UNIVERCIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE

APURÍMAC

“FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA”

CURSO: Microbiología Veterinaria

INFORME DE LA PRÁCTICA 7: Frotis simple

DOCENTE: Dr. Julio Ivan Cruz Colque

ESTUDIANTE: Quispe Rivera Danny Anthony

CODIGO: 221234

CICLO: III

Abancay 22 de enero del 2024

 I. INTRODUCCIÓN
Se denomina tinción al proceso y resultado de teñir y, en el área de la Microbiología
consiste en teñir células o microorganismos. Se trata de una técnica empleada en los
laboratorios con el objeto de optimizar la visión de aquello que se observa a través de un
microscopio, por lo tanto, consiste en aplicar un colorante al material en estudio para
que resulte más simple detectar determinados microorganismos. Las tinciones serán
siempre uno de los aspectos más importantes y el primer paso para la detección de
microorganismos, pues una vez identificadas sus características como morfología
(cocos, bacilos, etc.) y agrupación (tétradas, cadenas, etc.), así como su clasificación
(Gram positivos, Gram negativos, etc.), será posible proceder a realizar las pruebas
bioquímicas pertinentes. Por lo tanto, el primer paso en toda determinación de
microorganismos es realizar una correcta tinción (Lopez, Hernandes, & Colin , 2014).
El frotis es la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo
con objeto de separar lo más posible los microorganismos, ya que si aparecen agrupados
en la preparación es muy difícil obtener una imagen clara y nítida. Este frotis debe ser
posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los métodos
habituales de tinción que permiten la observación al microscopio de las bacterias sin
que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados. La fijación de una extensión
bacteriana hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo
menos posible la morfología bacteriana y las posibles agrupaciones de células que
pudiera haber.
Las tinciones en microbiología son las primeras herramientas que se utilizan en el
laboratorio para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. Desde hace más de un
siglo han ayudado a resolver problemas de etiología microbiana. Hay una gran variedad
de tinciones, que se han ido desarrollando para la detección de los diferentes agentes
infecciosos –en los que se incluyen bacterias, parásitos y hongos–. La tinción de Gram
se considera básica en la valoración inicial de muestras para análisis bacteriológico,
mientras que la tinción de Wright se ocupa para el diagnóstico de enfermedades muy
particulares en el rubro de la parasitología. Hay técnicas tinto riales específicos de gran
utilidad, como la tinción de Ziehl-Neelsen, que se utiliza para el diagnóstico de
enfermedades crónicas como la tuberculosis o la actinomicosis, o la tinción de azul de
lactofenol, que preserva e identifica a los componentes estructurales de los hongos. Las
diferentes tinciones en el laboratorio microbiológico tienen una utilidad fundamental
para el diagnóstico y tratamiento oportuno de múltiples patologías de etiología
infecciosa (Gonsales , Elizalde, Cortes, & Orduña , 2015).

II. OBJETIVOS
 Conocer la correcta utilización de la tinción simple.
 Utilizar la tinción simple en la práctica fijando los microorganismos.
 III. MARCO TEÓRICO

III.1 LA TINCIÓN
Teñir supone una reacción de intercambio de iones del colorante a lugares activos de la
superficie o interior de las estructuras de la célula, esto permitirá contrastar mucho más
el microorganismo con respecto al medio que le rodea. Las tinciones pueden ser:
simples, diferenciales o selectivas.
III.1.1 La naturaleza de los procesos de tinción

