UNIVERSIDAD PRIVADA ANTENOR ORREGO

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

INFORME PRÁCTICO DE LABORATORIO SEMANA 2

 EXPERIMENTO 1: APLICACIÓN EN MEDICINA DESHIDROGENASA
LÁCTICA (LDH)

Enzima responsable de la conversión del piruvato a lactato empleando NADH.

Enzima citosólica.

Distribución: amplia. Hígado, músculo, corazón. Isoenzimas por subunidades H

y M. Determinación: colorimétrica o cinética. Al alcance de cualquier laboratorio
de mediana complejidad. Existen métodos automatizados. Valores normales:
depende de metodología

Inicio de elevación en Infarto de miocardio agudo: 12 a 24 horas. Pico: 2-3

días. Duración: 8-10 días. Empleo: diagnóstico tardío.

También se usa en líquidos serosos como el pleural para diferenciar exudado

de trasudado cuando LDH de líquido/ LDH suero >0.6 ó LDH del líquido pleural
>2/3 parte del valor normal del LDH sérico.

FUNDAMENTO DEL MÉTODO

Piruvato + NADH+ H+ Lactato + NAD+

La conversión del NADH a NAD+ se mide a 340 nm

REACTIVOS

A.-REACTIVO A: NADH

B: REACTIVO B: Buffer tris y piruvato pH 7.2

Se mezcla 4 partes de A y 1 parte de B para el reactivo final y se obtiene

reactivo de trabajo

Suero obtenido de sangre venosa, con el procedimiento establecido. Dejar

coagular y centrifugar a 3500 rpm por 15 minutos. Se separa el suero.
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

Valores normales: 230–450 UI/L a 37°C

Valores obtenidos: 72.8 UI/L a 37°C

RESULTADO SIGNIFICADO CLINICO

MUY Necrosis extensa (IAM y
ELEVADO hepatitis)
ELEVADO Daño tisular activo
MODERADO Inflamación o hipoxia
BAJO Sin relevancia clínica

CONCLUSIONES

1. En la práctica de laboratorio se obtuvo un valor LDH de 72.8 UI/L, que

se interpreta como SIN RELEVANCIA CLINICA.

2. La LDH es una enzima clave en el metabolismo anaerobio.

3. Su medición se basa en la oxidación del NADH detectada por

espectrofotométricamente a 340 nm.

4. Las isoenzimas permiten correlacionar daño tisular específico,

especialmente cardíaco y hepático.

5. Aunque ha sido reemplazada en IAM por troponinas, sigue siendo útil en

diagnóstico diferencial y seguimiento clínico.

CUESTIONARIO 1: DESHIDROGENASA LÁCTICA (LDH)

1. ¿A qué vía pertenece la LDH?

Lactato deshidrogenasa (LDH) pertenece a la Glucólisis anaerobia
(fermentación láctica), también se relaciona con el metabolismo energético
celular y el equilibrio redox.
Fundamentación bioquímica
 La reacción catalizada es Piruvato + NADH + H⁺ → Lactato + NAD⁺, tal
como se describe en la guía, esta reacción permite regenerar NAD⁺ para
mantener la glucólisis en condiciones anaerobias.
Importancia clínica
LDH predomina en tejidos con metabolismo anaerobio (músculo en
ejercicio intenso, eritrocitos) y es clave en hipoxia tisular.

2. ¿Qué son isoenzimas?

Son formas moleculares diferentes de una misma enzima que catalizan la
misma reacción, pero presentan distinta estructura, propiedades cinéticas,
afinidad por el sustrato (Km), regulación y distribución en los tejidos.

3. ¿Cuáles son las isoenzimas de la LDH y cuál es su distribución en los

tejidos?
En LDH se forman combinaciones de subunidades H (heart) y M (muscle).
Existen 5 isoenzimas principales:

ISOENZIM TEJIDOS
COMPOSICION
A PREDOMINANTES
LDH-1 H4 Corazón y eritrocitos
LDH-2 H3M1 Sistema reticuloendotelial
LDH-3 H2M2 Pulmón
LDH-4 H1M3 Riñón y placenta
Hígado y músculo
LDH-5 M4
esquelético

Relevancia clínica: Permiten identificar el órgano lesionado (enzimología

diagnóstica).

