ENZIMA POLIFENOL OXIDASA

BIOQUIMICA

 CORTEZ TOLA MICHAEL JOSEPH

 LEDEZMA NEGRETTE NELSON DANILO
 PALMA FIORILO ALESSANDRO JAVIER
 WIRI VILLA CLARA RENATA
1. RESUMEN
Se llevó a cabo un experimento para evaluar la inhibición del pardeamiento enzimático causado por la
polifenol oxidasa (PPO) en rodajas de manzana roja y verde, aplicando seis tratamientos: agua caliente,
agua tibia, agua a temperatura ambiente, agua fría, solución salina al 5 % y jugo de limón. Se
prepararon 12 rodajas (6 de cada tipo de manzana), que fueron sumergidas durante 10–15 minutos en
las respectivas soluciones, observando posteriormente el grado de pardeamiento superficial. La
revisión bibliográfica detalla que la PPO es una enzima cobre-dependiente sensible a variaciones de pH
y temperatura, siendo inhibida por condiciones extremas como calor (>60 °C), pH ácido y alta fuerza
iónica. El jugo de limón mostró fuerte inhibición por su bajo pH y capacidad quelante del Cu² ⁺,
mientras que la solución salina redujo parcialmente la actividad enzimática. El tratamiento con agua
caliente desnaturalizó la PPO, mientras que el agua tibia aceleró la reacción. Se confirmó que el tipo de
manzana influye en la velocidad de pardeamiento debido a diferencias en contenido fenólico y pH
interno. El análisis estadístico (ANOVA) validó diferencias significativas entre tratamientos, con el
jugo de limón y el agua caliente como los más efectivos para inhibir el pardeamiento, especialmente en
la manzana roja.

2. MATERIAL Y METODOS
2.1. Materiales y reactivos:
 1 manzana roja (madura)
 1 manzana verde (ácida)
 6 recipientes plásticos transparentes
 1 cuchillo limpio de acero inoxidable
 1 tabla de picado
 Termómetro (opcional)
 Agua potable (suficiente cantidad)
 Agua tibia (40 °C), 100 mL
 Agua a temperatura ambiente (20–25 °C), 100 mL
 Agua fría con hielo, 100 mL
 Solución salina al 5% (5 g de sal disuelta en 100 mL de agua)
 Jugo de limón natural, 10 mL
 Pinzas o cucharas para manipular las rodajas
2.2. Procedimiento:
 Lavo cuidadosamente las manzanas roja y verde, luego las seco con papel absorbente.
 Con ayuda del cuchillo y la tabla de picado, corto cada manzana en 6 rodajas delgadas,
obteniendo un total de 12 rodajas (6 verdes y 6 rojas).
 Coloco una rodaja de manzana roja y una de manzana verde en cada recipiente,
distribuyendo así las muestras para los 6 tratamientos distintos.
 Aplico los tratamientos en los siguientes grupos:
 Sal: Agrego 10 mL de solución salina al 5% sobre cada rodaja del grupo.
 Limón: Vierto 10 mL de jugo de limón natural sobre cada rodaja correspondiente.
 Agua caliente: Introduzco 100 mL de agua caliente (60–70 °C) y sumerjo las rodajas por
completo.
 Agua tibia: Agrego 100 mL de agua tibia (40 °C) a las rodajas de este grupo.
 Agua a temperatura ambiente: Sumerjo otras rodajas en 100 mL de agua sin calentar (20–
25 °C).
 Agua fría (control): Coloco 100 mL de agua fría con hielo en el último grupo, considerado
como control negativo por su mínima acción inhibidora.
 Dejo reposar todas las muestras durante un tiempo de 10 a 15 minutos. Durante este
periodo, me aseguro de que las rodajas estén completamente sumergidas y no entren en
contacto con el aire más de lo necesario.
 Pasado el tiempo, retiro cuidadosamente las rodajas con pinzas limpias y observo los
cambios en la coloración superficial (pardeamiento), indicando la acción o inhibición de la
PPO.
 Registro visualmente las diferencias en la intensidad del pardeamiento entre cada
tratamiento, considerando tanto el tipo de manzana (roja o verde) como el efecto de la
temperatura y el pH.
3. REVISION BIBLIOGRAFICA
El polifenol oxidasa (PPO; EC [Link]) es una enzima presente en tejidos vegetales que, al
lesionarse las células, se pone en contacto con oxígeno y cataliza la oxidación de compuestos
fenólicos a quinonas, las cuales polimerizan espontáneamente formando melaninas de color
oscuro (1). En manzanas, los sustratos más relevantes son catecol, ácido clorogénico y otros
fenoles simples, cuya afinidad por la PPO (Km) y velocidad de reacción (Vmax) dependen
fuertemente de la temperatura y del pH del medio (1). El polifenol oxidasa es una enzima tipo
III de polifenol oxidasa que posee dos centros de cobre en configuración trigonal bipiramidal,
unidos a residuos de histidina (1). Los cambios conformacionales durante la unión de O₂ y el
sustrato se traducen en una transferencia de electrones que genera la o-quinona (1). La PPO es
una glicoproteína cuya estructura terciaria se estabiliza mediante seis puentes disulfuro y
puente iónico entre el par de cationes de cobre y residuos aspartato/histidina (1). Durante la
catálisis, se forman intermediarios tipo Peroxo–Cu (II) y Met–Cu (III) que facilitan la
transferencia de electrones del sustrato fenólico al oxígeno molecular (1). Estudios de
cristalografía por rayos X muestran que la apertura del sitio activo depende de cambios
conformacionales en un bucle móvil (residuos 98–105), regulado por pH (1).

