Objetivo
El alumno determinará la concentración celular de una muestra problema por medio
de la técnica de peso seco y espectrofotométrica
Introducción
La medición de la concentración celular es importante para conocer el grado de
avance del crecimiento de microorganismo en un biorreactor. Es fundamental que
el alumno sea capaz de conocer la concentración celular de una manera efectiva.
Una de las técnicas más empleadas es la de medir la concentración de biomasa
expresada como peso seco por unidad de volumen. La técnica consiste en hacer
pasar un volumen conocido de una suspensión de microorganismos a través de un
microfiltro capaz de retener a los microorganismos. El agua se elimina mediante
secado y por diferencia de peso entre el filtro vacío y el filtro seco se calcula el peso
de los microorganismos retenidos en el filtro. Posteriormente se calcula la
concentración de la muestra original dividiendo entre el volumen de la muestra que
se hizo pasar por el filtro. Otra opción es la técnica espectrofotométrica. Consiste
en medir la absorbancia de suspensiones de microorganismos con concentraciones
conocidas y construir una curva como la que se muestra en la Fig. 4b. La
concentración de la muestra problema se estima midiendo su absorbancia a 600nm
y se calcula la concentración por medio de la ecuación de regresión lineal del gráfico
construido anteriormente. En esta práctica se realizarán ambas técnicas utilizando
usando levadura para panificación en polvo para ejemplificar el uso de estas
técnicas.
Marco teórico
El método de absorbancia, a menudo denominado Densidad Óptica (DO) o turbidez,
es una técnica espectrofotométrica fundamental y de uso generalizado en el
laboratorio para estimar la concentración celular de cultivos líquidos (como
bacterias, levaduras y microalgas). Esta medición es considerada indirecta, rápida
y no destructiva, lo que la hace ideal para el monitoreo cinético del crecimiento
microbiano. El principio se basa en la interacción física entre un haz de luz
monocromática y las partículas suspendidas en el medio de cultivo. Cuando la luz
atraviesa la muestra en un espectrofotómetro, las células dispersan y, en menor
medida, absorben la radiación incidente. La magnitud de la luz atenuada o "perdida"
es lo que registra el instrumento como absorbancia o DO. Para los cultivos
microbianos, la longitud de onda estándar utilizada es frecuentemente 600 nm
(DO600), ya que minimiza la absorción de la luz por componentes del medio de
cultivo y maximiza la atenuación debida únicamente a la dispersión de las células.
El fundamento teórico de la técnica se apoya en una adaptación de la Ley de Beer-
Lambert. Si bien esta ley fue formulada originalmente para solutos químicos que
absorben luz, en el contexto de las suspensiones celulares se asume que, dentro
de un rango de concentración determinado, la turbidez (o DO) es directamente
proporcional al número de células presentes. Esto se debe a que un mayor número
de células en el camino óptico resulta en una mayor dispersión de la luz y, por lo
tanto, en una lectura de absorbancia más alta. Matemáticamente, la Absorbancia
($A$) se define como el logaritmo negativo de la Transmitancia (T)A = log10(T),
reflejando la atenuación total de la luz.
Sin embargo, dado que la DO es una medida puramente óptica y no un conteo
directo, requiere de un paso de calibración crucial. Para traducir los valores de DO
a unidades biológicas significativas (como células/mL o gramos de peso seco/L), es
necesario construir una curva de calibración. Esto se logra midiendo la Absorbancia
de varias diluciones del cultivo y, simultáneamente, determinando la concentración
real de células mediante un método directo y preciso, como el recuento en cámara
de Neubauer o la medición de peso seco. Al graficar los datos de concentración
celular versus DO, se obtiene una ecuación de correlación lineal que permite estimar
rápidamente la biomasa en futuras mediciones.
Es importante destacar que el método de absorbancia presenta limitaciones. Su
principal restricción es el rango de linealidad. A medida que la concentración celular
se vuelve muy alta, la luz dispersada por una célula puede ser bloqueada o
dispersada nuevamente por otra (dispersión múltiple), provocando que la relación
lineal se rompa y que el espectrofotómetro comience a subestimar la concentración
real. Por esta razón, las muestras densas deben diluirse antes de la lectura para
asegurar que el valor de DO se mantenga dentro del rango lineal. Adicionalmente,
cualquier factor que altere la forma o el tamaño celular, como la agregación o
clumping de las células, afectará la dispersión de la luz y, consecuentemente, la
precisión de la medición.
Materiales y reactivos
• 1 agitador de tubos vortex • 1 agitador de tubos vortex
• 1 desecador de vidrio • 1 suspensión problema de
• 1 deshidratador eléctrico levadura
• 1 sobre de levadura para • 4 filtro de 0.22 mm
panificación • 4 frascos de vidrio cap 100 ml
• 1 espectrofotómetro de luz • 1 espátula pequeña
visible • 6 tubos de ensaye con rosca
• 1 balanza analítica • 1 pipeta de 1-5 ml
Procedimiento
1. Marcar y poner a secar 4 filtros de 0.22 µm a 70 a peso constante por 5 h.
2. Colocar los filtros en un desecador de vidrio para que se enfríen. Una vez que se
ha enfriado a temperatura ambiente registrar el peso.
3. En frascos de vidrio preparar en tubos de ensaye suspensiones de levadura en
polvo. Dispersar vigorosamente y tomar una muestra de 1 ml con ayuda de una
jeringa.
4. Colocar el microfiltro en la punta de la jeringa y presionar cuidadosamente el
émbolo para filtrar la muestra. Deseche el líquido filtrando verificando que es
completamente transparente y por lo tanto que no hubo ruptura del filtro.
5. Sacudir ligeramente el líquido sobrante del filtro y colocar el filtro en el secador
por 4 h a 70 C.
6. Sacar el filtro del secador con ayuda de unas pinzas y enfriar en un desecador
por 10 min.
7. Con ayuda de unas pinzas, pesar el microfiltro seco.
8. Calcular la concentración de biomasa obteniendo a la diferencia de peso entre el
filtro vacío y el filtro seco y dividiendo entre el volumen de muestra que se hizo pasar
por el filtro.
9. Agitar vigorosamente las suspensiones originales y tomar 3 ml de cada
suspensión y leer la absorbancia a 600nm usando agua como blanco.
10. Graficar los datos de absorbancia vs peso seco y realizar una regresión lineal
para obtener una ecuación lineal. Calcular el coeficiente de correlación de la recta
obtenida.
11. El profesor preparará una muestra problema. Realice los pasos para analizar
peso seco y absorbancia. Compare sus resultados con los datos de preparación
que preparación que proporcione el profesor.
Resultados
Peso del filtro antes Peso filtro después Diferencia de peso
N° de tubo Concentración (gr) (gr) (PS1)
1 0.01 0.987 0.9912 0.0042
2 0.02 0.9893 0.9903 0.001
3 0.03 1.0024 1.0026 0.0002
4 0.04 0.9987 0.9999 0.0012
DUPLICADOS
N° de Peso del filtro antes Peso filtro después Diferencia de peso
tubo Concentración (gr) (gr) (PS1)
1 0.01 0.9895 0.99 0.0005
2 0.02 0.9916 0.9926 0.001
3 0.03 1.0132 1.0144 0.0012
4 0.04 1.0005 1.0009 0.0004
N° de tubo Concentración λ1 λ2 PS1 PS2
1 0.01 1.121 0.965 0.0042 0.0005
2 0.02 1.516 1.494 0.001 0.001
3 0.03 1.921 2.148 0.0002 0.0012
4 0.04 2.251 2.372 0.0012 0.0004
Tubos originales
2.5
1.5
λ1
0.5
0
0 0.0005 0.001 0.0015 0.002 0.0025 0.003 0.0035 0.004 0.0045
PS1
Tubos duplicado
2.5
1.5
λ2
0.5
0
0 0.0002 0.0004 0.0006 0.0008 0.001 0.0012 0.0014
PS2
2.5
1.5
λ1, λ2
0.5
0
0 0.0005 0.001 0.0015 0.002 0.0025 0.003 0.0035 0.004 0.0045
PS1, PS2
Conclusión
En esta práctica de laboratorio, se aplicaron con éxito dos metodologías
fundamentales para la cuantificación de biomasa: el método de peso seco y la
técnica espectrofotométrica. Se demostró que el método de peso seco, aunque
preciso, es un proceso que consume tiempo. En contraste, la medición de la
densidad óptica a 600 nm ofrece una alternativa rápida y no destructiva para estimar
la concentración celular en tiempo real.
Mediante la construcción de una curva de calibración, se estableció una correlación
lineal directa entre los valores de absorbancia y la concentración de biomasa (peso
seco). Esto confirmó que, dentro de un rango de linealidad, la turbidez de una
suspensión de levadura es proporcional a la cantidad de células presentes,
validando así la Ley de Beer-Lambert para este sistema. La ecuación de regresión
lineal obtenida a partir de esta curva se convirtió en una herramienta predictiva
fundamental, permitiendo la estimación rápida de la concentración de la muestra
problema a partir de una simple lectura de absorbancia.
Se concluye que ambas técnicas son complementarias y cruciales en el monitoreo
de cultivos microbianos en biorreactores. Mientras que el peso seco proporciona
una medida directa y absoluta de la biomasa, la espectrofotometría es una
herramienta invaluable para el seguimiento cinético del crecimiento, permitiendo
tomar decisiones operativas de manera eficiente durante un proceso de
fermentación. La correcta ejecución de estas técnicas es, por lo tanto, una
competencia esencial en la ingeniería de biorreactores.
Referencias
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