“Año de la Esperanza y Fortalecimiento de la Democracia”

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN DE AREQUIPA

FACULTAD DE INGENIERÍA DE PROCESOS

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA DE INDUSTRIAS

ALIMENTARIAS

Microbiología De Los Alimentos

“INFORME 2 ”

DOCENTE:

MG. MARIEL ALVAREZ RODRÍGUEZ

ALUMNO:

Iquiapaza Capacoila, Jesus Emanuel CUI:20251076

AREQUIPA – PERÚ

2026
 PRACTICA Nº2

MÉTODO DE REDUCCIÓN DEL AZUL DE METILENO

(LECHE)
I. OBJETIVOS
• Brindar conocimientos sobre las metodologías del control de calidad en leche
entera (fresca).
• Determinar el tiempo de reducción del azul de metileno “TRAM” en leche fresca.
• Comprender los fundamentos de la medida del tiempo de reducción del azul de
metileno o prueba de la reductada bacteriana en una muestra de leche.
• Aplicar el procedimiento experimental de la prueba de la reductasa bacteriana en
el laboratorio.
• Interpretar los resultados obtenidos y relacionarlos con la presencia de
microorganismos y la calidad higiénica de la leche.
II. MARCO TEORICO
La calidad de la leche comercial y de sus derivados elaborados en una industria láctea,
depende directamente de la calidad del producto original o materia prima, proveniente de las
zonas de producción y de las condiciones de transporte, conservación y manipulación en
general hasta la planta (García E., 2014). La medida en que se ha introducido materia extraña
en la leche también se refleja en cierto grado por su contenido bacteriano. La flora bacteriana
de cada muestra de leche es muy compleja, ya que se introducen muchos tipos de organismos
de diversas fuentes (Hasting E, 2009). Los microorganismos indicadores pueden emplearse
para reflejar la calidad microbiológica de los alimentos en relación con el almacenamiento
del producto o su seguridad. El uso de recuentos de coliformes como indicador de inocuidad
ha sido una herramienta común en la protección de la salud pública durante muchos años.
Los coliformes son un grupo de bacterias que se encuentran comúnmente en el medio
ambiente, incluidos el suelo, las aguas superficiales, la vegetación y las vías intestinales de
los animales de sangre caliente. Los coliformes típicos incluyen el género Citrobacter,
Enterobacter, Escherichia, Hafnia, Klebsiella y Serratia. Algunos coliformes, como
Escherichia coli, generalmente se consideran indicadores en el caso del agua y los productos
lácteos. La detección de coliformes se utiliza como un indicador general de las condiciones
sanitarias en los entornos de producción y procesamiento de lácteos, por lo tanto, su
propagación en la industria alimentaria es un tema importante. Recuentos elevados de
coliformes en la leche y los productos lácteos sugieren que existen condiciones insalubres
 durante la producción, el procesamiento o el envasado (Yuan-Geuy, 2009). La mayoría de
los gérmenes de la leche cuando se multiplican elaboran enzimas reductasas que modifican
el potencial de óxido-reducción de la misma. Para demostrar ese fenómeno basta añadir a la
leche una sustancia que se decolore al pasar de la forma oxidada a la forma reducida. La
rapidez con que cambia de color está en función de la población bacteriana y, por ello, puede
ser un índice del grado de contaminación de la leche. El colorante más empleado en la
industria láctea para realizar esta prueba es el azul de metileno (García E.,2014). Por lo tanto,
el tiempo de reducción se toma como una medida de la cantidad de organismos en la leche,
aunque realmente es una medida de las reacciones metabólicas totales que tienen lugar en la
superficie celular de la bacteria. El azul de metileno es de color azul en estado oxidado y se
convierte en incoloro en estado reducido debido a la actividad metabólica de las bacterias
(Yuan-Geuy, 2009).
III. MATERIALES Y EQUIPOS
• Baño María termorregulado o estufa a 37°C
• Pipetas graduadas (estériles) de 1 y 10 mL
• Tubos de ensayo tapa rosca (estériles)
• Gradillas de acero inoxidable
• Cronómetro
• Solución de azul de metileno al 1% en metanol.
• Leche entera (fresca)
• Vortex
IV. PROCEDIMIENTO
Paso 1: Preparación de las muestras
El proceso comienza en un ambiente estéril. Se
deben tomar tres tubos de ensayo estériles con
tapa rosca y pipetear cuidadosamente 10 mL de
la muestra de leche cruda en cada uno. Es crucial
etiquetarlos claramente como Tubo A, Tubo B y
Tubo C para evitar confusiones.
Paso 2: Adición de reactivos
A continuación, se introducen los agentes de
prueba. Utilizando una pipeta limpia para mayor
precisión, se añade exactamente 1 mL de solución
de azul de metileno a los Tubos A y B. El Tubo C
recibe 1 mL de agua destilada estéril. En esta etapa,
el colorante azul intenso es visible inicialmente
como una capa concentrada sobre la leche blanca
en los primeros dos tubos.

