Capítulo 16

Reacción en cadena
de la polimerasa
Ana Soledad Sandoval Rodríguez / Jorge Fernando Floresvillar Mosqueda
Alejandra Meza Ríos

Introducción polimerasa, cofactores necesarios para la actividad correcta

de la ADN polimerasa, desoxinucleótidos (dNTP) para la
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se considera síntesis del producto de PCR y oligonucleótidos o primers.
una de las técnicas más sensibles y específicas de las prue- La función de cada uno de estos elementos en la reacción se
bas moleculares. Fue desarrollada en 1986 por el Dr. Kary describe a continuación y se enlistan en la figura 16-1.
Mullis, en los laboratorios de CETUR Corporation, en Esta-
dos Unidos, lo que le hizo valedor del premio Nobel ADN polimerasa
en 1993. La idea se fundamentó en la necesidad de obtener
un gran número de copias de fragmentos específicos de En la actualidad, la Taq ADN polimerasa es la enzima más
ADN de manera rápida y económica, los cuales no podían empleada para la PCR; tiene como función polimerizar una
obtenerse por otros métodos hasta ese momento. Esta téc- nueva cadena de ADN tomando como molde otra ya exis-
nica se basa en una replicación exponencial in vitro de una tente. Debido a que en cada ciclo de la PCR se lleva la mezcla
molécula de ADN genómico (ADNg) o ADN complemen- de reacción a temperaturas de 95°C, se requiere de una ADN
tario (ADNc), mediante ciclos repetitivos, que constan de polimerasa capaz de soportar dichas temperaturas. Ante-
tres temperaturas. En cada uno de los ciclos las moléculas riormente, esta necesidad se suplía con la adición de E. coli
se duplican hasta que los reactivos se agotan. en cada ciclo de la ADN polimerasa, que se inactivaba con la
La longitud del producto amplificado la delimitan los temperatura de 95°C, por lo que debía suplementarse de
iniciadores, también llamados primers u oligonucleótidos, nuevo después de cada paso de desnaturalización (95°C). Sin
de cuyo diseño adecuado depende el éxito de la PCR. Los embargo, el descubrimiento de bacterias habitantes de los
iniciadores deben ser específicos, no formar estructuras géiser, que viven a temperaturas alrededor del punto de ebu-
secundarias entre ellos ni hibridaciones inespecíficas entre llición del agua, permitió el aislamiento de la Taq polimerasa
ellos u otra parte de la cadena. de la bacteria Thermophilus aquaticus. Con ello, la técnica
pudo hacerse más eficiente, pues dicha enzima soporta los
95°C, y la cantidad inicial de enzima añadida a la reacción es
Características de la amplificación in vitro suficiente como para suplementar los 25 a 40 ciclos de ampli-
y requerimientos necesarios para la PCR ficación. La concentración de Taq polimerasa que se reco-
mienda es de 1 a 2.5 U/reacción de PCR, y su tasa de error en
La amplificación in vitro de la PCR se apega a las mismas la incorporación de bases es de 4 × 10-4. Esta enzima es capaz
reglas de la replicación; esto es, se basa en una secuencia de polimerizar un promedio de 1000 nt/minuto.
que le sirve de molde y, por complementariedad, sintetiza la
cadena antiparalela. También, la síntesis de la cadena sigue
ADN molde
la dirección 5’-3’, ya que requiere de un nucleótido con el
extremo 3’ libre que proporcione el grupo OH para la adi- Para la PCR teóricamente se requiere de una sola molécula,
ción del siguiente nucleótido, con lo que se forma el enlace cuya secuencia sirva de molde para la amplificación, ya sea
fosfodiéster. de ADN o de ADNg. El ADN se puede obtener de cualquier
Para que se lleve a cabo la PCR se requiere una cadena muestra biológica, y la mayoría de las técnicas de extracción
de ADNg o ADNc que sirva de molde, una enzima ADN de ácidos nucleicos proveen de moléculas de calidad adecua-

145
146 PARTE II • Metodología del ADN recombinante

COMPONENTES PARA UNA REACCIÓN DE PCR menores de 50 μM se consideran insuficientes para una sín-
tesis adecuada.
Molde
ADNds o ADNc Amortiguador
Primers u oligonucleótidos La solución amortiguadora proporciona el pH y concentra-
ciones de sales adecuadas para la correcta función de la
Enzima ADN polimerasa
ADN polimerasa. Este buffer maneja un pH de 8.4 y está
compuesto por Tris-HCl y KCl.
Cofactores (MgCl2)
base