4. ¿Cuál isoenzima predomina en el corazón?

La isoenzima predominante en el corazón es LDH-1 (H4). Se produce una
inversión del patrón normal de LDH o Flip LDH (LDH1 > LDH2), además
LDH se eleva en IAM entre 12–24 h, con pico a los 2–3 días.

5. ¿Qué factores afectan la actividad de la enzima determinada en el

laboratorio?
 Los principales factores son:
a) Factores preanalíticos como la hemólisis (↑ LDH falsamente elevada),
tiempo de procesamiento y temperatura de la muestra.
b) Factores analíticos como pH del medio (óptimo ~7.2), temperatura
(37°C estandarizada), concentración de sustrato (piruvato) y
disponibilidad de NADH.
c) Factores biológicos como daño tisular, ejercicio intenso y
enfermedades hepáticas, musculares y cardíacas.

6. ¿Cuáles son las principales aplicaciones de la LDH en el diagnóstico

médico?
a) Infarto agudo de miocardio: Elevación tardía (12–24 h) y persistencia
hasta 10 días.
b) Evaluación daño tisular inespecífico: Hepatitis, rabdomiólisis y
hemólisis.
c) Oncología: Marcador de proliferación tumoral y pronóstico en linfomas y
leucemias.
d) Derrames serosos (criterios de Light): Diferenciación de exudado vs
trasudado  LDH líquido/LDH suero > 0.6
e) Enfermedades pulmonares: Embolia pulmonar y neumonías

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Murray RK, Bender DA, Botham KM, Kennelly PJ, Rodwell VW, Weil PA.
Harper’s Illustrated Biochemistry. 31st ed. McGraw-Hill; 2018.

2. Rifai N, Horvath AR, Wittwer CT. Tietz Textbook of Clinical Chemistry

and Molecular Diagnostics. 6th ed. Elsevier; 2018.

3. Burtis CA, Bruns DE. Tietz Fundamentals of Clinical Chemistry. 8th

ed. Elsevier; 2019.

4. McPherson RA, Pincus MR. Henry's Clinical Diagnosis and

Management by Laboratory Methods. 24th ed. Elsevier; 2021.

5. Light RW. Pleural effusion. N Engl J Med. 2013;346(25):1971–1977.

ANEXOS:
 EXPERIMENTO 2: INHIBICION ENZIMATICA

INTRODUCCIÓN
Las enzimas pueden sufrir la acción de inhibidores que afectan su actividad sea
en su velocidad máxima como en su Km. Los inhibidores pueden ser
fisiológicos o productos químicos de medicamentos o productos naturales. En
general la inhibición puede ser reversible o irreversible. En la primera el efecto
inhibitorio puede ser competitivo, no competitivo o a competitivo. El clásico
inhibidor competitivo es el malonato de sodio que afecta a la Succinato
deshidrogenasa del Complejo II de la cadena respiratoria; se parece al sustrato
que es el succinato y compite con él por unirse al centro activo. En la inhibición
competitiva aumenta el Km, pero se mantiene la velocidad máxima (V max). En
la inhibición no competitiva disminuye la V max sin afectar el Km y en la a
competitiva disminuyen tanto la V max como el Km..
En la inhibición irreversible existe unión del inhibidor en forma covalente al sitio
activo o la acción de metales pesados como el mercurio que se une a grupos
funcionales. cci
En la práctica se van a estudiar como modelo de inhibición competitiva la
acción del malonato sobre el succinato deshidrogenasa presente en el
homogenizado del hígado y la. inhibición irreversible del bicloruro de mercurio.
REACTIVOS
 Buffer fosfato de sodio 0,1 M pH 7,2
 Succinato de sodio 0,1 M
 Succinato de sodio 0,5 M
 Malonato de sodio 0,1 M
 Bicloruro de mercurio 0,1m
 Azul de metileno 0,001 %
 Homogenizado de hígado al 10 % en KCl 0,154M: 10 gr de hígado en
 100 ml. En el homogenizado eléctrico 3000 rpm x 2 minutos
PROCEDIMIENTO
Armar el siguiente sistema:

REACTIVOS Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo

1 2 3 4 5
Buffer fosfato 0,1 M pH 2 ml 1,8 1,3 1,3 1,0
7,2
Succinato de sodio 0,1M ------ 0,2 0,2 0,2 -----
Succinato de sodio 0,5M ----- 0,5
Malonato de sodio 0,1M ------ --- 0,5 0,5
Bicloruro de 0,5
mercurio
 0,1M
Azul de metileno 1 1 1 1 1
Homogenizado de 1 1 1 1 1
hígado al 10 %

 Dejar en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente

 Observar cambio de color
 Interpretar los cambios
OBSERVACIONES EXPERIMENTALES
 Tubo 1 (control sin succinato): permanece azul
 Tubo 2 (succinato 0.1 M): presenta decoloración parcial / precipitado
oscuro
 Tubo 3 (succinato + malonato): color azul (poca o nula decoloración)
 Tubo 4 (succinato + HgCl₂): permanece azul intenso
 Tubo 5 (alta concentración de succinato ± malonato): azul con leve
FUNDAMENTO
La enzima succinato deshidrogenasa (complejo II de la cadena respiratoria)
cataliza la oxidación del succinato a fumarato. En esta práctica se utiliza azul
de metileno como indicador redox:
Azul (oxidado)
Incoloro (reducido)
Si la enzima funciona, transfiere electrones y el azul de metileno se reduce,
cambio de color.
INTERPRETACIÓN
Observamos que cuando el azul de metileno se decolora significa que la
enzima succinato deshidrogenasa está activa. Esto ocurre porque la enzima
está transfiriendo electrones y el azul de metileno se reduce, volviéndose
incoloro. En cambio, cuando el color azul sigue presente, nos indica que la
enzima no está actuando de manera correcta o que su actividad ha sido
inhibida, ya que no hay transferencia de electrones.
El malonato de sodio actúa como inhibidor competitivo y reversible, mientras
que el mercurio produce una inhibición irreversible al desnaturalizar la enzima.

CUESTIONARIO 2: INHIBICION ENZIMATICA

 1. ¿Cómo se evidencia la actividad del succinato
deshidrogenasa?
Se evidencia por la reducción del azul de metileno, observable como un cambio
de color de azul a incoloro. Esto ocurre cuando la enzima oxida el succinato y
transfiere electrones.
2. ¿Cuál es el efecto del malonato de sodio?
El malonato actúa como un inhibidor competitivo, ya que es
estructuralmente similar al succinato y compite por el sitio activo de la enzima,
disminuyendo su actividad.
3. ¿El efecto del malonato es reversible?
Sí, es reversible. Si se aumenta la concentración de succinato, se puede
desplazar al malonato y recuperar la actividad enzimática.
¿Cómo actúa el mercurio?

El mercurio (Hg²⁺) actúa como un inhibidor irreversible, uniéndose a grupos

sulfhidrilo (-SH) de la enzima y desnaturalizándola, lo que impide su
funcionamiento.
4. ¿Cuál es el rol del azul de metileno?
El azul de metileno funciona como un indicador redox artificial, aceptando
electrones. El oxidado cambia azul, el reducido cambia incoloro permitiendo
visualizar la actividad de la enzima.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. Huamán-Saavedra J. Laboratorio Clínico. Procedimientos
interpretación, 2 da edición, Editorial Universitaria
UNT, Trujillo, 2018

ANEXOS
 EXPERIMENTO 3: FRACCIONAMIENTO CELULAR. UBICACIÓN DE LA
CADENA RESPIRATORIA

INTRODUCCIÒN

El fraccionamiento celular es muy importante para obtener las diferentes

organelas de las células: núcleos, mitocondrias, microsomas y el citosol. El
homogenizado se centrifuga inicialmente a 800 rpm y se obtienen los núcleos
en el sedimento. El sobrenadante se centrifuga a 15000 rpm y se obtienen las
mitocondrias en el sedimento y en el sobrenadante microsomas y citosol. La
cadena respiratoria se ubica en la membrana interna de la mitocondria y por la
fosforilación oxidativa la energía liberada se utiliza para la síntesis de ATP. El
objetivo de la práctica es emplear el fraccionamiento celular y haciendo uso del
complejo 2, el succinato como sustrato y el azul de metileno como indicador.,
así como la p-fenilendiamina demostrar la presencia la cadena respiratoria en
la mitocondria. El azul de metileno es indicador de reducción y se decolora. La
p-fenilendiamina cede electrones al citocromc1 y se oxida cambiando de color
a marrón oscuro.