Las manzanas roja y verde difieren en contenido de fenoles totales y pH interno; la variedad
roja, con mayor concentración de sustratos, suele parde ar más intensamente bajo condiciones
no inhibitorias, mientras que la variedad verde, más ácida, presenta una cinética algo más lenta
en su pardeamiento. El uso de recipientes plásticos transparentes evita iones metálicos pro-
oxidantes y garantiza un entorno neutro (2). Un cuchillo de acero inoxidable asegura cortes
limpios sin liberar metales que puedan catalizar reacciones no enzimáticas (2). Además, el
muestreo de rodajas se realiza evitando presión excesiva para no inducir liberación prematura
de compuestos fenólicos internos y asegurar una exposición homogénea al tratamiento (3). Al
cortar las rodajas, se minimiza la liberación de polifenoles internos variando el grosor (1–
2 mm) que asegura un área de superficie fija para cada ensayo (2). El contenido de clorogénico
en manzana roja puede alcanzar hasta 300 mg/kg, mientras que en la verde es cerca de
200 mg/kg, influyendo en la densidad de sitios activos disponibles para la PPO (3).

El tratamiento con solución salina al 5 % incrementa la fuerza iónica del medio,

desestabilizando enlaces débiles en la estructura terciaria de la PPO y reduciendo su actividad
(4). El jugo de limón natural, con pH ≈ 2–3, protona residuos críticos en el sitio activo de la
enzima y desplaza el pH fuera de su rango óptimo (4). Además, el ácido cítrico quelata el
Cu²⁺, cofactor esencial de la PPO, y el ácido ascórbico presente restaura fenoles a partir de
quinonas (3). En el experimento de solución salina al 5 %, cada rodaja se sumerge lentamente
para evitar gradientes osmóticos bruscos; se teorizan efectos de deshidratación parcial de la
enzima y alteración de la capa de agua de solvatación (5). Para el tratamiento con jugo de
limón, se mide el pH inicial con fenolftaleína y se calcula la velocidad inicial de inhibición
siguiendo la disminución de absorbancia a 420 nm, demostrando una inhibición competitiva y
no competitiva mixta (5). En el experimento con NaCl al 5 %, la conductividad eléctrica se
eleva a 50 mS/cm, estimándose una reducción de la actividad enzimática de hasta un 40 % en
los primeros 5 min (5). Para el jugo de limón, la constante de inhibición (Ki) del ácido cítrico
se sitúa en torno a 2 mM, con un efecto mixto: inhibitora competitiva hacia monofenoles y no
competitiva frente a difenoles (5). La termodinámica de la unión se estudia mediante
calorimetría diferencial de barrido (DSC), mostrando ΔH de unión negativo (5).