Cloruro de magnesio
O O O A, T, G,C

O P O P O P O CH O

O O O
H
H

H
H

H
H
dNTPs
El magnesio actúa como cofactor de la ADN polimerasa y
Termociclador se suplementa a una concentración de entre 1.0 y 2.5 mM.
Esta concentración debe optimizarse de manera experi-
mental para cada PCR, ya que un exceso de magnesio pro-
Figura 16-1. Componentes de la reacción de PCR. Para que se
duce una amplificación inespecífica de productos de PCR,
lleve a cabo la reacción en cadena de la polimerasa se requiere
mientras que una baja concentración disminuye la produc-
una cadena de ADNg o ADNc que sirva de molde, una enzima
ADN polimerasa, Mn+2 o Mg+2 necesarios como cofactores para ción del amplificado.
la enzima, dNTPs o desoxinucleótidos y oligonucleótidos para el
inicio de la síntesis. Estos reactivos se mezclan y se someten en Iniciadores
el termociclador a los ciclos de amplificación.
El diseño adecuado de los iniciadores es la clave del éxito de
una PCR. Estos oligonucleótidos, con secuencia específica,
se utilizan para reconocer por complementariedad secuen-
da para realizar la PCR. Si se quiere amplificar ARN, antes de cias blanco en el ADN molde. En la PCR convencional, se
la PCR se requiere realizar una reacción previa: la retro- usa un par de iniciadores para delimitar los extremos del
transcripción, que permite convertir el ARN en ADNc, producto que se desea amplificar. Su función radica en pro-
menos lábil que una cadena de ARN (cabe recordar que la porcionar un extremo 3’ libre al que se han de añadir los
inestabilidad molecular del ARN es elevada por la presencia nucleótidos consecutivos mediante enlace fosfodiéster, ya
del grupo OH en el carbono 2’ de la ribosa). El ADNc puede que la ADN polimerasa requiere iniciar la síntesis partiendo
manejarse, entonces, con mayor facilidad. Las técnicas de un 3’OH preexistente. A partir de ellos, la ADN polime-
actuales empleadas en la PCR permiten realizar la amplifica- rasa inicia la polimerización en dirección 5’-3’. Los iniciado-
ción a partir de 300 ng de ADN genómico, o bien desde 25 a res reciben el nombre de sentido y antisentido, según la
100 ng en el caso de ADNc o ADN proveniente de genes secuencia a la que dan origen. El iniciador sentido es com-
clonados en vectores. Es importante aclarar que en el caso de plementario y antiparalelo a la cadena 3’-5’ del ADN molde,
la amplificación de ADNc obtenido por retrotranscripción a por lo que la polimerasa, al adicionar nucleótidos en él, ori-
partir de ARN, durante los primeros ciclos de la PCR se rea- gina una cadena sentido (5’-3’). En cambio, el PRIMER
liza la síntesis de la cadena complementaria del ADNc, lo antisentido es complementario y antiparalelo a la cadena
que permitirá la amplificación de la secuencia como ADN de 5’-3’, por lo que su polimerización originará la cadena 3’-5’
doble cadena (ADNds) en los ciclos posteriores de la PCR. (figura 16-2). En la PCR la concentración óptima de los ini-
ciadores es de 0.3 a 1 μM/reacción, ya que un exceso favo-
Desoxinucleótidos recería la formación de dímeros entre dos primers
parcialmente complementarios, o bien de estructuras
Para que la polimerasa lleve a cabo su función necesita que
secundarias por complementariedad parcial de un primer
existan desoxinucleótidos (dNTP: dATP, dCTP, dGTP,
con el mismo, como se aprecia en la figura 16-3.
dTTP) en la mezcla de reacción para poder sintetizar la
nueva hebra del ADN. Los desoxinucleótidos libres, cuando
Diseño de iniciadores y su papel
no forman cadenas de ácidos nucleicos, se encuentran en su
forma trifosfatada, estructura molecular necesaria para su en la especificidad de la PCR
estabilidad y para proporcionar el grupo fosfato con el que Los iniciadores definen el tamaño del fragmento que se ha
se formará el enlace fosfodiéster en la unión nucleótido- de amplificar. El tamaño de los productos a amplificar se
nucleótido. Los desoxinucleótidos trifosfatados deben adi- encuentra entre 100 y 1000 pb, aunque se recomienda que
cionarse en una concentración óptima de entre 50 y 200 sea entre 200 y 500 pb. En caso de que se desee analizar la
μM, cantidad suficiente para sintetizar de 6.5 a 25 μg de expresión de un ARN mensajero (ARNm) convertido a
ADN. Cantidades mayores de 200 μM pueden producir ADNc, los primers se diseñan de tal forma que uno de éstos
incorporaciones erróneas, mientras que concentraciones hibride en una secuencia exónica y el otro oligonucleótido
 CAPÍTULO 16 • Reacción en cadena de la polimerasa 147

ADN de interés

PCR

3’ 5’

5’
3’
Desnaturalización 95ºC

3’
5’

5’
3’
Alineación de primers 50ºC

3’ 5’
Primer
Primer
sentido 3’ 5’
antisentido
5’ 3’

5’ 3’
72ºC
Extensión

Figura 16-2. Esquema convencional de un PCR. Los ciclos del PCR constan de los pasos de desnaturalización, alineación y exten-
sión. Estos pasos se realizan mediante el cambio automático de temperaturas en un termociclador. La temperatura de desnatura-
lización permite el rompimiento de los puentes de hidrógeno entre las cadenas del ADN, mientras la temperatura de alineamiento
proporciona las condiciones cinéticas favorables para la unión de los iniciadores con su secuencia complementaria. En la tempe-
ratura de extensión la enzima polimeriza los dNTPs y forma la cadena complementaria basándose en el molde al cual hibridó el
primer correspondiente.

a) Estructura secundaria en 3’ lo haga en otra secuencia exónica; de esta manera, la ampli-

ficación del producto del tamaño esperado asegura que sólo
5’ TGTACCGTTCCGTATGGCCC los ARNm se han amplificado. En caso deque se haya ampli-
G ficado también una secuencia de ADNg, (proveniente de
3’ AAGGCATACCGGA contaminación de la muestra de ARN con ADN durante el
proceso de extracción), el producto será de un tamaño dife-
Iniciadores de PCR
rente, ya que tiene secuencias intrónicas de por medio,
no adecuados
como se aprecia en la figura 16-4.
b) Complementariedad de bases La secuencia de los iniciadores debe ser altamente espe-
cífica para el gen de interés, y procurar un contenido de
5’ TGTACCGTTCCGTATGGCCC 3’ nucleótidos G-C de 40 a 60% y una longitud óptima entre los
18 y los 30 nt. También debe evitarse un diseño que permita
5’ la complementariedad o la formación de estructuras secun-
3’ CAAGGCATACCGGGATCGATT
darias inter e intra-primers, sobre todo cuando estas estruc-
Figura 16-3. Posible secuestro del extremo 3’ en los iniciadores
turas secuestran el extremo 3’, indispensable para la adición
de PCR. a) Estructura secundaria en 3’: generada por comple-
mentariedad intrainiciador, generando una estructura plegada
de nucleótidos como se ejemplificó en la figura 16-3.
de doble cadena que interfiere con el correcto alineamiento La secuencia y la longitud de los iniciadores es determi-
del iniciador. b) Complementariedad de bases: producida por nante para su temperatura de fusión (Tm), la cual se define
complementariedad interiniciadores, generando dímeros que como aquélla a la que el 50% de los iniciadores se encuentra
afectan la disponibilidad de los mismos en el PCR. en estructura de cadena lineal. Se procura un diseño tal que
148 PARTE II • Metodología del ADN recombinante

Exón 2 Intrón Exón 3

5’ 3’

3’
Exón 2 Intrón Exón 3 5’

Primer antisentido
Corte y Empalme
5’ 3’

3’
5’ Exón 2 Exón 3
Primer antisentido
Primer sentido 5’ 3’

3’
MOLDE ADNg 5’

