato idóneo para la ADNp, ya que son una molécula
monocatenaria a la que puede unirse y empezar a incorporar nucleótidos
complementarios a la hebra molde; puesto que la ADNp no es capaz de iniciar la
síntesis de una nueva cadena, sino elongar una existente.

DISEÑO DE LOS CEBADORES

Longitud. 18-30 bases. El tamaño mínimo es de 16 bases, ya que la probabilidad de que

una secuencia de menos de 16 bases se encuentre repetida en un genoma es muy alta.
Por tanto, cebadores menores a 15 bases carecen de especificidad y dan lugar a
productos amplificados no deseados. Los mayores a 30 bases dan más especificidad
pero tienden a unirse peor al ADN molde y disminuyen el rendimiento de la reacción.

Composición de bases. Los mejores resultados se obtienen con cebadores con

contenido en G+C del 40%-60%. La distribución de dominios ricos en AT y GC debe ser
equilibrada.

Secuencia. Los cebadores no deben contener secuencias complementarias intra- e

intermoleculares.

Las secuencias complementarias intramoleculares dan lugar a estructuras secundarias

en el cebador (horquillas) o a la autodimerización.

Las secuencias complementarias intermoleculares entre ambos cebadores pueden

ocasionar la dimerización de estos. Es importante garantizar la ausencia de
complementariedad entre los cebadores en el 3’.

Temperatura de fusión. Lo ideal es 52-65 grados Celsius. Hay que evitar que la
diferencia de la Tm entre ambos cebadores supere los 5 grados para una eficacia
similar.

02.2 ADN polimerasas termoestables

Es necesario desnaturalizar por calor el ADN para que la ADNp pueda trabajar sobre el
molde. No obstante, las polimerasas convencionales son termolábiles, lo que
enrevesada el proceso de PCR.

Las ADNp termoestables son enzimas aisladas de arqueobacterias termófilas con

actividad polimerasa a temperaturas elevadas.

Catalizan la incorporación de nucleótidos en sentido 5’→3’ utilizando

como molde ADN monocatenario y en presencia de Mg2 +. Sus dos
características especiales son que realizan su actividad polimerasa a
una T óptima de 70-75 grados (maximizando la especificidad de la
hibridación de primers) y que mantienen su actividad polimerasa tras
 tiempos prolongados de incubación a 95 grados (garantizando que no se
inactivan en las fases de desnaturalización del ADN).

Tipos de ADNp termoestables

✓ Act. exonucleasa 5’→3’ Al carecer act. exonucleasa 3’→5’, es Su tasa de error es de 1/10^5
x Act. exonucleasa 3’→5’ incapaz de corregir errores durante la
incorporación de los nucleótidos

✓ Act. exonucleasa 5’→3’ Tienen actividad correctora; detectan cuando se Su tasa de error es de 1/10^6
✓ Act. exonucleasa 3’→5’ incorpora un nucleótido erróneo y lo sustituyen
por el correcto

Actividad transcriptasa inversa Utilizan ARN como molde en presencia de iones Pueden sintetizar y amplificar ADNc a
de Mn2+ partir de ARN

02.3 El ciclo básico de una PCR

La PCR es una repetición secuencial de ciclos de replicación. Cada ciclo consta de tres
fases y el producto final de cada ciclo es la síntesis de una nueva molécula de ADN que
servirá de molde para el siguiente ciclo.

FASE I. DESNATURALIZACIÓN

El proceso debe ser largo y la temperatura elevada para garantizar la desnaturalización

completa del molde, sin prolongarse demasiado para evitar la inactivación de ADNp.

95 grados durante 15-30s.

FASE II. HIBRIDACIÓN

La hibridación de los cebadores con el ADN molde se realiza entre 50-60 grados
durante 30-60s. El valor concreto depende de la Tm de los cebadores y suele estar
comprendido en el rango Tm ±5 grados.

Si la temperatura supera la Tm de los cebadores, se produce una mayor especificidad

en la hibridación pero acarrea un rendimiento menor.

Si la temperatura es inferior a la Tm de los cebadores, podrá haber mayor rendimiento,

puesto que la hibridación es más eficiente. El inconveniente es la aparición de
productos no deseados por hibridación inespecífica.
FASE III. EXTENSIÓN/ELONGACIÓN

La elongación de los cebadores por la ADNp se realiza a la temperatura óptima de

polimerización en función de la enzima. La de la Taq polimerasa es de 72 grados.

El tiempo de la fase III está condicionado por la velocidad de polimerización de la

enzima y la longitud del fragmento a amplificar. La Taq polimerasa tiene una velocidad
de 60 nucleótidos/segundo. Si se usan enzimas con actividad correctora hay que
aumentar los tiempos.