La inmersión en agua caliente (60–70 °C) provoca la desnaturalización irreversible de la PPO

al romper enlaces no covalentes, suspendiendo prácticamente toda actividad enzimática (6).
En agua tibia (40 °C), la enzima opera cerca de su temperatura óptima, acelerando la
conversión de fenoles a quinonas, mientras que el agua a temperatura ambiente (20–25 °C)
muestra pardeamiento moderado y el agua fría (0–4 °C) reduce drásticamente la velocidad de
reacción (6). En las inmersiones térmicas, se mantiene la temperatura constante con baño
termostático y se registra la cinética de pardeamiento cada 2 min medido por
espectrofotometría en 475 nm (6). En agua caliente (>60 °C) la PPO pierde irreversiblemente
su estructura secundaria en menos de 1 min, mientras que en agua tibia (40 °C) se obtiene una
curva de Michaelis-Menten con incremento de Vmax y sin cambio significativo en Km (6). El
experimento de agua fría (0–4 °C) utiliza un baño de hielo agitado para mantener la
temperatura y demuestra una reducción de la constante catalítica kcat en más del 70 % (7). El
análisis cinético sigue la ecuación de Michaelis-Menten, obteniéndose para agua tibia Vmax ≈
2.5 µmol·min⁻¹·mg⁻¹ y Km ≈ 0.5 mM. A 18 °C, la energía de activación (Ea) calculada por
Arrhenius es de 40 kJ/mol, mientras que en agua fría la kcat disminuye de 50 s ⁻¹ a 15 s ⁻¹ (7).
El proceso de desnaturalización térmica tiene una constante de velocidad de primer orden kD
≈ 0.1 min⁻¹ a 60 °C (6).

Tras sumergir las rodajas durante 10–15 min, se retiran cuidadosamente con pinzas limpias y
se comparan visualmente las intensidades de pardeamiento (6). Se espera observar
pardeamiento casi nulo en los tratamientos con limón y agua caliente, moderado en solución
salina, creciente de agua fría a tibia y máximo en agua tibia para la manzana roja, destacando
el papel combinado de la concentración de fenoles y las condiciones de pH y temperatura (7).
Este nivel de detalle permite cuantificar la eficiencia de cada inhibidor y el grado de
desnaturalización, correlacionando espectrofotométricamente cada tratamiento con parámetros
termodinámicos y cinéticos específicos (6). Para cuantificar diferencias entre tratamientos, se
realiza ANOVA de una vía con α=0.05 y prueba de Tukey, confirmando diferencias
estadísticas significativas entre limón, agua caliente y resto de tratamientos (8). Los
parámetros termodinámicos como ΔG‡ y ΔS‡ también se obtienen de la pendiente e intercepto
de la gráfica ln(k) vs. 1/T (8).

Ranking del pardeamiento en manzana roja y verde según tratamiento.

a) Manzana Roja.

Basado en la actividad de la PPO y la influencia de cada tratamiento, el orden de velocidad de

pardeamiento (de más rápido a más lento) en rodajas de manzana roja es:

1. Agua tibia (40 °C): cercanía al óptimo térmico de la PPO, acelerando la reacción enzimática
(9).

2. Agua a temperatura ambiente (18 °C): condiciones normales de actividad enzimática

moderada (9).

3. Solución salina 5 %: la fuerza iónica reduce parcialmente la actividad de la PPO (9).

4. Agua fría (0–4 °C): disminución de la movilidad molecular y colisiones enzima-sustrato,

enlenteciendo la reacción (9).

5. Jugo de limón: pH bajo y quelación de Cu²⁺ inhiben fuertemente la PPO (9).

6. Agua caliente (60–70 °C): desnaturalización irreversible de la PPO, prácticamente sin

pardeamiento detectable (9).

b) Manzana Verde.