Primer sentido
MOLDE ADNc

MPM ADNg ADNc

Exón 2 Exón 3

1000 pb
500 pb Exón 2 Exón 3

300 pb

100 pb

Figura 16-4. Diseño de iniciadores para la discriminación de ARNm y ADNg. Los iniciadores definen el tamaño del fragmento que se
ha de amplificar, por lo que si éstos se diseñan para que hibriden en dos exones diferentes, el tamaño que genere el producto de
amplificación será mayor cuando el molde sea la molécula de ADNg que contiene la secuencia interexónica, es decir un intrón.
Cuando el molde de la reacción de PCR sea el ARNm (ADNc correspondiente), el amplicón será de menor longitud por carecer
de la secuencia intrónica.

la Tm de ambos primers sea muy similar y no presente más misma secuencia blanco o bien en otras secuencias, emplean-
de 5ºC de diferencia con la Tm del producto que se va a do el programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool,
amplificar, lo cual garantiza temperaturas de alineamiento [Link] Este software coteja
similares para ambos primers y una eficiencia de amplifica- una posible hibridación, total o parcial, con alguna secuencia
ción adecuada. La Tm aumenta según la longitud del inicia- reportada en el Gene Bank que pudiera interferir con la
dor, por lo que un iniciador por debajo de las 18 nt hibridaría especificidad de los primers y su empleo correcto. En caso de
de forma inespecífica en la cadena molde y originaría pro- hibridación con otras secuencias (ARNm o génicas) reporta-
ductos inespecíficos. Por otro lado, iniciadores muy largos das en el banco de genes su diseño debe replantearse.
requieren de Tm superiores a 65°C; por esto, la longitud
óptima está entre los 20 y 30 nucleótidos para que se obtenga
una Tm entre 55 y 65°C, compatible con la amplificación de Esquema de la PCR
la generalidad de los fragmentos. Existen muchos métodos
En la figura 16-2 se presenta el esquema convencional de
para calcular la Tm de los iniciadores, pero todos toman en
una PCR, que incluye los siguientes pasos:
consideración el contenido de nucleótidos, sobre todo G y C,
la longitud del primer y la concentración de Na+ en el tubo 1. Inicio de la desnaturalización.
de la PCR. En la actualidad, muchos programas computacio- 2. Ciclos de amplificación.
nales permiten el diseño semiautomatizado de los primers, • Temperatura de desnaturalización.
tomando en cuenta los parámetros mencionados. Algunos • Temperatura de alineamiento.
de los programas utilizados son Oligo 6.0, Primer Express®, • Temperatura de extensión.
Primer Desing®, etc. Una vez diseñados, los oligonucleóti- 3. Amplificación final.
dos deben verificarse contra alineaciones inespecíficas en la 4. Almacenamiento temporal.
 CAPÍTULO 16 • Reacción en cadena de la polimerasa 149

Estos pasos se llevan a cabo mediante el cambio auto- es, se genera la energía cinética necesaria para que los inicia-
mático de temperaturas en un equipo diseñado para este fin dores busquen en las cadenas de ADN su secuencia comple-
denominado termociclador. mentaria y formen los puentes de hidrógeno con la cadena
molde, dejando el extremo 3’OH disponible y listo para la adi-
Termociclador ción de los nucleótidos consecutivos por la ADN polimerasa.
Es el equipo en el cual se realiza la PCR. Es capaz de cam- Extensión
biar la temperatura de la muestra en cuestión de segundos,
Se produce a la temperatura óptima para el funcionamiento
lo que por lo general se logra mediante calentamiento/
de la ADN polimerasa empleada, por lo que dependerá ésta
enfriamiento por resistencia eléctrica de una placa metáli-
para la PCR. En el caso de la Taq polimerasa, la más utiliza-
ca, que distribuye la temperatura de manera homogénea
da es de 72°C.
durante tiempos programados en el rango de segundos a
minutos. Normalmente los rangos de temperatura que Amplificación final
abarca el equipo van de 4 a 96°C. Dado que las PCR que se
incuban son soluciones acuosas, los equipos cuentan con Una vez terminados los ciclos designados para la PCR, la
una placa metálica a manera de tapa, la cual se mantiene a temperatura de extensión (72°C) se mantiene por cinco
103°C para evitar la condensación del agua en las tapas de minutos, lo que permite que la polimerasa termine la exten-
los tubos donde ocurre la reacción. De esta manera, se evita sión de los productos a los cuales se encuentra unida.
que la concentración de los solutos se modifique, lo que
alteraría las condiciones óptimas para la ADN polimerasa y
Almacenamiento temporal
la termodinámica de hibridación de los primers. Para el Durante la programación de los ciclos de la PCR se progra-
enfriamiento se generan flujos de aire frío, lo que permite ma también un ciclo final de 4°C por varias horas, lo que
descensos de temperatura relativamente rápidos. permite conservar los productos de PCR hasta que se reti-
ren los tubos de reacción del equipo.
Inicio de la desnaturalización
Es necesaria una temperatura de 95°C para la desnaturaliza- Cantidad del producto de PCR:
ción de la doble cadena de ADN, en el caso del ADN genó- número de copias por cada ciclo
mico, o el rompimiento de estructuras secundarias, en el según la expresión p = (2)nT
ADNc. Esta temperatura se mantiene por cinco minutos al
inicio de la PCR. Teóricamente, en cada uno de los ciclos de amplificación se
duplica la cantidad de producto inicial. Así, el producto
Ciclos de amplificación de PCR aumenta exponencialmente conforme al número de
ciclos de PCR (n). Sin embargo, el producto de PCR depen-
Un ciclo típico de PCR convencional consta de las tres tem- de del número inicial de copias del molde de ADN (T), por
peraturas siguientes: lo que se aplica la fórmula que indica que si se parte del
• 95°C: desnaturalización por unos 30 segundos. doble de moléculas iniciales de ADN se obtendrá el doble
• 55 a 60°C: alineación por 30 a 40 segundos. de producto:
• 72°C extensión, según la longitud del producto que se va P = (2)nT
a amplificar, considerando la adición de 1 000 nucleóti-
dos en 60 segundos. donde:

Este ciclaje de temperatura se repite continuamente por P = número de moléculas producto de PCR;
30 a 35 ocasiones. Cada temperatura cumple con una fun- n = número de ciclos;
ción específica. T = número de copias inicial de la molécula molde.
Por ejemplo, una PCR de 25 ciclos, partiendo de 10
Desnaturalización copias de ADN molde, producirá la cantidad de P = (2)25 × 10;
Se realiza a 95°C y tiene como objetivo desnaturalizar la o sea, 2250, o lo que es lo mismo, 1.8 × 1075 moléculas.
doble cadena de ADN y/o destruir las estructuras secunda- En la figura 16-5 se presenta un esquema de esta ampli-
rias del ADN, lo que permite el acceso de los primers a la ficación exponencial.
cadena molde en sus secuencias complementarias. Esta
temperatura se mantiene por 30 segundos.
Sensibilidad de la técnica de PCR
Alineación La PCR es una técnica altamente sensible y específica, al
En esta fase, la temperatura se encuentra en un rango entre 55 alcance de la mayoría de los laboratorios de biología molecu-
y 60°C, en el cual la mayoría de los iniciadores hibridan; esto lar. Bajo las condiciones y diseño de oligonucleótidos apro-
150 PARTE II • Metodología del ADN recombinante

Amplificación exponencial 2n

ADN molde Tercer ciclo - 24 16 copias

Primer ciclo - 22 4 copias Cuarto ciclo - 25 32 copias
Segundo ciclo - 23 8 copias P = 2nT= 230 - 1 073 741 824 copias

Figura 16-5. Amplificación exponencial del producto de PCR. La amplificación del producto de PCR sigue la fórmula P = (2)nT,
donde: P = número de moléculas producto del PCR; n = número de ciclos; T = número de copias inicial de la molécula molde. En
cada ciclo se duplica la cantidad de producto inicial, por lo que el número de moléculas producto del PCR aumenta exponencial-
mente conforme avance la reacción.

piados se puede obtener una sensibilidad y una especificidad (ver el capítulo 12 Electroforesis). La intensidad de la ban-
de 100%. Sin embargo, en experimentación es dif ícil obtener da se considera proporcional a la cantidad de producto
estos resultados, ya que múltiples factores influyen de mane- amplificado y su longitud se verifica interpolando contra un
ra crucial en el desarrollo de una PCR, como la selección de marcador de peso molecular comercial de longitudes cono-
un sistema adecuado de detección del producto amplificado, cidas como se aprecia en la figura 16-6. El análisis de imagen
el diseño correcto de primers y sondas, la calidad de la mues- de la banda del producto de PCR permite medir su intensi-
tra que se va a amplificar, el control de los inhibidores de la dad mediante software y realizar una medición semicuanti-
reacción, la contaminación ambiental, la contaminación con tativa de las bandas de los productos de PCR obtenidos en
otros productos de PCR, la optimización de las condiciones diversas muestras. La semicuantificación puede ser respecto
de reacción, la concentración de reactivos, el termociclador a cualquiera de las muestras contenidas en el gel, como se
empleado, etc. El control y el manejo correcto de cada uno observa en la figura 16-7A, en la que el carril 3 muestra una
de estos factores influirán en la calidad de la PCR. Esta sen- banda tres veces más intensa que la banda del carril 1, pero
sibilidad es su principal característica y desventaja: una PCR la mitad de intensa que la banda de la muestra 2. O bien una
puede proporcionar un diagnóstico temprano, pues tan sólo semicuantificación de las muestras respecto a un gen cons-
con pocas copias del genoma de un patógeno puede deter- titutivo, como se observa en la figura 16-7B. Para este tipo de
minarse su presencia. Sin embargo, esta misma característi- análisis se mide la intensidad relativa de la banda del produc-
ca hace que la realización de una PCR sea una tarea para el to de PCR del gen de interés y de un gen constitutivo. Se
especialista y que siempre deba tenerse cuidado de evitar un considera un gen constitutivo aquel que tiene una expresión
acarreamiento de material que pueda contaminar la reac- constante, ya que es indispensable para la viabilidad de la
ción y producir falsos positivos. célula y esta expresión no se altera por la presencia de alguna
enfermedad o variaciones en la condición fisiológica, no
varía entre los individuos ni durante el desarrollo (edad) y
Modalidades de la técnica de PCR no se ve afectado por las condiciones del experimento.
Esta técnica ha evolucionado desde su invención. En la GAPDH (gliceraldehido 3 fosfato deshidrogenasa), HPRT
actualidad, gracias a los múltiples sistemas de detección, a (hipoxanthine guanine phosphoribosyltransferase), β-actina
variantes en los iniciadores y a la cantidad de pares de pri- (beta-actina) y ARNr 18S (ARN ribosomal 18S) son los
mers empleada se dispone de diversas variantes de la técni- genes constitutivos más empleados para este tipo de análisis
ca, que se enlistan a continuación: Con el valor de intensidad relativa de los genes, los
datos se normalizan respecto al gen constituido y se calcula
un índice:
PCR convencional Intensidad relativa del gen de interés
Se basa en la detección del producto de amplificación intensidad relativa del gen constitutivo
mediante una electroforesis en gel de agarosa o acrilamida. Ya que la expresión del gen constitutivo permanecerá
El producto amplificado se visualiza mediante una banda relativamente constante, esta relación indica directamente
 CAPÍTULO 16 • Reacción en cadena de la polimerasa 151

1 2 3

Preparar agarosa o RY
BATTE
acrilamida Pipetear muestras
Agregar gel a la y marcador de PM
cámara y buffer de
corrimiento
(negativo)
4
5
muestra M PM pb

12,000

Afluente de energía 5,000

Marcador de PM

2,000
1,650

1,000
850
650
500
400
300 300
200
100

Comparar bandas de muestras

(positivo) vs marcador PM
Corrimiento

Figura 16-6. Visualización del producto de PCR mediante electroforesis en gel. La detección del producto de amplificación mediante
una electroforesis en gel de agarosa se observa como una banda. La intensidad de la banda se considera proporcional a la canti-
dad de producto amplificado y su longitud se verifica interpolando contra un marcador de peso molecular comercial de longitudes
conocidas. En este gel el carril marcado MPM corresponde al marcador de peso molecular de 1 Kb plus ADN ladder; los valores
correspondientes a las bandas se observan en la columna pb (pares de bases). La muestra corresponde a un producto de aproxi-
madamente 300 pb, como se puede apreciar en el carril de muestra.