02.4 Productos de amplificación de la PCR

PRIMER CICLO DE PCR

● Desnaturalización: separación de N+/N-

● Hibridación y extensión: se unen los cebadores y se sintetizan dos nuevas
cadenas: I+/I-
● Resultado final: 2 productos no deseados y 0 productos deseados.

SEGUNDO CICLO DE PCR

● Desnaturalización: se obtienen cuatro cadenas molde.

● Hibridación y extensión: se sintetizan cuatro nuevas cadenas de ADN: I+ , I- A+ y
A- (A corresponde al fragmento que queremos amplificar)
● Resultado final: 4 productos no deseados y 0 productos deseados.

TERCER CICLO DE PCR

● Desnaturalización: 8 hebras molde

● Hibridación y extensión: las 8 hebras darán lugar a 8 heterodúplex.
● Las moléculas de ADN A+/A- coinciden con el fragmento a amplificar. Son
Amplicones.
● Resultado final: 6 productos no deseados y 2 amplicones.

Tras n ciclos de amplificación: 2n productos no deseados y 2^n-2n amplicones.

03 PCR estándar o convencional

La PCR estándar es la forma más simple de PCR, en la que se amplifica un único
fragmento de ADN, con un único par de cebadores y en un único proceso de
amplificación a tiempo final.

03.1 La mezcla de reacción

La mezcla de reacción contiene todos los reactivos necesarios que deben estar
presentes en el medio de reacción para una PCR adecuada.

Consiste en un tampón que contiene disueltos todos los reactivos necesarios para el
proceso, a un pH y concentración salina para una actividad óptima y fiel de la ADNp.

Tampón Tris-EDTA, a pH 8,3-9, concentrado a 2x,5x,10x y con los siguientes reactivos:

Cloruro de magnesio

El MgCl2 aporta los iones de Mg2+ necesarios para que la ADNp pueda desarrollar su
actividad. Una cantidad baja o la ausencia supone la inactividad de la ADNp; mientras
que altas concentraciones conlleva una menor fidelidad replicativa. Cada ADNp tiene
una concentración óptima de Mg2+, siendo la de la Taq polimerasa de 1,5 mM.

Desoxinucleótidos trifosfato

La mezcla debe contener los cuatro desoxinucleótidos del ADN en forma de dNTPs
para que la ADNp pueda usarlos como sustrato para incorporarlos a las cadenas.

Los cuatro deben estar en la misma concentración, pues en caso contrario disminuye la
fidelidad. Se suministran en concentración total 10 mM. La concentración final
estándar de cada dNTP en la mezcla de reacción es 200 micromolar.

Cebadores

La concentración final de cada cebador debe ser la misma y debe establecerse de

forma experimental para cada pareja. Referencialmente, 200-400 nM.

ADNp
La elección de la ADNp depende de la fidelidad, la longitud del fragmento o de la
secuencia a amplificar. Habitualmente, se suministran en soluciones de 50% de glicerol,
con una concentración óptima de 1-2,5 U para un volumen final de 50 microlitros.

ADN molde

Normalmente se utiliza ADN purificado por cualquier método, pero este debe cumplir
unos requisitos de calidad y cantidad.

Criterios de calidad: alto grado de integridad, cociente A260/A280=1,7-2, libre de

contaminantes que puedan inhibir la reacción de PCR.

Criterios de cantidad: ADN plasmídico: 0,1-1 ng, ADN bacteriano: 1-10 ng, ADN humano:
100-300 ng (no se recomienda sobrepasar 10 ng de ADN/microlitro).

Cantidades muy pequeñas se traduce en un bajo rendimiento y cantidades muy

elevadas potencian la aparición de productos no deseados.

03.2 Preparación de las muestras

Ajustar el volumen de reacción

El volumen final suele ser de 25 o 50 microlitros. Luego, hay que calcular los volúmenes
de cada reactivo que se añadirá a la mezcla, según la concentración final que queramos
obtener. La diferencia entre la suma de los componentes y el volumen final se
completa con agua estéril grado PCR.

Master Mix

● La Master Mix es una mezcla de reacción que contiene todos los componentes,
excepto el ADN molde, para múltiples tubos de PCR. Se hace así con el objetivo
de obtener una mezcla homogénea y evitar que cada PCR se lleve a cabo en
condiciones distintas por diferentes errores humanos al pipetear.
● La cantidad de cada componente se calcula multiplicando la cantidad necesaria
para una reacción por el número de muestras que se van a procesar + 1 (mejor
que sobre Master Mix a que no falte para el último tubo), e incluyendo el control
positivo y negativo.
 Control positivo y negativo

El control positivo es un tubo con Master Mix al que se añade ADN molde control que
contiene el fragmento a amplificar (detecta falsos negativos). El control negativo es un
tubo con Master Mix en el que se sustituye el ADN molde por un volumen igual de agua
de grado PCR con el fin de detectar falsos positivos.

