1.
Fibrosis Quística: Análisis de Mutaciones y Gen
CFTR
La Fibrosis Quística es el paradigma del diagnóstico molecular de enfermedades
recesivas. El reto es que el gen CFTR es enorme y las mutaciones son muy
variadas.
Aspectos Generales y Evento Molecular
● La Proteína CFTR: Es un canal de cloruro dependiente de ATP. Su ausencia
provoca un transporte de iones deficiente, lo que genera moco hiperviscoso.
● Clasificación de Mutaciones (Crucial para examen):
○ Clase I: Defecto de síntesis (codones de parada prematuros).
○ Clase II: Defecto de procesamiento ($\Delta$F508). La proteína no
llega a la membrana.
○ Clase III: Defecto de regulación (el canal llega pero no se abre).
○ Clase IV: Defecto de conducción (el canal abre pero pasa poco ion).
● Incidencia: 1/25 personas es portadora sana (heterocigoto).
Metodología Detallada: PCR + Hibridación Reversa (StripAssay)
1. Extracción de ADN: Generalmente de sangre periférica (leucocitos)
mediante columnas de sílice.
2. PCR Multiplex Biotinilada: Se amplifican los exones conflictivos. Los
cebadores (primers) llevan una molécula de biotina en el extremo 5'.
3. Hibridación: Los productos de PCR se desnaturalizan (se separan las
hebras) y se ponen en contacto con una tira que tiene "sondas" (secuencias
de ADN conocidas) pegadas.
4. Revelado: Se añade estreptavidina-peroxidasa. La estreptavidina se une a
la biotina. Al añadir un sustrato cromogénico, la tira cambia de color donde
hubo hibridación.
5. Interpretación: Si la mancha aparece en la sonda "Mutada", el paciente tiene
la mutación. Si aparece en "Wild Type" y "Mutada", es portador.
1. Aspectos generales
● Enfermedad: Enfermedad multisistémica de herencia monogénica que afecta
principalmente a pulmones y páncreas.
● Gen implicado: Gen CFTR (Cromosoma 7q31.2).
● Evento: Mutaciones de pérdida de función. La más prevalente es la
$\Delta$F508 (clase II), una deleción de 3 nucleótidos que provoca la pérdida
del aminoácido fenilalanina, resultando en un mal plegamiento proteico y
degradación en el retículo endoplasmático.
● Incidencia: 1/2500-3500 nacidos vivos. 1 de cada 25 personas es portadora
sana.
● Conceptos relevantes: Heterogeneidad alélica (miles de mutaciones
posibles) y el concepto de "gen regulador de conductancia".
2. Muestra y análisis
● Tipo de muestra: Sangre periférica con anticoagulante (EDTA). También
posible en frotis bucal o vellosidades coriónicas (prenatal).
● Qué y dónde: Se analiza el ADN genómico extraído de leucocitos. El
análisis se realiza en laboratorios de genética molecular.
3. Herencia
● Tipo: Autosómica recesiva. El paciente debe ser homocigoto o heterocigoto
compuesto (dos mutaciones distintas, una en cada alelo) para manifestar la
enfermedad.
4. Técnica
● Explicación: PCR Multiplex + Hibridación Reversa (StripAssay). Se
amplifican simultáneamente varios exones del gen CFTR con cebadores
marcados con biotina. Los productos se hibridan en una tira de nitrocelulosa
con sondas específicas para el alelo normal y el mutado.
● Ventajas: Rápida, coste-efectiva y detecta el 80-90% de las mutaciones
comunes en un solo paso, a diferencia de la secuenciación completa que es
más lenta y cara.
5. Relevancia clínica
● Importancia: Diagnóstico definitivo tras test del sudor positivo o cribado
neonatal.
● Consejo genético: Crucial para identificar portadores en familias afectadas y
ofrecer opciones reproductivas.
● Manejo clínico: Determinar la "clase" de mutación permite el uso de
moduladores de CFTR específicos (terapia personalizada).
6. Confirmación de resultados
● Si el StripAssay es negativo pero persiste sospecha clínica, se confirma
mediante secuenciación completa (Sanger/NGS) o MLPA para detectar
deleciones de exones completos.
7. Indicaciones
● Cribado neonatal (TIR elevada), familiares de primer grado de afectados, o
pacientes con clínica compatible (bronquiectasias, insuficiencia pancreática).
2. Panel CIMA: Inestabilidad de Microsatélites (MSI)
Este examen evalúa la capacidad de reparación del ADN del paciente. En el
Síndrome de Lynch, los pacientes nacen con un "hit" (una mutación en un alelo de
los genes MMR).
Fundamento de los Microsatélites
Los microsatélites son regiones no codificantes del genoma consistentes en
repeticiones de 1 a 6 nucleótidos. La ADN polimerasa suele "resbalar" en estas
zonas. Si el sistema MMR (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2) funciona, corrige el error.
Si no, el microsatélite cambia de longitud en el tumor.
Procedimiento de Laboratorio y Análisis
● Muestreo en parafina (FFPE): Se debe realizar una microdisección del tejido
tumoral para evitar contaminación con células sanas.
● Panel de Bethesda: Se analizan 5 marcadores (mononucleótidos como
BAT-25 y BAT-26, y dinucleótidos).
● Electroforesis Capilar:
○ Los fragmentos de PCR se separan por tamaño.
○ Se obtiene un electroferograma (gráfico de picos).
○ Interpretación: Si en el tejido tumoral los picos se desplazan a la
izquierda o derecha (indica que el microsatélite se ha hecho más corto
o largo) en comparación con el tejido sano, hay inestabilidad.
Relevancia de la Proteína MLH1
En casos esporádicos (no hereditarios), el gen MLH1 se silencia por metilación del
promotor. Para el examen: si hay MSI pero no hay historia familiar, se suele pedir
una prueba de metilación o mutación en BRAF (V600E) para descartar Lynch.
1. Aspectos generales
● Enfermedad: Síndrome de Lynch. Predisposición hereditaria al cáncer
colorrectal y de endometrio.
● Genes: Sistema MMR (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2).
● Evento: Mutación germinal inactivante en un alelo seguida de un evento
somático en el segundo. Provoca Inestabilidad de Microsatélites (MSI).
● Conceptos relevantes: Microsatélites (secuencias repetitivas), reparación de
apareamientos erróneos (Mismatch Repair).
2. Muestra y análisis
● Tipo de muestra: Pareja de muestras: Tejido tumoral (en parafina - FFPE) y
sangre periférica (tejido sano) del mismo paciente.
● Análisis: Comparación de la longitud de los microsatélites entre tumor y
sano.
3. Herencia
● Tipo: Autosómica dominante (aunque a nivel celular es recesiva, ya que
requiere la pérdida del segundo alelo para desarrollar el tumor).
4. Técnica
● Explicación: PCR y Electroforesis Capilar. Se utiliza el Panel de Bethesda
(marcadores como BAT-25, BAT-26). Se comparan los electroferogramas. Si
el tumor presenta picos extra o desplazados que no están en la sangre, hay
MSI.
● Ventajas: Mucho más sensible que la inmunohistoquímica para evaluar la
funcionalidad del sistema de reparación.
5. Relevancia clínica
● Importancia: Identificación de familias con Síndrome de Lynch para
vigilancia intensiva.
● Manejo clínico: Los tumores MSI-H suelen responder mejor a la
inmunoterapia (anti-PD1).
6. Confirmación de resultados
● Si hay MSI-H, se debe confirmar con el estudio de mutaciones germinales en
los genes MMR mediante NGS.
7. Indicaciones
● Pacientes que cumplen los criterios de Bethesda o Ámsterdam II, o todo
cáncer colorrectal menor de 50 años.
3. MammaPrint: Transcriptómica y Estudio MINDACT
A diferencia de las mutaciones (genómica), aquí estudiamos el transcriptoma
(ARN).
El Estudio MINDACT
Fue un ensayo prospectivo con más de 6.000 mujeres. El objetivo era comparar el
Riesgo Clínico (Adjuvant! Online) frente al Riesgo Genómico (MammaPrint).
● Discordantes: Pacientes con riesgo clínico alto (tumor grande) pero
genómico bajo. El estudio demostró que estas pacientes no se benefician
de la quimioterapia, con una supervivencia libre de metástasis superior al
94%.
Proceso Técnico
1. Extracción de ARN: El ARN es muy lábil (se degrada fácilmente). Se
requiere tejido fresco o fijado de forma especial.
2. Retrotranscripción (RT): El ARN se convierte en ADN complementario
(ADNc) porque es más estable para trabajar.
3. Hibridación en Microarray: El chip tiene 70 sondas para los genes diana. La
intensidad de la fluorescencia indica cuánto se "expresa" ese gen.
4. Algoritmo: Un software calcula un índice. Si el índice es >0 es bajo riesgo; si
es <0 es alto riesgo.
1. Aspectos generales
● Enfermedad: Cáncer de mama en estadios iniciales.
● Evento: Alteración de los niveles de ARNm en una firma de 70 genes.
● Concepto: Firma molecular (Signature). Es un biomarcador pronóstico que
evalúa la probabilidad de metástasis a distancia.
● MINDACT: Estudio clínico que validó que el riesgo genómico puede
prevalecer sobre el clínico para decidir el tratamiento.
2. Muestra y análisis
● Muestra: Tejido tumoral fresco o fijado en bloque de parafina de alta calidad.
● Qué se analiza: Niveles de expresión génica (ARN total).
3. Herencia
● Tipo: No aplica directamente (es un estudio somático del tumor).
4. Técnica
● Explicación: Microarrays de ADN o RT-qPCR. Se mide la abundancia de
transcritos de 70 genes específicos relacionados con ciclo celular,
angiogénesis e invasión.
● Ventajas: Elimina la subjetividad del patólogo al observar el tumor al
microscopio y ofrece un dato binario (Alto/Bajo Riesgo).
5. Relevancia clínica
● Importancia: Determinar si la paciente se beneficiará realmente de la
quimioterapia.
● Manejo: Evita la toxicidad innecesaria en pacientes con "Bajo Riesgo"
genómico.
6. Confirmación de resultados
● La confirmación viene dada por la validación clínica del estudio MINDACT. No
requiere técnica molecular de confirmación adicional.
7. Indicaciones
● Mujeres con cáncer de mama invasivo (estadio I o II), receptor de estrógeno
positivo y ganglios negativos o hasta 3 positivos.
4. FISH para HER2 en Cáncer de Mama
El FISH (Hibridación In Situ Fluorescente) permite localizar físicamente el gen en el
núcleo celular.
Conceptos Clave
● Amplificación: Proceso por el cual una célula adquiere múltiples copias de
un gen. Es una alteración numérica, no estructural.
● Policitogenética: A veces el cromosoma 17 entero está duplicado
(Polisomía). Por eso es vital usar la sonda de control CEP17.
Técnica Paso a Paso
1. Pretratamiento: Se usan proteasas (pepsina) para "digerir" las proteínas que
envuelven el ADN en el tejido y permitir que la sonda entre.
2. Desnaturalización: Se aplica calor (aprox. 72-75°C) para separar las dos
hebras del ADN del paciente y de la sonda.
3. Hibridación: Se deja incubar (normalmente 16h a 37°C) para que la sonda
se una a su secuencia complementaria.
4. Lavados de Astringencia: Paso crítico. Se eliminan las sondas que se han
unido de forma débil o inespecífica. Si el lavado es poco potente, habrá
mucho "ruido" (fondo); si es demasiado potente, se perderá la señal.
1. Aspectos generales
● Enfermedad: Carcinoma de mama (y gástrico).
● Gen: ERBB2 (HER2), cromosoma 17q12.
● Evento: Amplificación génica. Aumento del número de copias del gen, lo
que deriva en una sobreexpresión de la proteína receptora.
● Incidencia: 15-20% de cánceres de mama.
● Conceptos relevantes: Sonda centromérica (CEP17), hibridación in situ.
2. Muestra y análisis
● Tipo de muestra: Cortes de tejido tumoral fijado en parafina (FFPE).
● Análisis: Se analiza el número de señales fluorescentes dentro del núcleo de
la célula tumoral.
3. Herencia
● No aplica (evento somático, ocurre solo en el tumor).
4. Técnica
● Explicación: FISH (Fluorescence In Situ Hybridization). Se utilizan sondas
de ADN marcadas con fluorocromos. Se desnaturaliza el ADN del tejido y la
sonda, se hibridan y se lavan. Se observa bajo microscopio de fluorescencia.
● Ventajas: Es más preciso que la inmunohistoquímica (IHC) porque cuenta
copias de ADN directamente, no depende de la intensidad del color de la
proteína.
5. Relevancia clínica
● Manejo clínico: Si es HER2+, la paciente es candidata a fármacos como
Trastuzumab (Herceptin), que bloquea el receptor.
6. Confirmación de resultados
● Se calcula el Ratio HER2/CEP17. Un ratio $\geq 2.0$ confirma la
amplificación.
7. Indicaciones
● Obligatorio en todo cáncer de mama recién diagnosticado, especialmente si
el resultado de IHC es dudoso (2+).
5. Oncomine Focus: NGS y Biopsia Líquida
El panel Oncomine Focus es un ensayo de secuenciación dirigida (Targeted
Sequencing).
¿Qué analiza exactamente?
● Hotspots: Mutaciones puntuales en genes como KRAS o EGFR.
● CNVs: Variaciones en el número de copias (como amplificación de MET).
● Fusiones (ARN): Reordenamientos como EML4-ALK. Para esto se necesita
extraer ARN y hacer una RT-PCR previa a la secuenciación.
Ventajas de la NGS en Biología Molecular
● Multiplexación: Podemos analizar 50 genes de 8 pacientes en una sola
"corrida" (run).
● Sensibilidad: Puede detectar una mutación aunque solo esté presente en el
1-5% de las células de la muestra (frecuencia alélica baja).
● Flujo de Trabajo:
1. Creación de librerías (fragmentación + adaptadores).
2. Amplificación clonal (PCR en emulsión o puente).
3. Secuenciación por síntesis (detección de H+ o fluorescencia).
4. Bioinformática: Alineamiento de las lecturas (reads) contra un genoma
de referencia.
Aplicación en Cáncer de Pulmón
Es la prueba de elección porque las biopsias por punción (PAAF) dan muy poco
material. Hacer 10 pruebas de PCR separadas agotaría el ADN; con NGS se hace
todo a la vez.
Resumen para Repaso Rápido:
● FQ: Gen CFTR, PCR+StripAssay, Herencia Recesiva.
● CIMA/Lynch: Sistema MMR, Inestabilidad de Microsatélites (MSI), PCR
Capilar.
● MammaPrint: ARN, 70 genes, Microarrays, Pronóstico quimioterapia
(MINDACT).
● HER2: Gen ERBB2, FISH (Sonda LSI/CEP17), Ratio > 2.0.
● Oncomine: NGS, Multigénico (ADN/ARN), Medicina de precisión en pulmón.
1. Aspectos generales
● Enfermedad: Cáncer de pulmón no microcítico (CPNM).
● Genes: EGFR, ALK, KRAS, BRAF, ROS1, RET, MET, NTRK.
● Evento: Multivariante (Mutaciones puntuales, amplificaciones y
fusiones/translocaciones).
● Conceptos: Secuenciación de Nueva Generación (NGS), biopsia líquida,
diana terapéutica.
2. Muestra y análisis
● Muestra: Biopsia de tejido (FFPE) o biopsia líquida (sangre periférica para
detectar ADN tumoral circulante - ctDNA).
● Análisis: Análisis multigenético de "hotspots" (puntos calientes) de mutación.
3. Herencia
● No aplica (estudio somático).
4. Técnica
● Explicación: NGS (Ion Torrent). Es una secuenciación masiva paralela
basada en la detección de protones (pH). Se amplifican miles de fragmentos
y se secuencian a la vez.
● Ventajas: Analiza muchos genes con muy poca muestra (crítico en pulmón,
donde las biopsias son mínimas). Detecta variantes que la PCR simple
ignoraría.
5. Relevancia clínica
● Manejo clínico: Permite asignar un tratamiento específico (terapia dirigida)
para cada mutación detectada.
● Importancia: Es el estándar actual de la Medicina Personalizada.
6. Confirmación de resultados
● Mediante validación bioinformática y, en casos específicos, confirmación por
Sanger o FISH (para fusiones).
7. Indicaciones
● Pacientes con CPNM avanzado o metastásico para decidir el tratamiento de
primera línea.