MPM C1 C2 C3
MPM C1 C2 C3
A) B)

1000 pb
1000 pb
Gen de interés

500 pb
500 pb

300 pb
300 pb
1 URA

6 URA

3 URA

Muestra C1: 1/1.2 = 0.83

100 pb Muestra C2: 6/1.1 = 5.45
100 pb Muestra C2: 3/095 = 3.15

MPM C1 C2 C3
1 URA

6 URA

3 URA

1000 pb
Gen constructivo

Muestra C2: 6 veces más que la muestra C1

Muestra C3: 3 veces más que la muestra C1
500 pb

300 pb
1.2 URA

1.1 URA

0-95 URA

100 pb

Figura 16-7. Análisis de imagen de la banda del producto de PCR. La intensidad de la banda del producto de PCR se mide mediante
un software. A) Análisis semicuantitativo respecto a una muestra, en el cual las bandas de los productos de PCR obtenidos de
varias muestras se comparan respecto a cualquiera de las muestras contenidas en el gel, como en la imagen donde el carril 3
muestra una banda tres veces más intensa que la banda del carril 1, pero la mitad de intensa que la banda de la muestra del
carril 2. B) Semicuantificación respecto a un gen constitutivo; es aquella en la cual se mide la intensidad relativa de la banda
del producto de PCR del gen de interés y de un gen constitutivo para cada una de las muestras, se determina la relación gen de
interés/gen constitutivo para cada muestra, y dicha relación se compara entre muestras indicando cuál de ellas expresa más o
menos el gen de interés normalizado contra el gen constitutivo.
152 PARTE II • Metodología del ADN recombinante

la variación entre muestras del gen de interés. Esta forma de lizar una relación entre la expresión del gen de interés con
semicuantificación es también posible realizarla con la tec- la expresión del gen constitutivo el índice que se obtenga
nología de detección en tiempo real empleando los métodos indicará la expresión real del gen de interés y se reporta
2ΔΔCt, o el método 2ΔCt, que se describen más adelante. como porcentaje de expresión. Esto permite su compara-
ción con otras muestras analizadas de la misma manera.
PCR cualitativa
Esta modalidad de PCR permite detectar la presencia o PCR cuantitativa
ausencia de un fragmento de ADN determinado. Es decir, En esta modalidad de PCR, el producto de PCR es cuantifi-
sólo reporta si una muestra es positiva o negativa ante la cable, lo que permite reportar en números absolutos la can-
presencia de un determinado ADN. Se emplea para el diag- tidad de un microorganismo o del ARNm de un gen en una
nóstico de enfermedades infecciosas y sólo permite confir- muestra. Para la cuantificación absoluta se amplifica al mis-
mar la presencia o ausencia de un determinado agente mo tiempo una curva con muestras de concentración cono-
patógeno, esto es, si una persona está o no infectada. cida del ADN que se quiere analizar. Los resultados de las
muestras se traslapan a los valores de la curva y de esta
PCR semicuantitativa manera se conoce la concentración de la muestra.
Permite conocer los niveles de expresión de un gen (ARNm)
en particular, y normaliza los niveles encontrados de este PCR múltiple (varias regiones o varios genes)
gen con los encontrados en un gen de expresión constituti- En este tipo de PCR se realiza la amplificación de más de un
va, que se expresa de manera constante en la célula. Al rea- fragmento de ADN en una sola reacción de PCR con dos o

ADN de interés

3’ 5’

5’ 3’

a) Alineación del primer juego de primers

3’ 5’

Primer
Primer
sentido
antisentido
5’
3’

b) Alineación del segundo juego de primers

3’ 5’

Primer sentido
Primer antisentido

5’ 3’

Figura 16-8. PCR anidada. Esta variante de la PCR es más sensible porque amplifica el ADN en dos rondas de amplificación con
distintos pares de iniciadores en cada una. a) La primera reacción de PCR se realiza con un par de iniciadores que amplifiquen
una región de ADN extensa. b) Una segunda PCR se realiza con el producto de amplificación de la primera PCR como molécula
molde con otro par de iniciadores anidados. El producto de amplificación de la PCR anidada será por tanto de longitud más corta
que el primer producto de PCR.
 CAPÍTULO 16 • Reacción en cadena de la polimerasa 153