03.3 Programación del termociclador

El termociclador es el aparato en el que se lleva a cabo la reacción de PCR. Permite
programar ciclos repetitivos con varias temperaturas y tiempos de incubación.

● 1. Desnaturalización inicial. Inicia la reacción de PCR. Con ella se asegura que

todas las moléculas de ADN se han desnaturalizado.
● 2. Ciclos de replicación. Se programan las temperaturas y tiempos para cada
fase del ciclo de la PCR y el número de este.
● 3. Extensión final. Incubación única para asegurarnos de que todos los
productos de PCR están completos y en forma de doble hélice.
● 4. Mantenimiento. Se incuban las muestras sin límite de tiempo hasta que se
retiren del termociclador.

Etapa Fase Temperatura Tiempo Número de ciclos

1 94-95 grados Varios minutos (3 min) Incubación única

2 Desnaturalización 95 grados 30 segundos Depende del n inicial de

copias del fragmento que
Hibridación 57 grados 30 segundos se quiere amplificar. de
25-35 ciclos (no >40)
Extensión 72 grados 45 segundos

3 óptima para la ADNp (72 grados) 5-10 minutos (7 min) Incubación única

4 4 grados Tiempo indefinido Incubación única

∞

03.4 Análisis de los productos amplificados

● Una vez finalizada la PCR se analiza el resultado en electroforesis en gel de
agarosa 0,5-2% junto con un marcador de tamaños.
 ● Lo ideal es que aparezca una única banda del tamaño adecuado. Varias bandas
de distintos tamaños indican la presencia de productos no deseados y será
necesario repetir el procedimiento (Ajustar MMix o PCR).

Resultado positivo

● Una banda específica: a priori, es un resultado positivo.

● Para descartar falsos positivos, la calle del control negativo debe aparecer sin
bandas. Si contiene alguna banda, significa que hubo contaminación durante el
proceso y se invalida.

Resultado negativo

● Una banda específica: a priori, es un resultado negativo.

● Para descartar falsos negativos, se usa un control positivo que valida la
reacción. Si todo funciona bien, el control positivo mostrará la banda específica.
En caso contrario, hay algún problema en la MMix y se invalida.
● Para descartar la presencia de inhibidores en una muestra, hay que hacer una
nueva PCR en la que se amplifica un gen control presente en dicha muestra.
● Si este control se amplifica bien, se confirma que la muestra es negativa para la
secuencia inicial. En caso contrario, la muestra no es apta para PCR.

04 Modalidades de la PCR estándar

04.1 PCR con inicio en caliente
En momentos previos al inicio de la PCR, se pueden producir productos no deseados,
relacionados a la naturaleza de los cebadores. Se busca evitar la actividad de la enzima
a bajas temperaturas:

● Preparar la mezcla de reacción sin ADNp. Aumenta el riesgo de contaminación.

● Aislar la ADNp del resto de componentes hasta alcanzar una temperatura
determinada.
● Suministrar la ADNp inactiva con alguna Ig o molécula termolábil.
04.2 PCR de grandes fragmentos
El rendimiento de la PCR estándar disminuye con fragmentos superiores a 5 kb. Esto se
debe a la acumulación de productos truncados que no pueden ser usados como molde.

La PCR de GF aumenta el rendimiento cuando se amplifican fragmentos de 5-35 kb.

Mezcla de reacción

● Uso de dos ADNp termoestables: una mayoritaria sin actividad correctora y otra
minoritaria con actividad correctora que elimina nucleótidos erróneos
incorporados por el primero; y así evita que se detenga la polimerización y la
aparición de truncados.
● Uso de aditivos como el glicerol (estabiliza ADNp) o DMSO (desnaturalización).
● Concentraciones bajas de K en el tampón de reacción, que favorece la eficiencia.

Programación del termociclador

● Debido al gran tamaño del fragmento, se aumenta el tiempo de extensión incluso

hasta 25 min; mientras que se reducen los tiempos de desnaturalización para
minimizar la inactivación de las ADNp.

04.3 PCR de alta fidelidad

Son PCR realizadas en condiciones especiales para evitar introducir en los amplicones
mutaciones vía nucleótidos erróneos:

● Utilización de ADNp termoestables con actividad correctora.

● Favorecer las condiciones óptimas de mayor fidelidad de la enzima:
● pH. Algunas enzimas presentan mayor fidelidad a pH más bajo o alto.
● [Mg2+]. Un exceso suele disminuir la fidelidad de las ADNp.