Paso 3: Homogenización
Ahora, las muestras deben mezclarse
completamente. Los tubos se tapan y se
invierten o rotan suavemente varias veces. Este
movimiento distribuye uniformemente el azul
de metileno por toda la leche, transformando el
líquido blanco inicial de los Tubos A y B en una
mezcla líquida homogénea de color azul claro,
como se muestra en la imagen. El control (Tubo
C) permanece blanco.

Paso 4: Tratamiento térmico preventivo

Antes de la incubación principal, se aplica un paso
de control de calidad. El Tubo A (el experimental
que será calentado) y el Tubo C (el control de agua)
se colocan en un baño María con agua hirviendo
(100°C) durante exactamente 3 minutos. El Tubo B
permanece en la gradilla a temperatura ambiente.
Esta breve ebullición desactiva los enzimas y
microorganismos sensibles al calor en el Tubo A.
Tras los 3 minutos, ambos tubos se retiran y se
invierten dos veces para mezclar, como indica la
imagen.
 Paso 5: Incubación principal
Este es el paso crítico donde comienza la medición
del tiempo. Los tres tubos (el Tubo A hervido, el
Tubo B sin hervir y el Tubo C control) se
transfieren a un baño María regulado con precisión
o estufa a 37°C ± 1°C. El baño María está cubierto
con una tapa opaca o colocado en oscuridad para
proteger las muestras de la luz solar directa, que
podría interferir con la reducción del colorante. El
temporizador se inicia en este momento, marcando
el inicio del monitoreo.

Paso 6: Observación y monitoreo

La incubación continúa. Cada 30 minutos (o cada hora tras la fase
inicial), los tubos se revisan cuidadosamente sin agitarlos. La imagen
muestra el momento del monitoreo: el Tubo C (control de agua)
permanece blanco, y el Tubo A (hervido) permanece intensamente azul
debido a la ausencia de actividad microbiana. Sin embargo, el Tubo B
(la muestra de leche cruda) muestra un cambio claro: el color azul se ha
desvanecido en la mayor parte del tubo, dejando solo una banda azul
delgada en la superficie. Esto indica una reducción bacteriana activa y el
final de la prueba para este tubo.
Paso 7: Registro e interpretación de resultados

El paso final es documentar y clasificar la calidad higiénica. La imagen

muestra los resultados finales: el Tubo C (control de agua) es blanco, el
Tubo A (hervido) es azul (confirmando que el calor previene la
reducción) y el Tubo B (la muestra de leche) es completamente blanco
tras la reducción bacteriana. Como el Tubo B se decoloró
completamente antes de la marca de 2 horas (registrado como "Tiempo
de Reducción: 2 horas" en el cuaderno), la muestra se clasifica como de
Mala calidad higiénica, indicando una carga microbiana de
aproximadamente 4 millones de microorganismos.
 V. ANALISIS E INTERPRETACION DE RESULTADOS

La Prueba de Reducción del Azul de Metileno (TRAM), también conocida como prueba de la
reductasa, es un método indirecto y aproximado para estimar la carga microbiana en la leche
cruda.