más juegos de primers (cada juego para un gen en particu- PCR en punto final
lar). Tiene la ventaja de que ahorra tiempo y reactivos, pero
Es aquella en la que el producto de PCR se analiza después de
presenta el inconveniente de que el diseño de los primers
25 a 35 ciclos en el punto previo a la saturación de la reacción,
debe ser adecuado para que no se complementen entre
mediante un gel de electroforesis. Presenta el inconveniente
ellos (hibridaciones inespecíficas). La PCR múltiple o mul-
de que diferente cantidad de material de inicio da lugar a una
tiplex puede emplearse para la búsqueda de varias delecio-
cantidad diferente de producto al final, además de que dife-
nes, mutaciones y polimorfismos en un solo gen o en
rente cantidad de material de inicio da lugar a la misma can-
múltiples. Esta técnica se utiliza para el análisis simultáneo
tidad de producto al final, de la reacción. La detección en
de múltiples marcadores moleculares asociados a alguna
punto final también presenta las desventajas de que depende
enfermedad, para la detección simultánea de varios agentes
de la resolución del gel de agarosa, que suele ser baja y no
patógenos, organismos genéticamente modificados, etcé-
permite detectar pequeños cambios en la concentración;
tera.
requiere un procesamiento posreacción, y la tinción de bro-
muro de etidio es semicuantitativa, pues más de una molécu-
PCR selectiva (detecta genes la de bromuro de etidio puede unirse a un solo producto de
silvestres o mutados) PCR y, por tanto, tiene una precisión pobre y presenta una
sensibilidad menor que la PCR en tiempo real.
Para la PCR selectiva se diseñan primers capaces de hibri-
dar solamente en secuencias con presencia de una muta-
ción, por lo que, en caso de estar ausente, no se produce un PCR en tiempo real
producto de PCR. Como control se produce una PCR con Las desventajas que presenta la PCR en punto final llevaron
primers diseñados para la amplificación de la forma silves- a los investigadosres a diseñar una tecnología que solventa-
tre del gen, cuyos resultados deben coincidir con los obteni- ra estos inconvenientes conocida como PCR en tiempo real.
dos con los primers que amplifican la mutación. En caso de La reacción de amplificación es la misma, lo que cambia es
homocigatos sólo una de las dos reacciones debe resultar el método de detección del producto amplificado y su tem-
positiva, en el caso de heterocigenos ambas reacciones poralidad. La detección de las copias del producto de PCR
resultan positivas. se realiza al mismo tiempo que sucede la amplificación,
mediante intercalados en el producto de PCR, un láser que
detecta fluorocromos acoplados a los primers o a una sonda
PCR in situ
que hibrida en medio de los primers, que se degrada y libera
Se realiza en una muestra de tejido embebida en parafina su fluorocromo por la acción exonucleasa 3’-5’ de la poli-
(laminilla) o congelada y cortada en criostato. No requiere merasa. Mediante la detección de la fluorescencia liberada
extracción del ADN del tejido. En la laminilla se añaden los durante la reacción de amplificación puede medirse la can-
reactivos necesarios para la PCR y se colocan en un termo- tidad de ADN sintetizado en cada momento, ya que la emi-
ciclador especial, ya que en lugar de tener orificios para sión de fluorescencia producida en la reacción es
colocar tubos contiene ranuras para colocar las laminillas. proporcional a la cantidad de producto de PCR formado.
Esta modalidad de PCR permite saber qué tipo celular pre- Esto permite conocer y registrar en todo momento la ciné-
sente en un tejido expresa un determinado gen o cuál célula tica de la reacción de amplificación.
está infectada por un patógeno. Cabe mencionar que para la técnica de PCR en tiempo
real la temperatura de alineación y extensión es la misma,
por lo que ambos pasos se unifican. Esto se logra porque la
PCR anidada (nested-PCR) temperatura óptima para la enzima AmpliTaq Gold® es de
Esta variante de la PCR convencional proporciona mayor 60ºC, lo que aunado a un diseño de primers que permite su
sensibilidad a la técnica, al amplificar las secuencias de alineación óptima a la misma temperatura permite que este
ADN en dos rondas de amplificación con distintos pares de paso sea conjuntado y reduce el tiempo de reacción.
iniciadores o primers en cada una. Esto es, primero se reali- Los sistemas de detección por fluorescencia empleados
za una PCR con un par de iniciadores externos para ampli- en la PCR en tiempo real pueden ser iniciadores marcados
ficar una región de ADN extensa, que contiene el segmento por fluoróforos (primers LUX —light uponextension fluoro-
diana que se desea amplificar. Después, este producto de genic—), sondas específicas marcadas con fluorócromos
amplificación sirve de molde para una segunda PCR con (sondas TaqMan) o bien agentes intercalantes fluorescen-
otro par de iniciadores internos (primers anidados) para tes, como SyberGreen o SyberSafe.
amplificar una región más pequeña (interna). Por lo tanto,
la longitud del producto de amplificación de la segunda PCR en tiempo real empleando SyberGreen
PCR, o PCR anidada, será menor que la del primer produc- Para la detección en tiempo real, puede emplearse un agen-
to de PCR (figura 16-8). te intercalante denominado SYBERreen. En este método,
154 PARTE II • Metodología del ADN recombinante

SyberGreen método consiste en la transferencia de energía fluorescente

mediante resonancia entre dos moléculas. Estas moléculas
son dos tipos de fluorocromos, un donador y un aceptor, y
su principio se basa en que una molécula de alta energía
cercana a otra de baja energía (quencher) promueve una
transferencia energética sin emisión de fluorescencia. Una
vez que se separan dichas moléculas se emite la fluorescen-
cia, que capta el lector del equipo . Las sondas TaqMan son
cortas y para separar las dos moléculas fluorescentes nece-
sitan la rotura de su estructura por la ADN polimerasa con
actividad endonucleasa y así liberar la fluorescencia. En esta
tecnología se emplea la ADN polimerasa (AmpliTaq Gold®),
que se mantiene inactiva por la unión de un anticuerpo y se
SyberGreen sin fluorescencia libera cuando la reacción se incuba a los 95°C iniciales de
SyberGreen con fluorescencia desnaturalización. Los dNTP empleados contienen dUTP
en lugar de dTTP, por lo que los productos de PCR contie-
Figura 16-9. PCR en tiempo real con SyberGreen. La detección en nen dUTP. La mezcla de reacción contiene uracil-N-glico-
tiempo real con SYBERGreen se basa en que esta molécula es
silasa (UNG) (AmpErase®). La enzima UNG degradados
un agente intercalante en la doble cadena de ADN que se une
de manera inespecífica, produciendo fluorescencia. Al unirse a productos de PCR de reacciones previas, previniendo la
toda molécula de ADN de doble cadena se puede unir también contaminación de la reacción de PCR actual con ADN
a dímeros de primers, por lo que es poco específico, pero debi- endógenos. Ya que durante los ciclos normales de PCR las
do a su menor costo es ampliamente utilizado. altas temperaturas inactivan la UNG, sólo los ADN presen-
tes en la muestra servirán de molde para ser amplificados.
Asimismo, el fluorocromo ROX (conjugado de glicina de
5-carboxi-X-rodamina, succinimidiléster) se incluye como
muy utilizado por su bajo costo, el fluoróforo se une al ADN referencia pasiva a una concentración final de 500 nM para
de doble cadena de manera inespecífica y produce fluores- normalizar la fluorescencia entre reacciones por cualquier
cencia (figura 16-9). La desventaja estriba en que la unión, posible fluctuación asociada con variación en el volumen.
al ser inespecífica, será a lo largo de toda la molécula de El empleo de este tipo de sondas se esquematiza en la figura
ADN de doble cadena, incluyendo los dímeros de primer 16-10.
que pudieran formarse. El uso de SYBERGreen implica un
diseño muy cuidadoso de los primers con el fin de evitar la PCR en tiempo real con primers LUX
formación de dímeros. La detección del producto amplifi-
La PCR con primers LUX se fundamenta en que uno de los
cado corresponderá a la intensidad de la fluorescencia; sin
iniciadores se encuentra marcado con un fluoróforo; cuan-
embargo, ya que varias moléculas de SYBERGreen pueden
do el iniciador hibrida con la cadena blanco, el fluoróforo es
unirse a una sola molécula de ADNds, se considera un
excitado, lo que da como resultado un incremento significa-
método de cuantificación menos preciso que las tecnolo-
tivo de la señal de fluorescencia que el láser detecta. Para la
gías con primers LUX o sondas TaqMan.
amplificación con primers LUX se emplea una enzima Taq-
Platinum® ADN polimerasa que se activa sólo después del
PCR en tiempo real con sondas TaqMan hot-start inicial de la PCR (5 minutos a 95°C). De la misma
En esta tecnología (de Applied Biosystems), la reacción de manera que con la tecnología TaqMan, la mezcla de reac-
amplificación se lleva a cabo en un termociclador que reali- ción contiene una UNG para prevención de contaminación
za, a la vez, la detección de fluorocromos mediante luz por acarreamiento. Además, el mix contiene Tris-HCl, KCl,
láser. En esta tecnología, además de un juego de primers se 6 mM de MgCl2, 400 μM de desoxiguanina trifosfato
utiliza una sonda marcada con fluorescencia. La sonda Taq- (dGTP), 400 μM de desoxiadenosina trifosfato (dATP), 400
Man® empleada se diseña de manera que hibrida en algún μM de desoxicitidina trifosfato (dCTP), 800 μM de des-
punto intermedio de la secuencia franqueada por el primer oxiuridina trifosfato (dUTP), UNG, 1 μM de fluorocromo
sentido y el antisentido. Estos primers están diseñados para ROX y estabilizadores. Su empleo se esquematiza en la figu-
amplificar fragmentos de entre 60 y 150 pb. La sonda tiene ra 16-11.
acoplado un fluorocromo en su extremo 5’, silenciado por
otro fluorocromo o quencher (referencia pasiva). La sonda
hibrida en la cadena molde del ADN que va a ser amplifica- Semicuantificación en tiempo
da y libera su fluorocromo sólo cuando la sonda se degrada real con el método 2DDCt
por la acción de exonucleasa 5’-3’ de la ADN polimerasa. En la PCR en tiempo real la concentración relativa se obtie-
Las sondas TaqMan se basan en el método FRET. Este ne interpolando todas las muestras en un punto umbral,
 CAPÍTULO 16 • Reacción en cadena de la polimerasa 155