a) Tinción mediante procesos físicos

Las fuerzas físicas son sin duda, responsables de la unión entre el colorante y el sustrato
ya que para este proceso es necesario asumir cambios como los de la solución y la
difusión. En algunos de los casos aparentemente simples, los cambios físicos parecen
completamente adecuados para explicar el proceso de tinción real. La acción de los
colorantes grasos se puede explicar fácilmente en términos de propiedades de
solubilidad comunes. Estos colorantes no contienen grupos fuertemente polares y se
espera que se disuelvan en materiales no polares ordinarios de los tipos de lípidos y
“solubles en lípidos”. Cuando el disolvente del colorante y el sustrato no son
completamente miscibles, se establecerá un equilibrio de partición que depende de la
naturaleza del sustrato y disolvente del colorante. El agua, además de ser disolvente
pobre, puede ser importante para transferir el colorante a través de estructuras externas
que contienen agua. Otra posibilidad que involucra una verdadera solución podría ser la
formación de soluciones sólidas. Este tpo de sistema depende de la dispersión uniforme
a nivel molecular de un sólido en otro. Específicamente, el colorante sólido, y la
concentración del colorante dependerá solo de un coeficiente de distribución.
b) Base química de la tinción
Los montajes húmedos simples, que consisten en una gota de solución salina, permiten
la determinación de la composición celular, la morfología y la motilidad. Sin embargo,
el material celular y los organismos generalmente son transparentes y se distinguen
mejor por el uso de tintes o colorantes biológicos. Antonie van Leeuwenhoek fue el
primero en intentar la diferenciación de bacterias con el uso de agentes coloreados
naturales como jugo de remolacha en 1719. Los grupos químicos, el cromóforo y
auxocromo, completan el componente del colorante. Los grupos cromóforos son los
grupos de átomos dentro de una molécula de colorante responsable de su color. El
benceno, un compuesto orgánico aromático, experimenta reacciones de sustitución con
radicales para formar nuevos compuestos que constituyen el sistema de resonancia del
colorante. Algunos de los cambios moleculares resultan en la molécula responsable de
su color. Cuanto mayor sea el número de cromóforos en un compuesto, más profundo
será el color del compuesto. El benceno más que un grupo cromóforo es un cromógeno.
A pesar de que el cromógeno es coloreado y típicamente iónico, no tienen una gran
afinidad por las bacterias o los tejidos, y el lavado o un proceso de retención mecánica
removerá fácilmente el compuesto. Por lo tanto, este grupo no constituye en sí mismo
un colorante. Los colorantes se venden generalmente como sales, por lo tanto, es el
grupo auxocromo el que generalmente determina si un colorante se clasifca como
catiónico (básico) o aniónico (ácido). La mayoría de los colorantes conservarán la
estabilidad de la sustancia y las propiedades catiónicas o aniónicas en todo el pH y, por
lo tanto, teñir de manera confiable aquellas estructuras retenidas que están cargadas de
manera opuesta.
III.2 Realización de la tinción
a) Preparación de muestras
Aunque los microorganismos vivos se pueden examinar directamente con un
microscopio óptico, a menudo se tienen que fijar y teñir para facilitar su observación,
acentuar características morfológicas específicas, y conservarlos para estudios futuros.
b) Extensión de la muestra
Puede prepararse a partir de productos líquidos o sólidos
• Producto sólido: Para la preparación del extendido en el caso de microorganismos
procedentes de cultivos sólidos, puede emplearse un asa estéril o la propia asa de
siembra para transferir una pequeña cantidad del cultivo a la superficie del portaobjetos.
También puede prepararse una suspensión del material en una gota de agua o solución
salina colocada previamente en el portaobjetos, extendiéndola con ayuda del asa.
• Producto líquido: En el caso de microorganismos procedentes de cultivos líquidos,
puede depositarse directamente con pipeta una microgota del medio líquido o introducir
cuidadosamente el asa de siembra en el medio líquido y depositar en el portaobjetos el
líquido que queda adherido.
c) Secado
Se dejará secar el extendido a temperatura ambiente, hasta comprobar, por el cambio de
aspecto de la preparación, que ésta se ha secado.
d) Fijación
Las células teñidas que se observan con un microscopio deben parecerse lo más posible
a las células vivas. Dicho lo anterior, la fijación es el proceso por el cual se conservan y
fijan en su posición las estructuras internas y externas de las células de los
microorganismos. La fijación tiene como objeto la inmovilización de las estructuras del
material a estudiar en un estado lo más próximo posible al estado vivo y esta consiste en
una muerte rápida de los microorganismos, debida a la coagulación de albúminas
protoplasmáticas. En general, provoca un despliegue de proteínas globulares con un
aumento en la exposición de grupos reactivos (principalmente carboxilo, amino,
sulfhídrico). Por lo tanto, el material fijo puede exhibir tanto una mayor capacidad de
tinción como un aumento de la actividad reductora, además se puede usar para cambiar
la afinidad por los colorantes. Inactiva enzimas que podrían alterar la morfología celular
y endurece las estructuras celulares, de manera que no cambian durante la tinción ni la
observación. Además de todo lo anterior mencionado, la fijación es una medida de
seguridad útil y necesaria porque que las bacterias vivas son generalmente
impermeables a muchos de los colorantes utilizados.
1) Calor: La fijación por calor preserva la morfología global pero no las estructuras
intracelulares. Se pasará, varias veces, la parte inferior de la preparación por la llama
azul de un mechero Bunsen hasta que se note caliente al colocarlo en el dorso de la
mano, pero sin que queme. Es importante mencionar que la fijación por medio de calor
ha sido sobrevalorada en su capacidad para matar bacterias y no hace que las
preparaciones de patógenos virulentos sean inocuas para el laboratorista susceptible.
2) Química: La fijación química se utiliza para proteger subestructuras celulares finas y
la morfología de microorganismos más grandes, pero más delicados. Los indicadores
químicos penetran en las células y reaccionan con los componentes celulares,
normalmente proteínas y lípidos, para inactivarlos, solubilizarlos e inmovilizarlos. Se
cubre la preparación con etanol o metanol, se deja actuar durante varios minutos, se
escurre y deja secar.
Cuando se fija una muestra, debe extenderse una película delgada del material que
contiene los microorganismos sobre la superficie del portaobjetos. Si no se realizara la
fijación, el colorante podría arrastrar los microorganismos del portaobjetos cuando se
realizan los lavados.
e) Coloración
Es el proceso de tinción de los microorganismos. Para teñirlos existe un gran número de
productos químicos con propiedades colorantes. Su elección está condicionada al tipo
de tinción a realizar. Utilizando generalmente colorantes básicos en soluciones hidro-
alcohólicas que teñirán componentes celulares ácidos.
1) Azul de algodón de lactofenol
La tinción de azul de algodón de lactofenol, 500 ml Pro-Lab Diagnostics™ se utiliza
para preparar montajes húmedos en el examen microscópico de levaduras y mohos, lo
que actúa como líquido de montaje y tinción
f) Decoloración
Es frecuente, después de una coloración, someter la muestra de tinción a la subsiguiente
decoloración, esto con el fin de diferenciar si las bacterias son o no capaces de perder el
colorante bajo la acción de situaciones drásticas, lo que permitirá diferenciar distintos
grupos bacterianos.
g) Lavado
Es la eliminación del exceso de colorante. Para el lavado se utilizará la piseta, teniendo
la precaución de no dirigir el chorro de agua directamente al frotis. Siempre entre paso y
paso, en una tinción, se debe eliminar el exceso de producto ya sea colorante, mordente
o decolorante, para evitar interferencias entre un producto y otro que podrían inducir a
error.
h) Observación al microscopio
Siempre se empezará por el objetivo de pocos aumentos para comprobar que la muestra
está adecuadamente distribuida y no existen otros elementos, como por ejemplo
cristales, restos de colorantes sin cristalizar, partículas de polvo, etc. Posteriormente se
irá aumentando el objetivo.
III.3 MICROSCOPIO ÓPTCO
El tipo de microscopio más conocido es el microscopio óptico, de luz o de campo claro,
en el que se usan lentes de vidrio para formar la imagen. En general, el microscopio
óptico se usa para observar estructuras internas o detalles de las superficies celulares.

Componentes del microscopio

IV. MATERIALES Y EQUIPOS

 Muestra microbiana
 Lamina portaobjetos
 Mechero bunsen
 Asa de siembra
 Ganchos de madera
 Microscopio óptico compuesto
 Aceite de inmersión
 Tinta genciana o de fijación simple
 Pizeta con agua

V. METODOLOGÍA
Paso 1
El docente encargado de la practica procedió a explicar la aplicaron de la tinción
simple.
Paso 2
Encendió el mechero bunsen y esterilizó el asa de siembra, la cual utilizó para poner
una mínima gota de agua con el asa en mención la cual se puso sobre el porta
objetos.

Paso 3
Con el asa de siembra se procedido a extraer de una de las siembras biológicas una
mínima cantidad de microorganismos, con la ayuda del asa se procedió a
homogenizar.

Paso 4
Se procedió al secado con la ayuda del mechero bunsen se sujeto con un gacho de
madera a la porta objetos a una altura en la cual no se queme se procedido al secado,
posterior al rotulado y continuando se llevó al fijado con la tinta genciana durante un
minuto.

Paso 5
Se procedió al lavado con la ayuda de una piceta toda la tinta agregada.

Paso 6
Se procedió a agregar aceite de inmersión y posterior a esto se llevó a la observación
en microscopio a un objetivo de 100x.

VI. RESULTADOS

Estafilococo Estafilococo

VII. CONCLUSIÓN
 Se conoció la correcta utilización de la tinción simple desde los primeros pasos
para teñir como la esterilización del asa de siembra la homogenización,
coloración y lavado hasta su observación.
 Utilizamos dicha técnica la cual se ve en los resultados obtenidos.
VII.

Bibliografía
Gonsales , R., Elizalde, b., Cortes, M., & Orduña , M. (2015). Las tinciones basicas del
laboratorio de microbiologia enfoque grafico. Zaragosa.

Lopez, E., Hernandes, M., & Colin , C. (2014). Las tinciones basicas en ellaboratorio .
Investigacion en Discapacidad.