XVII.

PCR
Máster en Biología Molecular
¬¬ Índice
1. Materiales y reactivos necesarios 4

2. Procedimiento 6

3. Tipos de PCR 7
3.1 RT-PCR 7
3.2 PCR anidada 7
3.3 PCR múltiple 7
3.4 PCR in situ 7
3.5 PCR cuantitativa en tiempo real 8

4. Aplicaciones de la PCR 10
Tecnologías de análisis y manipulación de ácidos nucleicos

Objetivos
¬¬ Comprender la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
¬¬ Conocer los componentes y materiales necesarios para realizar una PCR
¬¬ Distinguir los principales tipos de PCR.

Ideas clave
¬¬ La PCR permite obtener múltiples copias de un fragmento de ADN.
¬¬ La PCR consta de 3 etapas: inicio, 20-35 ciclos (desnaturalización, alinea-
miento y extensión) y extensión final.

¬¬ Existen diferentes tipos de PCR, como RT-PCR, PCR anidada, PCR múltiple,
PCR in situ y PCR cuantitativa en tiempo real.

Introducción
La reacción en cadena de la polimerasa o PCR (Polymerase Chain Reaction) es una técnica
que permite obtener múltiples copias de un fragmento de ADN, gracias a la actividad de una
enzima DNA polimerasa termoestable. Fue desarrollada en 1983 por Kary Mullis, mientras
trabajaba en la empresa Cetus Corporation. En 1993 recibió el Premio Nobel de Química en
1993. Era la primera vez que se concedía este premio a un trabajo realizado fuera del ámbito
académico.

La PCR se ha convertido en una herramienta básica y fundamental, no solo en la biología

molecular o en la genética, sino también en otras ramas de la ciencia como la medicina o la
microbiología. De hecho, en 1989, la revista Science seleccionó a la técnica de PCR como el
“mayor desarrollo científico” y a la Taq polimerasa “molécula del año”.

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1. Materiales y reactivos necesarios

La PCR consiste en una rápida amplificación in vitro de un fragmento de ADN. Para la realización
de una PCR necesitamos los siguientes reactivos:

¬¬ ADN molde: fragmento de ADN que queremos amplificar. Puede ser un ADNc (retro-
transcrito a partir de un molde de ARN) o ADN purificado de un organismo o célula.

¬¬ Taq polimerasa: DNA polimerasa termoestable, aislada de la bacteria Thermus aquaticus,

que permite replicar hebras de ADN. Su temperatura óptima de actividad es 72ºC.

¬¬ Cebadores o primers: son oligonucleótidos (18-24 nucleótidos) complementarios a los

extremos 3’ de la secuencia de ADN que se quiera amplificar. Por lo tanto, se diseñan
específicamente para cada fragmento de ADN que se quiera amplificar, empleando
programas informáticos como Primer3. Existen varias reglas para el diseño de los
primers como:

• El contenido en C-G tiene que estar alrededor del 50-60%

• La temperatura de fusión o melting (Tm) de los cebadores ha de ser similar. La

Tm es la temperatura a la que el 50% de los cebadores está unido a la hebra del
ADN. La melting temperature depende de la secuencia de los cebadores: a mayor
cantidad de G-C, mayor temperatura. Se calcula como Tm= 4 (C+G) + 2 (A+T). Se
recomienda una Tm cercana a 58ºC.

• Evitar secuencias de 3 o más Cs o Gs en las regiones 3’ terminales.

• Las regiones 3’ no pueden ser complementarias.

• No incluir dentro de la secuencia de cada cebador regiones autocomplementarias.

¬¬ dNTPs: mezcla de los 4 desoxirribonucléotidos necesarios para la síntesis de las

nuevas moléculas de ADN (dATP, dCTP, dTTP y dGTP). La concentración empleada
ha de ajustarse para cada reacción, pero habitualmente se emplea una concentración
de 100 µM de cada uno.

¬¬ MgCl2: la Taq polimerasa emplea Mg+2 como cofactor. Al igual que ocurre con los otros
componentes, es importante ajustar su concentración para cada reacción de PCR.

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Por otro lado, es muy importante evitar la presencia de inhibidores de la PCR. Son sustancias
que inhiben la actividad de la Taq polimerasa. Se emplean muchas veces en etapas previas
como durante la lisis de los tejidos o durante la extracción de ácidos nucleicos. Ejemplos:
dodecilsulfato sódico (SDS), fenol, etanol, isopropanol, acetato de sodio, cloruro sódico, EDTA,
hemoglobina, heparina, urea. Es muy importante evitar su presencia durante la realización de
la PCR.

La técnica de la PCR se realiza en un termociclador, que permite cambiar rápidamente la

temperatura y mantenerla constante cuando sea necesario, con gran precisión. Se emplean
volúmenes de reacción muy pequeños (10-200 µL), por lo que la cantidad de material de
partida también es muy pequeño.

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2. Procedimiento
La técnica de la PCR consta de varias etapas: una primera etapa de inicio, en la que se
desnaturaliza el ADN, una segunda etapa en la que se realizan múltiples (20-35) ciclos y una
última etapa de extensión final. Cada uno de los ciclos consta de tres partes: desnaturalización,
alineamiento y extensión, cada uno realizado a una temperatura diferente.

¬¬ 1ª etapa: Inicio: se eleva la temperatura hasta 95ºC durante 5 minutos para desnaturalizar
la estructura del ADN. Además puede emplearse para activar a la Taq polimerasa, en
el caso de que se utilice una enzima que lo necesite.

¬¬ 2ª etapa: 20-35 ciclos

• Desnaturalización: se calienta la muestra durante 1 minuto (o más tiempo) a 95ºC

para desnaturalizar el ADN. De esta forma, se separan las dos cadenas.

• Alineamiento o annealing: una vez separadas las hebras del ADN, el cebador se
une a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello se mantiene la
temperatura entre 40-68ºC, durante unos 30 segundos. La temperatura de alinea-
miento generalmente es 3-5ºC menor a la Tm de los cebadores Una vez que se
une el cebador al molde de ADN mediante puentes de hidrógeno, la Taq polimera-
sa se une.

• Extensión o elongación: la Taq polimerasa sintetiza la cadena complementaria

del ADN molde, añadiendo los dNTPs complementarios, en sentido 5’-3’. La tem-
peratura de esta etapa depende de la enzima que se emplee, pero lo habitual es
72ºC. El tiempo de extensión depende de la longitud del fragmento (lo habitual es
que una polimerasa polimerice 1000 bases/minuto).

¬¬ 3ª etapa: Extensión final: después del último ciclo, se mantiene la temperatura a 72ºC
durante unos 10 minutos, lo que permite completar todas las amplificaciones.

Se puede calcular el número teórico de copias que se van a obtener de un fragmento de ADN
concreto, mediante la siguiente fórmula: por cada molécula de ADN obtendremos 2n moléculas
al final de la PCR, siendo n el número de ciclos. Por lo tanto, partiendo de una única molécula
de ADN, en 30 ciclos tendremos 230, es decir más de 1.000 millones de moléculas.

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3. Tipos de PCR
Además de la PCR básica que acabamos de describir, existen otros tipos de PCR como la
RT-PCR, PCR anidada, PCR múltiple, PCR in situ y PCR cuantitativa en tiempo real, entre otros.

3.1 RT-PCR
La RT-PCR es consiste en una retrotranscripción, seguida de una PCR convencional. En este
caso, se parte de ARN, que se retrotranscribe a ADN con la ayuda de una transcriptasa inversa.
Se pueden emplear cebadores específicos para un fragmento determinado. Aunque también, en
el caso de que se quiera retrotranscribir todo el ARN, se pueden emplear cebadores aleatorios
o random primers. Si solamente interesa retrotranscribir el ARNm, como cebadores se usan
oligodT, que se unen a las colas polyA de los ARNm. Una vez que se tiene el ADNc, se emplea
como molde para la PCR convencional.

Existen kits comerciales preparados para realizar la RT-PCR en un solo paso, ya que incorporan
todos los elementos necesarios: transcriptasa inversa, Taq polimerasa y dNTPs, así como los
tampones con las concentraciones de MgCl2 adecuadas para la actividad de las enzimas.

3.2 PCR anidada

En la PCR anidada (nested PCR) se realizan dos amplificaciones de ADN secuencialmente: el
producto de la primera amplificación se emplea como molde para la segunda. Los cebadores
de la segunda amplificación están ubicados dentro de la primera secuencia amplificada.

3.3 PCR múltiple

La PCR múltiple (multiplex PCR) es una variante de la PCR en la que se amplifican simultánea-
mente más de una secuencia. Se emplean dos o más pares de cebadores a la vez.

3.4 PCR in situ

La PCR in situ, como indica su nombre se realiza directamente en un tejido o en células, en
preparaciones fijadas a un portaobjetos. Primero se amplifica el ADN y, posteriormente, se
hibrida con una sonda, de manera que se pueda visualizar el producto de la reacción, en el
lugar donde se produce.

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3.5 PCR cuantitativa en tiempo real

La PCR cuantitativa en tiempo real o qPCR (real time quantitative polymerase chain reaction)
es una variante de la PCR que permite cuantificar el producto de la amplificación del ADN.
En numerosas ocasiones se emplea para cuantificar la expresión de un gen en un tejido o
enfermedad o situación fisiológica determinada. En este caso, se acoplará la reacción de
qPCR a una retrotranscripción del ARNm.

La qPCR emplea, del mismo modo que la PCR convencional, un molde de ADN, al menos un
par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado y una DNA polimerasa
termoestable. Además, se le adiciona un fluorocromo o una sonda específica marcada con
fluorescencia que nos permitirá cuantificar el ADN formado en cada ciclo. El fluorocromo
más empleado es el SYBR Green, que se une de forma inespecífica a las hebras de ADN
bicatenario. Cuando se excita con luz de longitud de onda 488 nm, emite luz verde (522 nm).
Por lo tanto, es necesario emplear un termociclador que tenga sensores que permitan medir
la fluorescencia emitida después de cada ciclo de amplificación.

En lugar de SYBR Green pueden emplearse sondas específicas marcadas con fluorescencia.
Las sondas más empleadas en qPCR son las sondas Light Cycler, las sondas TaqMan, las
sondas Molecular Beacons y las Scorpion (todas ellas marcas comerciales). El fundamento
del uso de las sondas Light Cycler es el FRET (transferencia de energía de resonancia de
Förster): cuando se excita un fluorocromo transfiere su energía a otro cercano, lo que hace
que emita fluorescencia también. Este hecho solo ocurre en el caso de que los dos estén en la
misma molécula. En el caso de las sondas Light Cycler, se emplean dos sondas marcadas con
moléculas fluorescentes, una en posición 5’ y la otra en posición 3’. Estas sondas hibridan en
regiones adyacentes del fragmento de ADN amplificado. Cuando se produce la hibridación, la
primera sonda emite fluorescencia que excita al fluorocromo de la segunda sonda, produciendo
una señal detectable.

Las sondas TaqMan son oligonucleótidos que hibridan específicamente con la parte central
del fragmento del ADN amplificado. Presentan un fluorocromo en un extremo y una molécula
que absorbe la fluorescencia que emite el fluorocromo (quencher) en el otro. La sonda hibrida
con el fragmento de ADN específico, pero debido a la cercanía del fluorocromo al quencher,
no emite fluorescencia. Cuando comienza la amplificación del fragmento, la Taq polimerasa
se encuentra con la sonda y gracias a su actividad 5’-3’ exonucleasa, separa el quencher de
la sonda. Esto hace que se emita fluorescencia.

Las sondas Molecular Beacons son oligonucleótidos de cadena simple, que por su estructura
presentan una zona de apareamiento de bases interna, lo que forma una horquilla. La parte
central de la horquilla es la que tiene una secuencia complementaria al fragmento de ADN
amplificado. Estas sondas presentan un fluorocromo en cada extremo de la molécula. Cuando la
sonda está cerrada en horquilla, el fluoróforo del extremo 3’ impide la emisión de fluorescencia
por parte del fluoróforo del extremo 5’. Sin embargo, cuando se une la sonda al fragmento de
ADN amplificado, se separan la horquilla y se emite fluorescencia. Las sondas Scorpion se

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diferencian de las anteriores en que presentan un cebador específico unido covalentemente

a una horquilla.

Mediante qPCR se puede cuantificar de manera absoluta la producción del fragmento de ADN,
pero lo más habitual es cuantificar la producción del fragmento de forma relativa con la de
otro gen normalizador. Estos genes normalizadores se expresan de forma constitutiva y su
producción no varía (housekeeping genes). De este modo, para cada experimento o condición
se cuantifica la expresión del gen de interés y se divide por la expresión del gen normalizador.
Los genes normalizadores más empleados son GADPH, albúmina y RNA ribosomales.

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4. Aplicaciones de la PCR
Como decíamos al principio de la unidad didáctica, la técnica de la PCR se ha convertido en
una herramienta fundamental en numerosos ámbitos. La PCR se emplea, por ejemplo para:

¬¬ Estudio de la expresión génica

¬¬ Caracterización de enfermedades

¬¬ Diagnóstico etiológico de enfermedades

¬¬ Seguimiento y pronóstico de enfermedades

¬¬ Caracterización genética de individuos, especies, etc...

¬¬ Identificación de individuos

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