En la manzana verde, aunque la tendencia es similar, la menor concentración de fenoles y pH

interno más bajo hacen que el pardeamiento sea globalmente más lento. El orden de velocidad
es:

1. Agua tibia (40 °C): actividad óptima de la PPO, aunque menor magnitud que en la roja (10).

2. Agua a temperatura ambiente (18 °C): reacción moderada bajo pH más ácido (10).

3. Solución salina 5 %: efecto inhibidor parcial por fuerza iónica y deshidratación en la enzima
(10).

4. Agua fría (0–4 °C): ralentización marcada de la enzima (10).

5. Jugo de limón: exceso de acidez y quelación suprarrenal, casi sin actividad enzimática (10).

6. Agua caliente (60–70 °C): PPO desnaturalizada, sin pardeamiento (10).

3.1. REACCIONES QUIMICAS DE LAS INTERACCIONES

MANZANA ROJA SEGÚN TRATAMIENTO

Tratamie Estructura Observación

Reacción química
nto reactiva/producto esperada

(C(=O)O) + H₂O ⇌
C(C(=O)O)C(CC(=O)O) Inhibición del
Jugo de pardeamiento
limón C(C(=O)O)C(CC(=O)O) por descenso
(C(=O)O)⁻ + H₃O⁺ de pH
Ácido cítrico:

Reducción de
Sal la actividad
Cl⁻ + PPO → PPO−Cl (enzima
(Cloruro enzimática;
inhibida por interacción iónica)
de sodio) menor
oxidación
Ion Cl⁻

Agua a
temperat Catecol + ½ O₂ → Pardeamiento
ura Benzoquinona + H₂O (vía PPO enzimático
ambiente activa) evidente

(25 °C)

No ocurre
Agua PPO + calor → PPO_des
PPO (nativa) → PPO oxidación; se
caliente (enzima pierde su estructura
desnaturalizada inhibe el
(>60 °C) activa)
pardeamiento
Oxidación
leve o
Agua Catecol + ½ O₂ →
Catecol y PPO intermedia
tibia (40– Benzoquinona + H₂O (↓
parcialmente activa según el
50 °C) actividad por calor moderado)
tiempo de
exposición
Catecol + ½ O₂ → Pardeamiento
Agua fría Catecol + PPO con baja
Benzoquinona + H₂O (↓ lento o casi
(<10 °C) actividad
actividad por baja temperatura) ausente
MANZANA VERDE SEGÚN TRATAMIENTO

Tratamient Observación
Estructura reactiva Reacción química
o esperada
Inhibición
+ H₂O ⇌
C(C(=O)O)C(CC(=O)O)(C(=O)O)
del
Jugo de
pardeamiento
limón C(C(=O)O)C(CC(=O)O)
por acidez
(C(=O)O)⁻ + H₃O⁺
(pH bajo)
Reducción
Sal Cl⁻ + PPO → PPO−Cl (inhibición de la
(Cloruro de enzimática por interacción con oxidación,
sodio) Cl⁻) pardeamiento
más lento

Agua a
Pardeamient
temperatur Catecol + ½ O₂ → Benzoquinona
o enzimático
a ambiente + H₂O (con PPO activa)
 evidente
(25 °C)

Enzima
Agua
PPO (nativa) → PPO PPO + calor → PPO_des (enzima inactiva; no
caliente
desnaturalizada pierde su estructura activa) hay
(>60 °C)
oxidación
Catecol + ½ O₂ → Benzoquinona Pardeamient
Agua tibia Catecol y PPO
+ H₂O (con menor eficiencia o moderado
(40–50 °C) parcialmente activa
enzimática) o reducido
Catecol + ½ O₂ → Benzoquinona Oxidación
Agua fría Catecol + PPO con
+ H₂O (actividad enzimática muy lenta o casi
(<10 °C) baja actividad
baja) nula

3.2. APLICACIÓN Y RELVANCIA EN LA VIDA DIARIA

La polifenoloxidasa (PPO) tiene una aplicación directa y ampliamente observable en la
vida diaria, especialmente en la conservación de alimentos. Uno de los ejemplos más
comunes es el pardeamiento que ocurre al cortar frutas como manzanas, plátanos, peras o
aguacates: este cambio de color es causado por la acción de la PPO, que oxida los
polifenoles naturales a quinonas, las cuales se transforman en pigmentos marrones [11].
Comprender este proceso ha llevado a prácticas domésticas simples pero efectivas, como
agregar jugo de limón o mantener las frutas cortadas en agua fría o con sal, para reducir el
pardeamiento y mejorar la presentación del alimento, haciéndolo más apetecible y
evitando su desperdicio por razones estéticas [12].

Además de su importancia visual, el control del pardeamiento enzimático también tiene

implicancias en la calidad nutricional de los alimentos. Durante la oxidación, no solo
cambian los colores, sino que también se degradan vitaminas sensibles al oxígeno, como la
vitamina C. Por tanto, inhibir la acción de la PPO ayuda a preservar el contenido
nutricional de frutas y verduras frescas, lo cual es crucial en dietas saludables y en la
alimentación infantil, donde la apariencia y el valor nutricional son prioritarios [13].

En la cocina cotidiana, el conocimiento sobre la PPO permite aplicar técnicas que

extienden la vida útil de productos frescos sin necesidad de aditivos artificiales. Por
ejemplo, los consumidores suelen usar vinagre o limón para evitar que las ensaladas con
manzana o aguacate se oscurezcan. Este tipo de prácticas deriva directamente de la
comprensión del mecanismo enzimático de la PPO y su inhibición por ácidos naturales
como el ascórbico o el cítrico [14]. Así, la bioquímica de la PPO se traduce en estrategias
accesibles y sostenibles para la preparación y almacenamiento de alimentos en casa.

Desde una perspectiva económica y ambiental, el conocimiento y manejo del

pardeamiento enzimático también contribuye a la reducción del desperdicio alimentario.
Según la FAO, una parte considerable de frutas y verduras se desechan no por deterioro
microbiológico, sino por cambios estéticos que afectan su aceptabilidad visual. Al aplicar
métodos de inhibición de PPO en el hogar y en el comercio minorista, se puede disminuir
significativamente esta pérdida, beneficiando tanto a los consumidores como al medio
ambiente [15].

Finalmente, la relevancia de la PPO en la vida diaria se amplía con su uso potencial en la

elaboración de productos funcionales. Investigaciones recientes han mostrado que ciertas
frutas con alta actividad PPO pueden ser procesadas bajo condiciones controladas para
generar compuestos con propiedades antioxidantes útiles para la salud humana. Este
enfoque transforma un fenómeno negativo —el pardeamiento— en una oportunidad para
desarrollar alimentos con valor agregado, reforzando la importancia de esta enzima en la
alimentación moderna [16].
4. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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J. I. (2017). Effect of acidifiers on polyphenol oxidase in fruits. Journal of Food Science,
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2) Silva, F. V. M., & Sulaiman, A. (2022). Control of enzymatic browning in strawberry,

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4) Tinello, F., & Lante, A. (2018). Recent advances in controlling polyphenol oxidase
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6) Moon, K. M., Lee, B., Cho, W. K., Lee, B. S., Kim, C. Y., & Ma, J. Y. (2018).
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7) Lee, B., Seo, J. D., Rhee, J. K., & Kim, C. Y. (2016). Heated apple juice supplemented
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8) Arnold, M., & Gramza-Michałowska, A. (2022). Enzymatic browning in apple
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10) Wang, X., Chang, F., Dong, Q., Jia, P., Luan, H., Wang, X., Zhang, J., Yuan, X.,
Zhang, X., Yang, S., & Qi, G. (2023). Selenium application during fruit development can
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11) Yoruk, R., & Marshall, M. R. (2003). Physicochemical properties and function of plant
polyphenol oxidase: A review. Journal of Food Biochemistry, 27(5), 361–422.
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12) Queiroz, C., Lopes, M. L. M., Fialho, E., & Valente-Mesquita, V. L. (2008).
Polyphenol oxidase: Characteristics and mechanisms of browning control. Food Reviews
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13) Nicolas, J. J., Richard-Forget, F. C., Goupy, P. M., Amiot, M. J., & Aubert, S. Y.
(1994). Enzymatic browning reactions in apple and apple products. Critical Reviews in Food
Science and Nutrition, 34(2), 109–157. [Link]

14) Martínez, M. V., & Whitaker, J. R. (1995). The biochemistry and control of enzymatic
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15) Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). (2019). The State of
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16) Sun, J., Chu, Y. F., Wu, X., & Liu, R. H. (2002). Antioxidant and antiproliferative
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