Sonda Taqman
1 ADN
3’
Primer R sonda 3’
5’
Alineación y polimerización 3’ 5’ 3’
3’ 5’
5’
5’ 5’
Primer

2
Primer R
R
Primer
marcado
sonda 3’
5’
3’ 5’ 3’ 5’
Desplazamiento de hebra y
3’
actividad exonucleasa de la AND 5’
polimerasa sobre la sonda 5’ 5’ 3’
Primer

Primer

3
R Primer R
Primer 3’
marcado
5’
Escisión de la sonda y liberación 3’ 5’ 5’
3’
del fluorocromo 5’ 3’
5’ R No fluorescencia
Primer 5’ 3’

R Fluorescencia
Primer
R 3’
Primer
Figura 16-11. PCR en tiempo real empleando iniciadores LUX. La
5’ detección del producto amplificado se fundamenta en que uno
Polimerización completa y 3’ 5’
emisión de la fluorescencia 3’
de los iniciadores está marcado con un fluoróforo; cuando el
5’
5’ iniciador hibrida con la cadena blanco y se realiza la polimeri-
Primer
zación, el fluoróforo es excitado, resultando en un incremento
de la fluorescencia, lo que es detectado por el láser.
Extintor o Quencher R Reportero fluorescente

Figura 16-10. PCR en tiempo real con sondas Taqman®. Esta

PCR implica el uso de una sonda que hibrida en algún punto
intermedio de la secuencia franqueada por el par de primers
sentido y antisentido. La sonda tiene acoplado un fluorocromo absoluta) o con un grupo de referencia (cuantificación rela-
en su extremo 5’, el cual está silenciado por otro fluorocromo tiva). La cuantificación relativa puede utilizarse para deter-
llamado extintor o quencher en el extremo 3’ de la sonda. La
minar la expresión de los niveles de ARNm de un grupo de
amplificación de la cadena donde la sonda está unida libera el
fluorocromo sólo cuando la sonda es degradada por la acción
células o tejidos respecto a una referencia (control o condi-
exonucleasa de la ADN polimerasa, lo que asegura que sólo ción experimental). Para la cuantificación relativa debe
habrá detección cuando un producto de amplificación haya tenerse en cuenta que todas las muestras provienen de indi-
sido generado. viduos diferentes; por tanto, debe realizarse un procedi-
miento conocido como normalización, con un gen control
endógeno (constitutivo), para eliminar la variabilidad entre
muestra y muestra. El cálculo se realiza mediante la fórmu-
la 2ΔΔCt relativo a un grupo que se considera calibrador.
ciclo de corte o cyclethreshold (CT). El CT es el ciclo elegi- Donde:
do por el usuario de la fase exponencial en donde la canti-
ΔCT = CT promedio del grupo de muestras para el gen
dad inicial de moléculas del gen de interés presentes en una
de interés – CT promedio del grupo de muestras para el
muestra es inversamente proporcional a la intensidad de
gen constitutivo;
fluorescencia. El CT permite discriminar el comportamien-
ΔΔCT = ΔCT grupo calibrador – ΔCT grupo de interés.
to de las muestras, ya que a un menor valor de CT existe
mayor cantidad inicial de moléculas del gen de interés en Por tanto, después de la normalización de los datos res-
una muestra. El CT lo determina un software a un umbral pecto al gen constitutivo (ΔCT) se selecciona un grupo que
de fluorescencia fijo (threshold) seleccionado por el analis- funciona como calibrador del experimento y los datos del
ta, como se expone en la figura 16-12. Estos valores pueden resto de los grupos se comparan con el grupo calibrador
relacionarse con una curva estándar para determinar la tendrá el valor de 1 y el resto de los grupos, un valor menor
cantidad de moléculas de ADN existentes (cuantificación o mayor lo que proporciona un valor semicuantitativo.
156 PARTE II • Metodología del ADN recombinante

tras. La curva estándar se construye a partir de concentra-

ciones conocidas de un plásmido que contiene clonado el
Plateau cADN de la muestra a analizar. Debe asegurarse que la efi-
ciencia de la PCR sea la misma para la muestra y para el
Amplificación estándar. Las diferentes diluciones de la curva presentarán
lineal CT proporcionales a la cantidad de muestra, y mediante la
fórmula de regresión lineal (y = mx + b), interpolando los
Amplificación Threshold
valores de las muestras en el gráfico obtenido se puede
éxponencial
conocer la concentración absoluta de las muestras.
20 25 30 35 40
Cycle