OBJETIVOS

Objetivo general:

 Reconocer en qué fracción celular se lleva a cabo la actividad de la

cadena respiratoria, a partir de los cambios de color observados
mediante el uso de indicadores redox.

Objetivos específicos:

 Diferenciar la actividad metabólica entre las distintas fracciones

celulares obtenidas.
 Relacionar los cambios de color del azul de metileno y la p-
fenilendiamina con procesos de oxidación y reducción.
 Interpretar los resultados experimentales para identificar la localización
de la cadena respiratoria.

MARCO TEÓRICO
La cadena respiratoria es un proceso que ocurre en la mitocondria y permite la
producción de energía mediante la transferencia de electrones hasta el
oxígeno. Para estudiar la transferencia de electrones hasta el oxígeno. Para
estudiar en qué parte de la célula ocurre este proceso, se utiliza el
fraccionamiento celular, que separa componentes como el núcleo, las
mitocondrias y las microsomas. En esta práctica se emplearon indicadores
como el azul metileno, que es azul cuando está oxidado y se vuelve incoloro
cuando se reduce, y la p-fenilamina, que cambia a color marrón cuando se
oxida. Estos cambios de color permiten identificar en que fracción celular hay
actividad de la cadena respiratoria, siendo principalmente en la fracción
mitocondrial.

MATERIAL Y EQUIPOS

 Buffer fosfato 0,1 M Ph 7,4

 Azul de metileno
 Succinato 0,1M
 p-fenilendiamina 1 %
 Homogenizado de hígado de cuy al 10%
 Fracción nuclear Fracción mitocondrial
 Fracción microsomal y citosol
 KCl 0,154 M

PROCEDIMIENTO

Realizar el fraccionamiento celular:

a) Extraer el hígado de cuy y colocarlo en un Petri. Eliminar la cápsula y

otros tejidos
b) Pesar 10 g de hígado, cortar en pequeños fragmentos y colocar en un
vaso plástico conteniendo 50 ml de KCl 0,1454 M. Se lleva al
homogeneizador eléctrico por 2 minutos a 3500 rpm. Vaciar el contenido
en un vaso de vidrio. Completar a 100 ml. Este es el homogenizado total
c) Centrifugar el homogenizado a 800 revoluciones ´por minuto por 10
minutos en un tubo de polietileno, hacer uso de la centrífuga refrigerada
d) El sedimento es la fracción nuclear
e) Centrifugar el sobrenadante a 15000 rpm. por 15 minutos.
 f) El sedimento son las mitocondrias. El sobrenadante final son los
microsomas y citosol.
g) Vaciar el sobrenadante en un vaso. Recuperar el sedimento haciendo
uso de una micropipeta y vaciarla a un tubo de vidrio.

PREPARAR EL SISTEMA 1

● Mezclar y dejar en reposo por 15 minutos a temperatura ambiente

● Observar los cambios de color

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

El diseño experimental incluyó cinco tubos con diferentes fracciones celulares

para evaluar la localización de la cadena respiratoria. El tubo 1 actuó como
control negativo, sin presentar cambios.

En el tubo 2 (fracción nuclear) y tubo 4 (fracción microsomal) no se

evidenciaron cambios de color, indicando ausencia de actividad de la cadena
respiratoria en estas fracciones.

En el tubo 3, que contenía la fracción mitocondrial, se observó la decoloración

del azul de metileno, evidenciando reacciones de reducción y confirmando la
presencia de la cadena respiratoria en la mitocondria.

Finalmente, el tubo 5 (homogenizado total) mostró una decoloración parcial,

debido a la presencia de mitocondrias junto con otros componentes celulares.
PREPARAR EL SISTEMA 2

• Mezclar y dejar en reposo por 15 minutos a temperatura

ambiente
• Observar el cambio de color

INTERPRETAR LOS RESULTADOS

En este sistema se utilizó p-fenilendiamina como donador de electrones para

evidenciar la actividad de la cadena respiratoria.