05 Otras técnicas de PCR

05.1 PCR anidada/nested
Consiste en la realización de dos reacciones PCR acopladas, de manera que la segunda
PCR utiliza como ADN molde los productos de amplificación de la primera.

Se usa para aumentar la sensibilidad en los casos en que el rendimiento de la PCR

estándar es bajo o para aumentar la especificidad cuando es posible evitar acumular
productos no deseados.

Cebadores

● Cebadores externos. Se usan en la primera PCR y amplifican un fragmento que

incluye la región de interés.
● Cebadores internos. Amplifican la región de interés e hibridan en el interior del
fragmento amplificado en la primera PCR.
● La muestra que se amplifica en la segunda PCR es el producto de la primera
PCR. Los amplicones de la primera PCR se usan como ADN molde para
reamplificar la región diana que está contenida en ellos.

05.2 PCR múltiple/Multiplex

Consiste en la amplificación de varias secuencias diana simultáneamente en una sola
reacción de PCR. Ello se consigue con varios juegos de cebadores para cada región.

Requisitos:

La temperatura de hibridación de todos los cebadores debe ser similar, ya que se usa
un único programa de termociclador y todas deben unirse al ADN con la misma
eficiencia.

Los distintos amplicones deben poder visualizarse individualmente en la electroforesis.

Los cebadores deben diseñarse para que no puedan hibridar unos con otros.

CONTROL POSITIVO INTERNO

Consiste en añadir a la mezcla de reacción una pareja de cebadores diseñados para
amplificar una secuencia control que tiene que estar presente en el ADN molde. De esta
forma, se confirman los resultados negativos en una única PCR.

● Es positivo si se observa la banda específica a buscar y la del c+.

● Es negativo si se visualiza solo la banda del c+.
● La PCR no es válida si no se observa ninguna banda; ya que indica que hay
inhibidores.

05.3 PCR con transcripción inversa (RT-PCR)

Permite amplificar y analizar moléculas de ARNm. Como las ADNp solo trabajan con
ADN, para amplificar ARN hay que sintetizar ADNc mediante una retrotranscriptasa y,
de ahí, la ADNp utiliza dicho ADNc como molde para amplificar la secuencia del ARNm.

Estrategias para la transcripción del ARN molde

Las RT necesitan cebadores que hibriden con el ARNm para poder sintetizar ADNc:

● Random priming. Una mezcla de cebadores hexanucleotídicos hibridan al azar

en las moléculas de ARN para así transcribir todo el ARN de la muestra a ADNc.
● Cebadores oligo-dT. Hibrida con las colas poli-A de los ARNm para transcribirlos
todos.
● Cebadores específicos. Se usa un cebador de la PCR posterior. Sólo se
transcribe a ADNc un fragmento de ARN con la secuencia a amplificar.

06 PCR a tiempo real

La PCR a tiempo real permite monitorizar el proceso de amplificación mediante el
empleo de productos fluorescentes para detectar los amplicones ciclo a ciclo.

Se evita tener que esperar a que la reacción acabe para conocer su resultado.

El termociclador incorpora un lector de fluorescencia que mide la intensidad de este

parámetro en cada tubo de reacción. Ventajas:
Mayor rapidez en la detección cualitativa de secuencias diana; antes de que acabe.
 ● Resultados fidedignos: la detección de fluorescencia es más objetiva y sensible
que la tinción con bromuro de etidio en el gel de electroforesis.
● Minimiza los problemas de contaminación, ya que la amplificación y detección
se realizan en el mismo tubo cerrado.
● Permite la cuantificación de la PCR, dado que la intensidad de la fluorescencia va
a ser proporcional al ADN sintetizado; ya sea amplicones o ADN diana inicial.

06.1 Sistemas fluorescentes de detección de amplicones

Sistemas de detección independientes de secuencia

● Se basan en el empleo de agentes fluorescentes intercalantes. Estas sustancias

aumentan su emisión de fluorescencia cuando se intercalan en el ADNds.
● Así, el aumento del número de amplicones en cada ciclo se corresponde con un
aumento en la emisión de fluorescencia.
● Por lo tanto, la medida de fluorescencia se mide al finalizar cada ciclo; ya que la
emisión se producirá cuando las cadenas amplificadas estén en forma de doble
hélice tras la fase de extensión.
● El principal inconveniente es la baja especificidad, y que el agente se une a
cualquier molécula de ADN.

Sistemas de detección específicos de secuencia

Estos sistemas se basan en la utilización de sondas oligonucleotídicas marcadas con

fluorocromos que hibridan de manera específica en la región central del amplicón.

De esta manera, la fluorescencia se asocia sólo con los productos deseados;

aumentando la especificidad de la detección.