Retrotranscripción como
paso previo a la PCR
La retrotranscripción es una reacción para la conversión
Threshold del ARN en ADNc y en general se lleva a cabo antes de una
PCR, cuando se pretende analizar secuencias de ARN. La
realización consecutiva de una retrotranscripción y una
PCR se conoce como RT-PCR. Esta técnica es una variante
de la técnica convencional de PCR, con el objetivo de
Valor de Ct Valor de Ct
15 20 25 30 35
Cycle 23.6 32.2 amplificar un ARN específico para evaluar su expresión o
Figura 16-12. Gráficas de PCR en tiempo real. La interpretación
presencia. Esta técnica es más sensible y rápida que otras
de datos en la PCR en tiempo real se realiza interpolando todas técnicas de análisis de la expresión de genes (Northen blot,
las muestras en un ciclo de corte o cyclethreshold (CT). El CT Dot blot, Slot blot, ensayos de la nucleasa) y se basa en el
es aquel ciclo presente en cualquier punto de la fase exponen- uso de transcriptasa inversa de los retrovirus cuya función
cial de amplificación en donde la cantidad inicial de moléculas es sintetizar ADN a partir de ARN (figura 16-13).
del gen de interés presentes en una muestra determinada es En la reacción de retrotranscripción una cadena de ARN
inversamente proporcional a la intensidad de fluorescencia. se transcribe a ADN de secuencia complementaria al ARN,
El CT permite discriminar el comportamiento de las muestras, por lo que se le denomina ADNc. La transcriptasa inversa
ya que a un menor valor de CT existe mayor cantidad inicial
más empleada es la del M-MLV (Murine-Moloney leukemia
de moléculas del gen de interés en una muestra. El CT es
determinado por un software a un umbral de fluorescencia fijo
virus). Además del ARN molde, que se convertirá en ADNc,
“Threshold” seleccionado por el analista. se requieren primers, generalmente hexámeros formados de
secuencias aleatorias de 6 nt. Estos hexámeros hibridarán
con las secuencias complementarias a ellos, que se localizan
por azar en todos los ARN presentes en la muestra. Para la
reacción se requiere también un inhibidor de ARNsas (RNA-
Semicuantificación en tiempo
sin®, RNAseout®), un componente enzimático que impide la
real con el método 2∆Ct acción de estas enzimas que puedan estar presentes en la
Este método de semicuantificación para muestras procesa- muestra. Los dNTP (A, G, C, T) se emplearán en la síntesis
das en tiempo real se realiza cuando no se desea tomar un de las cadenas de ADNc, mientras que una solución amorti-
grupo de muestras como referencia, como cuando la mues- guadora proporcionará las condiciones de pH y cofactores
tra se desea comparar frente a ella misma en diferentes con- necesarios para un funcionamiento óptimo de la retrotrans-
diciones. La fórmula se aplica: criptasa. A diferencia de lo que sucede en la PCR, en esta
reacción no se requieren ciclos, y basta con una hora a la
ΔCT = CT promedio de la muestra para el gen constitu-
temperatura óptima de la enzima para realizar la conversión
tivo – CT promedio de la muestra para el gen de interés.
del ARN a ADNc (para la M-MLV son 37°C). Los pasos de
que consta esta reacción son desnaturalización del ARN a
PCR cuantitativa mediante
70°C por 10 minutos para eliminar estructuras secundarias,
la tecnología en tiempo real alineación de los hexámeros por 10 min a 25°C y polimeriza-
ción por la retrotranscriptasa a 37°C por una hora. Una vez
Para una PCR cuantitativa se emplea la metodología en obtenida la cadena de ADNc, ésta se emplea como molde
tiempo real y una curva con estándares de concentración para la técnica de PCR. Este método se utiliza principalmen-
conocida. Esta curva debe tener en cuenta que el ADN o te para detectar genomas virales compuestos por ARN (como
ARN que se emplee debe estar diluido de manera precisa, y la influenza A, el VIH y la hepatitis C), así como para cuanti-
en el caso particular de ARN se asume que la eficiencia de ficar ARNm de cualquier proteína expresada en un tejido.
retrotranscripción ha sido la misma para todas las mues-
 CAPÍTULO 16 • Reacción en cadena de la polimerasa 157

RT

1 2 3

Hexameros

Transcriptasa

Reversa

ARN

4
5 6

cADN
cADN

cADN
ARN Rnasa

Figura 16-13. Reacción de retrotranscripción. Las moléculas de ARN son retrotranscritas a ADNc. En la reacción participa una trans-
criptasa reversa que polimeriza los dNTPs. Se requiere además del RNA molde que será convertido a ADNc, hexámeros aleatorios
de 6 nt que funcionen como iniciadores de la retrotranscripción e inhibidores de ARNsas mientras se realiza la síntesis del ADNc.
Una vez concluida la transcripción inversa el ARN será degradado por las ARNsas del medio y las moléculas de ADNc servirán de
molde a la reacción de PCR.

Aplicaciones de la PCR una técnica indispensable para el diagnóstico médico. Con

ella se pueden amplificar segmentos que contienen una
Los productos de PCR pueden utilizarse para la secuencia- mutación conocida (diagnóstico) o bien mutaciones desco-
ción, detección de patógenos infecciosos (virus bacterias, nocidas que se secuenciarán y determinarán después de
hongos), amplificación de segmentos para su análisis una PCR. Esto ha sido de gran ayuda para el diagnóstico y la
mediante ADN finger-printing, o huella deADN, en medici- correlación de variaciones génicas con enfermedades. En
na forense, detección de mutaciones, análisis de la expre- cuanto a las enfermedades adquiridas, la detección de
sión génica o determinación de carga viral, entre otras genomas de patógenos es la aplicación diagnóstica más
muchas aplicaciones. empleada de la PCR. Debido a su alta sensibilidad, permite
la detección aun de pocas copias del genoma, lo que suele
suceder en los periodos iniciales de la infección; por lo tan-
Diagnóstico como aplicación de la PCR to, la PCR permite un diagnóstico temprano.
La PCR se encuentra al alcance económico de la mayoría de
los laboratorios y en los últimos 20 años se ha convertido en