El tubo 1 (control) no presentó cambios de color debido a la ausencia de

componentes celulares. De igual forma, los tubos 2 (fracción nuclear) y 4
(fracción microsomal) no mostraron cambios significativos, indicando que estas
fracciones no poseen actividad de la cadena respiratoria.

En el tubo 3, correspondiente a la fracción mitocondrial, se observó un cambio

de color a marrón oscuro, evidenciando la oxidación de la p-fenilendiamina y
confirmando la presencia de la cadena respiratoria.

Finalmente, el tubo 5 (homogenizado total) presentó una coloración marrón

menos intensa, debido a la presencia de mitocondrias junto con otros
componentes celulares.
RESULTADOS

SISTEMA I

Tubo 1: Contiene buffer fosfato 0.1 M Ph 7.4+ azul de metileno + succinato

OBSERVACIÓN: permanece color azul

Tubo 2: Contiene buffer + azul de metileno + succinato + fracción nuclear.

OBSERVACIÓN: Permanece de color azul

Tubo 3:Contiene buffer + azul de metileno + succinato + fracción mitocondrial

OBSERVACIÓN: se empezó a notar una decoloración (positivo fuerte)

Tubo 4:Contiene buffer + azul de metileno + succinato + fracción microsomal

soluble OBSERVACIÓN: Un cambio leve en el color casi desapercibido ya que
su actividad fue muy baja Tubo 5:Contiene buffer + azul de metileno +
succinato + homogenizado total

OBSERVACIÓN: Decoloración moderada gracias a la presencia de

mitocondrias

SISTEMA II

Tubo 1: Contiene buffer fosfato 0.1M pH 7.4 + p - fenilendiamina

OBSERVACIÓN: permanece claro

Tubo 2: Contiene buffer + p - fenilendiamina + fracción nuclear

OBSERVACIÓN: Permanece sin cambio

Tubo 3: Contiene buffer + p - fenilendiamina + fracción mitocondrial

OBSERVACIÓN: Color naranja intenso con pequeñas formaciones de coágulos
Tubo 4: Contiene buffer + p - fenilendiamina + fracción microsomal soluble
OBSERVACIÓN: el color resulta débil y poco visible

Tubo 5: Contiene buffer + p - fenilendiamina + homogeneizado total

OBSERVACIÓN: cambia a color marrón

DISCUSIÓN
En esta práctica se observó que en el sistema I, el azul de metileno se decoloro
en la fracción mitocondrial y en el homogeneizado total, lo que indica que hubo
transferencias de electrones, mientras que las otras fracciones no hubo
cambios; de manera similar, en el sistema II la p- fenilendiamina se volvió
marrón en esas mismas fracciones, confirmando actividad enzimática. En
conjunto, estos resultados muestran que la cadena respiratoria se localiza en la
mitocondria, ya que es donde se evidencian los cambios en ambos sistemas.

CONCLUSIONES

Los resultados muestran que la actividad de la cadena respiratoria ocurre

principalmente en la mitocondria, ya que esta fracción se observaron cambios
de color en ambos sistemas. Es homogeneizado total también presentó
actividad debido a que contiene mitocondrias, mientras que las otras fracciones
no mostraron cambios.

CUESTIONARIO 3: FRACCIONAMIENTO CELULAR. UBICACIÓN DE LA

CADENA RESPIRATORIA

1. ¿Cuál es el rol del azul de metileno?

Actúa como un indicador redox que acepta electrones, reduciéndose y

perdiendo su color. Permitiendo evidenciar la actividad de la cadena
respiratoria.

2. ¿Cuál es el rol de la p-fenilendiamina?

Funciona como un donador artificial de electrones, oxidándose y cambiando a

color marrón oscuro, lo que indica actividad de los citocromos.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Harper, Bioquímica ilustrada, 30 edición, 2016.

2. Vademécum Wiener Lab, Rosario, Argentina.
3. Huamán-Saavedra J. Laboratorio Clínico. Procedimientos e
interpretación, 2 da edición, Editorial Universitaria UNT, Trujillo, 2018
ANEXOS: