TEMA 3.

VISUALIZACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS

Tipos de microscopios
Se dividen en dos pos mayoritariamente
• MICROSCOPIOS ÓPTICOS: se u lizan lentes para ver la muestra. Podemos ver bacterias y sobre todo
eucariotas como algas, hongos o protozoos
o Campo claro
o Campo oscuro
o Contraste de fases
o Fluorescencia (epi fluorescencia)
o Microscopio óp co de contraste de interferencia diferencial (DIC)
o Microscopio confocal de barrido por laser
• MICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS: se puede ampliar dejando ver las estructuras intracelulares, con ellos
podemos ver los virus.
o Microscopio de transmisión (MET)
o Microscopio de barrido
• MICROSCOPIO DE FUERZA ATÓMICA
Límites de resolución

Micras

Nanómetros
Microscopia óp ca
Partes de un microscopio óp co

Parámetros importantes
Los parámetros importantes a la hora de ver una imagen son los siguientes:
1. Aumento: Hay sistemas de lentes convexas que permiten ampliar la imagen, para ello tenemos oculares
y obje vos. Pero hasta un máximo en el que no podré aumentar más.
La mejor resolución obtenida en todos los pos de
microscopios óp cos será d=200nm solo puedo
dis nguir entre 2 puntos que se encuentra a 200nm

2. Resolución: Es la capacidad de mostrar dis ntos y separados dos puntos muy cercanos. Siempre
hay una LIMITE DE RESOLUCIÓN (d) que es la menor distancia que se puede conseguir entre dos
puntos adyacentes de una imagen para visualizarlos separados uno del otro. Por eso, cuanto mayor
sea el poder resolu vo la d será más pequeña y mayor será la definición del objeto. Con el
microscopio óp co la d no será más pequeña que 200nm. Yo no puedo ver separados dos puntos que
se encuentran separados a menos de 0,2um (micras).
La resolución depende de la longitud de onda de la luz (λ) y la apertura numérica (AN). La apertura
numérica (AN) es una propiedad de la lente y de alguna manera mide la capacidad que ene la lente de
captar luz.

Para aumentar la resolución de un microscopio tengo que conseguir que el límite de resolución (d) sea lo
mínimo posible para ello aumento el denominador (abajo) y disminuyo el numerador.
Para ello tengo que aumentar la apertura numérica (AN). Aumentar el seno del ángulo (para que aumente
el denominador). También el índice de refracción del medio donde está la lente (n). Al añadir aceite de
inmersión aumenta el índice de refracción (n) provocando el aumento de la apertura numérica. De forma
que disminuye d, tendremos mayor resolución.
Disminuir la longitud de onda.
La mejor resolución se consigue con el obje vo de inmersión (100x) con aceite de inmersión y la luz azul
violeta se consigue d=200nm.

3. Contraste: diferencia en la can dad y po de luz emi da por un objeto y el fondo sobre el que lo vemos.
Si el obje vo y el fondo transmiten la misma can dad de luz, no hay contraste y no lo dis nguimos. Para
ello u lizaremos nciones, hay varios pos:
 Colorantes básicos: el color está en el ion posi vo y como el microorganismo ene carga nega va hay
una atracción de cargas y se ñe el microorganismo.
 Colorantes ácidos: el color está en el ion nega vo y como el microorganismo ene carga nega va hay
una repulsión de cargas y se ñe lo de afuera.
 Fluoróforos: son moléculas capaces de absorber luz ultravioleta y emi r luz visible.
Microscopia óp ca de campo claro

Se u lizan preparaciones frescas, es decir, no enen nción. Así se evitan los cambios morfológicos. Hay
dos pos de técnicas:
1. GOTA PENDIENTE: se u liza si me interesa saber si el microrganismo se mueve o no. En el portaobjetos
hay una excavación (portas excavados como el hueco de las pistas de skate), la muestra se pone el
cubreobjetos (cuadrado más pequeño) y se enfrenta con la parte excavada. Entonces la gota no queda
aplastada si se superponen, porque muchas veces el que se aplasten hace que la muestrea se mueva por
las fuerzas que hay. Por lo tanto, si la muestra se mueve será porque el microorganismo se ha movido no
por otra cosa.
2. MONTAJE HÚMEDO: Ponemos la muestra en el portaobjetos y lo tapamos con el cubreobjetos y lo
llevamos al microscopio.
Para la preparación de muestras teñidas, lo primero que hay que hacer es extender la muestra en el
portaobjetos y dejarla secar. Para fijar pasamos la muestra por encima de la llama (un poco sino se quema)
(es la forma de fijación por preferencia de las procariotas) y luego se le añade el colorante.

Hay tres pos de nciones:

 TINCIÓN SIMPLE: se u liza un único colorante que suele ser básico, entonces todas las células se van
a teñir por igual del mismo color. Para determinar tamaño, forma y estructura celular
 TINCIONES SELECTIVAS: cada estructura ene una composición dis nta ( ñe estructuras), este nte
teñirá unas composiciones químicas selec vas debido a las diferencias químicas de las estructuras.
Ejemplos: cápsulas, endosporas…
 TINCIONES DIFERENCIALES: podemos clasificar a los organismos en grupos diferentes según como
reaccionen a la nción. Ejemplo: la nción de Gram o nción de Ziehl-Neelsen/ nción ácido-alcohol
resistente.

Según la nción de Gram se dis nguen en función de la pared de las bacterias en Gramnega vas
(rosas) o Gramposi vas (morado).
Se añaden cuatro reac vos:
o Colorante básico que ñe a las bacterias de color violeta. Suele ser el cristal violeta.
o Lugol (iodina) disolución de yodo que actúa como mordiente aumenta la afinidad del
colorante básico anterior con la célula.
o Alcohol-acetona que provoca descoloración en Gramnega vas (quedarán sin teñir) debido
a la diferente pared
o Safranina otro colorante básico que ñe de color rosa a Gramnega vas para diferenciar
entre Gramnega vas y Gramposi vas
 La nción de Ziehl-Neelsen / nción ácido-alcohol resistentes se suele u lizar para diferencia
entre microorganismos Mycobacterium (son Gramposi vas pero enen muchos lípidos en su pared
que no permite que se ña bien en nción de Gram, por ello, se u liza esta técnica) y No
Mycobacterium.
El colorante básico empleado para teñir el microorganismo es fucsina con calor para que entre bien
en las Mycobacterium.
Como decolorante u lizo una mezcla de ácido-alcohol de forma que las No Mycobacterium quedan
sin color.
Para contrastar u lizo azul de me leno para teñir las No Mycobacterium.
Microscopio óp co de campo oscuro (por encima)
Se coloca un disco de campo oscuro debajo del condensador y bloquea la entrada de los rayos de luz, la
luz atraviesa el anillo por el lado externo. La única luz que entra en el obje vo es la que es dispersada por
los objetos de la muestra, es decir, podemos ver un fondo oscuro y las células son brillantes (por lo tanto,
podemos ver células vivas). No ene imágenes tridimensionales, pero con esta técnica podemos ver la
estructura interna de eucariotas grandes y agrupaciones de flagelos (movilidad). Sin teñir.

Microscopio óp co de contraste de fases

Incrementa el contraste entre las células y el medio que las rodea, para permi rnos ver células vivas
(levadura, protozoos) sin teñir, además de estructuras bacterianas como las endosporas.
Las ondas de luz viajan a dis ntas velocidades en los materiales con índices de refracción diferentes. Los
rayos que pasan por una bacteria no están en la misma fase que los que pasan por su alrededor. El
pequeño desfase se amplifica con un anillo de fases (en lente obje vo), que hace que aumente el
contraste de la imagen.

Comparación entre microscopios óp cos

Microscopio óp co de contraste de interferencia diferencial (DIC)
La fuente de luz es polarizada, que pasa por un prisma que genera dos haces de luz lo que crea diferencias
en el índice de refracción. Da una apariencia tridimensional, PERO, no es tridimensional (vemos los
núcleos, endosporas, gránulos). Por lo tanto, nos permite ver células vivas sin teñir.
Microscopio óp co de fluorescencia
La fluorescencia es la capacidad que ene un cierto material para absorber energía de una determinada
longitud de onda y la devolvería en forma de luz (para volver a su estado fundamental) con longitud de
onda mayor, luz visible, si incidimos luz ultravioleta. Al tener mayor longitud de onda mayor la Energía
devuelta es menor. Se suele incidir con mucha energía, es decir, luz ultravioleta o luz visible de longitud
de onda muy corta.
Hay algunos organismos que ene elementos fluorescentes, aunque la mayor parte de los
microorganismos no lo son, pero ñéndolos tendrán la propiedad. A esos elementos fluorescentes se le
denomina fluoróforos (DAPI, naranja acridina).
Este microscopio consiste en luz intensamente brillante contra fondo oscuro.
Tiene una aplicación muy ú l como para la inmunofluorescencia (consiste en teñir un an cuerpo concreto
con un fluoróforo, y si le damos luz ultravioleta emi rá luz visible). El an cuerpo quedará unido al
microorganismo. Es ú l para la iden ficación de patógenos.

Microscopio óp co confocal de barrido por láser

Tenemos una mejor resolución (d=0.1). Es un microscopio de fluorescencia con nción con fluoróforos
que está conectado a un sistema computarizado. Las fuentes de iluminación es una laser, que ilumina y
enfoca un solo plano de la muestra. Luego, al enfocar diferentes planos, se recogen en el ordenador
generando una imagen tridimensional, por combinación de planos, de espesores importantes (permite
ver biopelículas).
Microscopia electrónica
Microscopio de transmisión (MET)
Los haces de electrones actúan como fuente de radiación, que enfoca con las lentes electromagné ca. La
resolución es muy buena (d=0.5nm) ya que la longitud de onda del haz es muy pequeña (λ=0,005nm);
gracias a eso se puede hacer un aumento muy grande de hasta un millón de veces. Aunque debe tener
condiciones de vacío (porque si los e- chocan con el aire se dispersan). Generalmente hay que trabajar
con muestras muy delgadas, se cortan con micrótomos muestras no mayores de 20-100nm, (preparación
de las muestras*) y nción con metales pesados (uranio, plomo, ácido ósmico) para que absorban. La
imagen se visualiza en una pantalla fluorescente.
Las muestras enen que ser muy delgadas para que los e- puedan atravesar la muestra.