Se basa en la actividad metabólica de las bacterias presentes: estas microorganismos consumen

oxígeno y producen enzimas reductasas que modifican el potencial redox del medio, lo que
provoca que el colorante azul de metileno pierda su color (se reduzca), pasando de azul intenso a
incoloro (blanco, el color natural de la leche).

Comparación de Resultados según Normativas

Es importante notar que el TRAM es una prueba de plataforma rápida y no un conteo exacto de
bacterias. Por ello, las clasificaciones pueden variar ligeramente entre países u organismos
internacionales en función de sus propios estándares de salud pública e industria.
A continuación, se presenta una tabla comparativa aproximada de cómo se interpretan los
tiempos de reducción en una Norma Nacional (tomando como ejemplo referencias generales de
Latinoamérica como INDECOPI/NTP en Perú o COVENIN en Venezuela) frente a
clasificaciones generales de referencia internacional (como las utilizadas por la industria o en
textos académicos).

Tiempo de Clasificación Calidad Clasificación Calidad Carga Microbiana

Reducción Higiénica (NTP/Norma Higiénica (Referencia Aproximada
(T.R.A.M.) Nacional - Ref. General) Internacional General) (UFC/mL)

Menos de 20
Muy Mala Muy Mala > 20 millones
minutos

20 minutos - 2
Mala Mala 4 a 20 millones
horas

500,000 a 4
2 - 5 horas Aceptable / Regular Aceptable
millones

5 - 5.5 horas Buena Buena < 500,000

Más de 5.5
Muy Buena Excelente / Muy Buena Muy baja
horas
Observaciones sobre la tabla:
• Punto de corte "Buena": Muchas normas nacionales e internacionales coinciden en que una
leche destinada a la industrialización (higienización) debe tener un TRAM mínimo
aceptable de 4 horas. Sin embargo, para ser considerada "Buena", el tiempo suele exigirse
que sea superior a las 5 o 5.5 horas.
• UFC/mL: Las Unidades Formadoras de Colonias por mililitro son estimaciones. El TRAM
no es preciso para diferenciar conteos exactos, especialmente en leches de muy alta
calidad.
• Variaciones: Las denominaciones exactas ("Aceptable", "Regular", "Clase I", "Clase II") y
los minutos exactos de los intervalos pueden variar según la norma específica y
actualizada de cada país. Siempre se debe consultar el texto oficial vigente de la norma
técnica correspondiente (ej. NTP en Perú)

VI. CONCLUSIONES
Se concluye que la Prueba de Reducción del Azul de Metileno (TRAM) demostró ser un método
de plataforma rápido, económico y útil para la estimación indirecta y aproximada de la calidad
microbiológica de la leche cruda en el laboratorio. A pesar de no proporcionar un recuento
exacto de bacterias (como el conteo en placa), permitió categorizar eficientemente las muestras
según su carga microbiana metabólicamente activa en función del tiempo de decoloración.

VII. RECOMENDACIONES
Dada la clasificación de la leche como Mala en la prueba del azul de metileno, esto indica una
carga microbiana extremadamente alta (probablemente superior a 4 millones de
microorganismos por mililitro).
Esta leche representa un riesgo para la salud si se consume cruda y puede no ser apta para
procesos industriales normales sin un tratamiento previo severo. Por lo tanto, se requiere una
intervención inmediata y exhaustiva en la unidad productora (finca o establo).

• Intervención Urgente en las Buenas Prácticas de Ordeño (BPO)

• Saneamiento Riguroso de Equipos y Utensilios
• Gestión de la Sanidad Animal (Mastitis)
• Control de Enfriamiento y Ambiente

VIII. CUESTIONARIO
Describa y especifique los requisitos comerciales de la leche, y su relación que tienen
respecto a las adulteraciones.
Los requisitos comerciales son parámetros de calidad que aseguran que la leche es apta para el
consumo y procesamiento. Se dividen en:
• Fisicoquímicos: Densidad (1.0296 - 1.0340 g/mL), materia grasa (mín. 3.2%), sólidos
totales y punto crioscópico (índice de congelación).
• Higiénicos: Carga microbiana baja (medida por TRAM o conteo en placa) y ausencia de
residuos antibióticos.
• Relación con adulteraciones: Las adulteraciones buscan ocultar deficiencias o aumentar
volumen.
 o Aguado: Se detecta por la baja densidad y alteración del punto crioscópico.
o Adición de solutos (sal, azúcar, almidón): Se hace para "corregir" la densidad tras
el aguado.
o Neutralizantes (bicarbonatos): Se añaden para ocultar la acidez producida por
bacterias en leches viejas, engañando así las pruebas de calidad.
Describa las principales fuentes de contaminación de la leche, y que tipos de
microorganismos son incorporados por dichas fuentes.
El animal (Ubre/Piel): Aporta bacterias de la flora normal y patógenos como
Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae y Brucella.
Utensilios y equipos (Cantinas, ordeñadoras): Es la fuente principal. Incorpora
bacterias lácticas y coliformes (E. coli) si la limpieza es deficiente.
Agua de lavado: Puede introducir microorganismos psicrótrofos (que resisten
el frío) como Pseudomonas y coliformes.
El ordeñador y el ambiente: Aportan bacterias ambientales, esporas de Bacillus
y Clostridium presentes en el polvo, estiércol o forraje.
¿Qué microorganismos de la flora bacteriana de la leche cruda son
termorresistentes?
Son aquellos que sobreviven a la pasteurización (63°C por 30 min o 72°C por 15
s). Destacan:
• Bacterias esporuladas: Géneros Bacillus y Clostridium. Sus esporas
resisten altas temperaturas.
• Micrococos y Enterococos: Como Enterococcus faecalis.
• Lactobacilos termófilos: Algunas especies de Lactobacillus.
• Termodúricos: Microbacterium y Corynebacterium.
Explique el mecanismo bioquímico de la reducción del azul de metileno en
leche cruda, detallando el rol de las enzimas microbianas y los sistemas de
óxido-reducción involucrados.
El azul de metileno es un indicador redox. En estado oxidado es azul y en estado reducido
(leuco-azul de metileno) es incoloro.
• Acción microbiana: Las bacterias en crecimiento consumen el oxígeno disuelto en la leche
durante su respiración celular.
• Sistemas de óxido-reducción: Las enzimas bacterianas (reductasas y deshidrogenasas)
transfieren electrones/hidrógenos desde los sustratos orgánicos (como la lactosa) hacia el
colorante.
• Potencial Redox: A medida que el oxígeno disminuye y la actividad enzimática aumenta, el
potencial de óxido-reducción desciende. Cuando llega a un nivel crítico, el azul de
metileno acepta los electrones, se reduce y pierde su color
Compare e interprete los resultados obtenidos en el siguiente video con la
Norma Nacional e Internacional. Link de acceso:
[Link]
Según lo observado en el video de buenaSenalTV
• Resultados obtenidos: Leche UHT: No presentó decoloración incluso después de 7 horas
de incubación .
o Leche Cruda: No mostró cambios significativos a las 2 horas , pero a las 5.5 horas
presentó una decoloración parcial en la parte superior y se decoloró totalmente a
las 7 horas.
• Interpretación según Normas (Nacionales e Internacionales):
o Leche UHT: Clasificada como de Calidad Excelente/Primera Calidad. Es lógico,
ya que el proceso UHT elimina casi la totalidad de la carga microbiana, por lo que
no hay enzimas que reduzcan el colorante.
o Leche Cruda: Al tardar 7 horas en decolorarse, se clasifica como de Muy Buena
Calidad. Según estándares internacionales, cualquier tiempo superior a 5.5 horas
indica una carga microbiana muy baja (menos de 500,000 microorganismos/mL),
cumpliendo con los requisitos más exigentes para la comercialización e
industrialización.

IX. BIBLIOGRAFIA
• [Link]
3be34cee1b23
• [Link]
• [Link]
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