*Preparación de las muestras técnicas:

ULTRAMICROTOMO
La muestra se deshidrata, se endurece con un plás co y se corta con un ultramicrotomo que ene una
punta de diamante, se coloca en una rejilla y se lleva al microscopio.
CRIOFRACTURA
Se congela la muestra por nitrógeno líquido, con una cuchilla de diamante se golpea y la rotura ocurre en
las zonas más frágiles (normalmente donde están las membranas). A con nuación, se recurre a la
sublimación (de sólido a gas) donde se empieza a ver la estructura celular. Después se ñe por sombreado
mediante nción con inclinación con metales pesados (en cierto ángulo para que haya zonas más oscuras
y claras). Se elimina la parte biológica y la réplica es lo que se observa en el microscopio.
Se ob enen replicas fracturadas a par r de muestras congeladas. Se suele u lizar para ver la estructura
de la membrana y la posición de los orgánulos.

OTRAS TÉCNICAS
TINCIÓN NEGATIVA
La suspensión se mezcla con una sal densa a los electrones (por ejemplo, acetato de uranilo) y se ñe el
fondo.
SOMBREADO
Se incide un metal pesado, normalmente pla no, con cierto ángulo, respecto a la muestra. Produce
sombras lo que hace que la imagen tenga apariencia tridimensional, AUNQUE no lo sea.

TOMOGRAFÍA CRIOELECTRÓNICA O CRIOTOMOGRAFIA

Se crean imágenes tridimensionales. Las muestras se congelan (<150ºC), SE VISUALIZAN. Se congelan muy
rápidamente para evitar la formación de cristales de hielo, después se toman diferentes imágenes de
diferentes direcciones que por ordenador se forma la imagen tridimensional.
Microscopio electrónico de barrido (MEB)
Escanea con un haz de electrones primarios sobre la muestra. Los átomos de la superficie emiten una
nube tenue de electrones secundarios, estos son atrapado por un detector, se lleva a un tubo de rayos
catódico que produce la imagen. Las áreas elevadas emiten muchos electrones secundarios y las áreas
bajas muy pocos. Las áreas elevadas son claras. Las depresiones son oscuras.
Genera una imagen tridimensional. El límite de resolución es d=0,7nm, por lo tanto, ene algo menos de
resolución que el microscopio electrónico de transmisión (MET).

Microscopio de fuerza atómica

NO ES NI ÓPTICO NI ELECTRÓNICO.
Está conectado a un sistema computarizado. La sonda que es una fina aguja está muy cerca de la muestra
a una distancia constante (sube y baja). La sonda barre la superficie, y con el movimiento de la sonda
reproduce “valle y colinas” (mapa topográfico). Se sigue midiendo la desviación de un rayo láser que incide
sobre la palanca.
La sonda va recorriendo la superficie de la muestra y siempre está a una distancia constante de la
superficie de la muestra.
Tiene una grandísima resolución además de no tener que preparar la muestra, ya que puede estar viva e
hidratada. Es parecido al MEB, pero, la preparación de la muestra es similar al MO (microscopio óp co) y
la célula puede estar viva e hidratada.
La escala en nm: PR < 1Armstrong - Nanotecnología
X = 106
 Lo importante es saber la resolución, po de imagen y microorganismos que se
ven.

PASAPALABRA (realizado en clase):

C: Según la teoría endosimbió ca el origen de los cloroplastos son las…Cianobacterias
D: La nción de Gram es una nción…Diferencial
E: Dominio más próximo a Archaea…Eukarya
F: Moléculas que emiten fluorescencia…Fluróforos
G: Técnica que permite ver el movimiento bacteriano en un microscopio óp co de campo claro…Gota
pendiente
K: Quién demostró que los microorganismos son los responsables de las enfermedades infecciosas…Koch
L: Quién visualizó por primera vez los microorganismos…Leeuwenhoek
N: En qué escala trabaja el microscopio de fuerza atómica…Nanómetros
O: Con qué microscopio puedo ver células vivas sin teñir y es un microscopio que ene la misma resolución
que el de campo claro…El de Oscuro
P: Qué po de células son las Arqueas…Procariotas
R: Cuál es la molécula con la que se construyen los árboles filogené cos…RNA ribosómico (subunidad
pequeña)
T: Técnica para destruir endoesporas…Tindalización
V: Tiene estructura aceluar y está formado sólo por ácido nucleico y proteínas…Virus, viroides