TECNICAS BÁSICAS DE BIOANALISIS
CICLO ESCOLAR 2026-2026
REPORTE DE LA TÉCNICA N°3
1.-RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR.
2.-DR. EN C. FERNANDO MEJÍA ZÁRATE.
3.-FUNDAMENTO:
La técnica de espectroscopia de resonancia magnética nuclear fue establecida a finales de la
década de 1940 con el objetivo de investigar los núcleos atómicos. En el año 1951, los
científicos químicos encontraron que esta técnica podía servir para identificar las
estructuras de los compuestos orgánicos. Este método espectroscópico es aplicable
únicamente a los núcleos atómicos que poseen un número impar de protones o neutrones (o
de ambos tipos). Este fenómeno ocurre en los átomos de hidrógeno 1H, carbono 13C, flúor
19F y fósforo 31P. Los núcleos de este tipo son activos magnéticamente, lo que significa
que cuentan con espín, al igual que los electrones, ya que estos núcleos tienen carga
positiva y llevan a cabo un movimiento rotacional en torno a un eje, comportándose, así
como pequeños imanes.
En ausencia de un campo magnético, los espines nucleares se distribuyen de manera
aleatoria. No obstante, cuando una muestra se encuentra en un campo magnético, los
núcleos con espín positivo se alinean en la misma dirección que el campo, alcanzando un
estado de menor energía conocido como estado de espín α, mientras que aquellos con espín
negativo se alinean en sentido contrario al campo magnético, en un estado de mayor
energía denominado estado de espín β.
Figura N°1 estados de espín.
La diferencia de energía entre los dos estados de espín α y β, depende de la fuerza del
campo magnético aplicado H0. Cuanto mayor sea el campo magnético, mayor diferencia
energética habrá entre los dos estados de espín.
estado de
estado de
Figura N°2 Gráfica se representa el aumento de la diferencia energética entre los estados de
espín con el aumento de la fuerza del campo magnético.
Cuando una muestra que contiene un compuesto orgánico es expuesta brevemente a un
pulso fuerte de radiación, los núcleos en el estado de espín α son elevados al estado de
espín β. Esta radiación se sitúa en la zona de las radiofrecuencias (rf) del espectro
electromagnético, por lo que se le atribuye el nombre de radiación rf. Al regresar los
núcleos a su estado original, emiten señales cuya frecuencia está relacionada con la
diferencia de energía (ΔE) entre los estados de espín α y β. El espectrómetro de RMN es el
dispositivo que capta estas señales y las convierte en un gráfico de frecuencias contra
intensidad, conocido como espectro de RMN. La expresión resonancia magnética nuclear
proviene del hecho de que los núcleos resuenan con la radiofrecuencia o radiación rf.
El valor del
radio giromagnético depende del tipo de núcleo que se está irradiando; en el caso del 1H es
de 2.675 x 108 T-1s-1. Si espectrómetro de RMN posee un imán potente, éste debe trabajar
a una mayor frecuencia puesto que el campo magnético es proporcional a dicha frecuencia.
Así, por ejemplo, un campo magnético de 14.092 T requiere una frecuencia de trabajo de
600 MHz.
Hoy en día los espectrómetros de RMN trabajan a 200,300, 400, 500 y 600 MHz.
Figura N°3 Componentes de un equipo para medidas de resonancia magnética nuclear.
£ Un imán estable, con un controlador que produce un campo magnético preciso.
£ Un transmisor de radiofrecuencias, capaz de emitir frecuencias precisas.
£ Un detector para medir la absorción de energía de radiofrecuencia de la muestra.
£ Un ordenador y un registrador para realizar las gráficas que constituyen el espectro
de RMN.
Figura 4.-Imagen del Laboratorio Universitario de Resonancia Magnética Nuclear.
Resonancia magnética nuclear de 1H. Apantallamiento o protección magnética por los
electrones.
Hasta ahora, se ha explicado la idea de resonancia de un núcleo aislado en un campo
magnético, pero en realidad, los núcleos, como los protones o los carbonos que componen
las moléculas orgánicas, no están solos, ya que son rodeados por electrones que los
resguardan parcialmente del campo magnético externo que los afecta. Esos electrones se
desplazan, creando un pequeño campo magnético inducido que contrarresta el campo
magnético externo.
En cualquier molécula, la nube de electrones que rodea cada núcleo funciona como una
corriente eléctrica en movimiento que, al reaccionar al campo magnético externo, produce
una pequeña corriente inducida que está en oposición a dicho campo. Como consecuencia
de esto, el campo magnético que realmente alcanza al núcleo es menos intenso que el
campo externo, por lo que se dice que el núcleo está protegido o apantallado. Esta
protección es de gran relevancia desde el punto de vista experimental, ya que el campo
magnético efectivo que siente un protón dentro de una molécula es siempre inferior al
campo externo, lo que significa que para que el núcleo resuene, el campo externo debe ser
mayor.
Hef = H0 – Hloc
Por ejemplo, en el metanol el átomo de oxígeno retira densidad electrónica del entorno
electrónico que rodea al protón del grupo hidroxilo, quedando este átomo de hidrógeno
menos protegido que los protones del grupo metilo. La consecuencia es que el protón del
grupo hidroxilo resuena a un campo magnético menor que los protones del grupo metilo.
Las variaciones en las frecuencias de absorción de resonancia magnética nuclear, que tienen
lugar debido al distinto apantallamiento de los núcleos, reciben el nombre de
desplazamientos químicos (unidades δ ó ppm).
Modelo de Larmor
Los átomos que componen la materia están formados por un núcleo y electrones. Al
explicar el fenómeno de la resonancia magnética nuclear, vamos a enfocarnos en el núcleo
del átomo. Cada núcleo se distingue por su masa, su carga eléctrica, su reacción con
campos magnéticos externos y su espín.
Las dos últimas propiedades son fundamentales en el análisis del fenómeno que da origen a
la resonancia magnética nuclear.
El momento magnético, 𝜇⃗, de un núcleo proviene de su espín nuclear, 𝐼⃗. Es importante
mencionar que el espín nuclear no se genera por la rotación del núcleo, sino que es una
propiedad inherente a la partícula en sí. No obstante, se puede considerar el espín como una
modalidad de momento angular. Por lo tanto, el momento magnético de un núcleo es:
𝜇⃗ = 𝛾𝐼⃗ Ecu. 1
La constante 𝛾, conocida como constante giromagnética, es específica de cada tipo de
núcleo.
Cuando hay un campo magnético externo, 𝐵(⃗, el momento magnético sufre un movimiento
rotativo llamado "precesión".
Figura 5. Movimientos de precesión de un momento angular nuclear alrededor de un campo
magnético y de un trompo girando en el campo gravitatorio.
La frecuencia de precesión del momento angular es conocida como la frecuencia de Larmor,
𝜔𝐿 [rad/s], y es directamente proporcional a la intensidad del campo magnético externo:
𝜔𝐿 = 𝛾𝐵 Ec. 3
La frecuencia de Larmor en Hz se calcula como:
En la siguiente tabla se presentan los valores de la constante giromagnética de algunos núcleos:
Núcleo Abundancia natural [%] I 𝜸⁄𝟐𝝅 [MHz/T]
1H
99.98 1/2 42.58
2H
0.015 1 6.53
7
Li 92.6 3/2 16.5
13C
1.11 1/2 10.71
14N
99.6 1 3.1
15N
0.36 1/2 -4.3
31P
100 1/2 17.23
Usando la Ec. 4, y los datos de la tabla anterior, para un protón (núcleo de 1H) en un campo de 9.4
T, la frecuencia de Larmor es de 400 MHz.
Los núcleos con espín I=0, tales como 12C y 16O, no son activos en la espectroscopía RMN.
Resonancia y apantallamiento
De acuerdo a la mecánica cuántica, un núcleo con espín I tiene 2I+1 posibles orientaciones y
números cuánticos magnéticos m que van desde -I hasta +I en incrementos de [Link]í, para un
núcleo con I=1/2 se tienen dos posibles números cuánticos magnéticos: m=-1/2 y m=+1/2.
Como consecuencia de lo anterior, existen dos niveles de energía para núcleos con espín I=1/2
inmersos en un campo magnético (Figura 2). La diferencia de energía entre dichos niveles resulta
estar relacionada con su frecuencia de Larmor:
Figura 6. Niveles de energía para un núcleo con espín I=1/2, en presencia y en ausencia de un
campo magnético externo.
los núcleos con radiación electrómagnética de frecuencia 𝜈1 de forma que:
En un experimento de RMN las transiciones entre los niveles energéticos son inducidas al irradiar
Es decir, que 𝜈1 = 𝜈𝐿 que puede considerarse como una condición de resonancia, dado que para
que ocurra la transición energética, la frecuencia de la radiación electromagnética externa es igual
a la frecuencia de Larmor.
Continuando con el ejemplo de un protón inmerso en un campo de 9.4 T, si se quisiera inducir una
transición del nivel marcado como m = +1/2 al nivel m = -1/2, dicho protón debería irradiarse con
radiación electromagnética de 400 MHz. Notar que este valor corresponde a la región de las
radiofrecuencias en el espectro electromagnético.
Se debe notar que en una molécula, los núcleos no se encuentran aislados y cada uno de ellos
tiene, de hecho, su propia frecuencia de resonancia. Es decir, cada núcleo tiene una frecuencia de
Larmor particular. Si nos centramos en núcleos de 1H, es evidente que todos tienen la misma
variar la intensidad del campo magnético 𝐵. Por lo que es más conveniente hablar de un campo
constante giromagnética, por lo que para cambiar la frecuencia de Larmor, necesariamente debe
magnético efectivo 𝐵𝑒𝑓:
𝐵𝑒𝑓 = 𝐵 − 𝐵: = 𝐵 − 𝜎𝐵 = (1 − 𝜎)𝐵 Ec. 7
campo magnético externo, a través de un parámetro adimensional 𝜎 llamado ‘constante de
Es decir, el campo magnético efectivo que experimenta un núcleo en una molécula es menor al
apantallamiento’. Esta relación se puede explicar al considerar a los electrones que rodean a los
núcleos que crean su propio campo electromagnético que se opone al campo magnético externo.
La consecuencia de este apantallamiento se verá más adelante al tratar los corrimientos químicos y
la formación del espectro RMN.
Mecanismos de relajamiento
Desde un punto de vista macroscópico y descriptivo, se habla de la magnetización nuclear (Mo)
que resulta de la suma vectorial de todos los momentos magnéticos del conjunto de núcleos
similares en una muestra que resulta del pequeño exceso de población en el nivel de energía m =
+1/2.
Figura 7. Magnetización neta Mo.
irradiar la muestra con radiación electromagnética de frecuencia 𝜈1. Si esto ocurre de tal forma
Ya se ha mencionado que, para inducir la transición de un nivel energético a otro, es necesario
que su componente de campo magnético 𝐵1 es ortogonal al campo magnético externo, esto trae
también una rotación de Mo alrededor del eje del campo magnético 𝐵1, tal como se muestra en la
una consecuencia cuando se trabaja desde el punto de vista de la magnetización neta: se induce
Figura 4, donde se muestra un caso particular donde la rotación fue de 90º.
Figura 8. Rotación del vector de magnetización Mo como efecto de la aplicación de una radiación
electromagnética. Ejemplo de una rotación de 90º.
Bajo el modelo vectorial, una vez que se ha dejado de aplicar el campo 𝐵1, el vector de
magnetización volverá a su posición original de equilibrio. Esto ocurre a través de dos procesos
conocidos como relajación longitudinal y relajación transversal.
La relajación longitudinal, o relajación espín-red, tiene su origen en interacciones entre los núcleos
y el ambiente. El término ‘longitudinal’ se refiere a que la magnetización se va recuperando en la
misma dirección que el campo magnético externo. Este proceso está caracterizado por una
constante de tiempo T1.
La relajación transversal, o relajación espín-espín, está caracterizada por la constante de tiempo
T2. El término ‘transversal’ se refiere a la magnetización perpendicular al campo magnético
externo. Desde el punto de vista vectorial, la magnetización transversal precisa en un plano
perpendicular al eje del campo magnético externo con una frecuencia igual a la frecuencia de
Larmor.
En la Figura 5 se representan los dos procesos de relajación. Se puede intuir que mientras que la
magnetización total precisa, la magnetización en el eje z va aumentando y la magnetización a lo
largo de los ejes x y y va disminuyendo.
Figura 9. Relajación de la magnetización.
4.-Aplicaciones de la técnica mencionadas en clases.
Síntesis y caractizacion de moléculas organicas
Caracterización de proteínas y aminoácidos.
Caracterización de fármacos.
5.- Descripción de 3 aplicaciones adicionales de la técnica investigada por el estudiante.
A) Caracterización de extractos naturales.
Las bioceras derivadas del aceite de palma son candidatas prometedoras para matrices
cosméticas y productos farmacéuticos de uso humano.
Autores: Chaparro, L.M.; Neira, L.F.; Molina, D.; Rivera-Barrera, D.; Castañeda, M.; López-Giraldo,
L.J.; Escobar, P Materials 2023, 16, 4402. [Link]
El aceite obtenido de la palma Elaeis guineensis ha servido como sustrato para la obtención de
compuestos cerosos (bioceras) de composición similar a la cera de abejas, la cera de carnauba y el
espermaceti, y posee propiedades beneficiosas (como emolientes, emulsionantes y biológicas)
para su uso en las industrias cosmética, farmacéutica y alimentaria. Mediante el hidrotratamiento
catalítico del aceite de palma refinado, se han podido obtener bioceras compuestas por ésteres
cerosos como el hexadecanoato de hexadecanoilo (palmitato de cetilo, C32H64O2) y el
octadecanoato de octadecilo (estearato de estearilo, C36H72O2), además de hidrocarburos,
alcoholes grasos (octadecanol, C18H38O, y hexadecanol, C16H34O), ácidos grasos y pequeñas
cantidades de tri-, di- y monoglicéridos. Algunas ceras naturales, como la de carnauba, la de abeja
y la de candelilla, son materiales biocompatibles (inertes) y no tóxicos que la Administración de
Alimentos y Medicamentos (FDA) ha reconocido generalmente como seguros (GRAS) para su uso
como aditivos alimentarios y como componentes de cosméticos y productos farmacéuticos. Son
candidatas prometedoras para el desarrollo de partículas como sistemas de administración de
fármacos, para sustituir grasas sólidas por oleogeles en ciertos productos alimenticios (crema de
chocolate y tipos de mantequilla) y como componente de nanotransportadores lipídicos en
cosméticos. Existen organismos que revisan y evalúan periódicamente la seguridad de las ceras (o
sus componentes principales, es decir, los ésteres cerosos) para el consumo humano, y algunas
pruebas generan advertencias sobre los riesgos (eco)toxicológicos que presentan. Esto debe
tenerse en cuenta antes de la fabricación de productos. Se sabe que los ácidos grasos derivados
del aceite de palma son seguros, al igual que ciertos ésteres de ácidos grasos producidos con ácido
palmítico o esteárico y alcohol, y los paneles de expertos de la Revisión de Ingredientes Cosméticos
(CIR, por sus siglas en inglés) los han considerado aptos para su uso en cosméticos. Sin embargo,
para determinar que otras bioceras son componentes seguros en cosméticos o medicamentos, es
importante asegurarse de que no produzcan reacciones adversas como irritación, eccema o
dermatitis alérgica de contacto.
Procedimiento.
Las bioceras (30–50 mg) disueltas en 630 µL de cloroformo deuterado (CDCl3) con 0,03 % (v/v) de
tetrametilsilano (TMS) se transfirieron a tubos de RMN de 5 mm. La adquisición de los espectros se
realizó con un espectrómetro Bruker Avance III de 400 MHz (9,4 T) utilizando una secuencia de
pulsos Zg30 con 32 barridos, un tiempo de relajación (D1) de 10 s, una ganancia del receptor (RG)
de 101 y un ancho espectral (SWH) de 6009,615 Hz para los espectros de RMN de 1H. Los
espectros se procesaron con el software Mestre Nova 12.0, y la señal de TMS a 0 ppm se utilizó
para el ajuste de la escala de protones. Los espectros de RMN de 1H se dividieron en 31 regiones, y
(Ai/AT) ∗ 100, donde Ai es el área de la señal analizada y AT es el área total de protones en el
el porcentaje de área de cada tipo de protón (%Ai) se calculaen función de la ecuación %Ai =
rango de 0 a 10 ppm por espectro.
B) IDENTIFICACION DE MICOTOXINAS.
Nuevo método de RMN cuantitativa para cuantificar la psilocibina y la psilocina en hongos
psicodélicos.
Luisina Rodríguez, Guillermo Morera, Sandra Lupo, Danilo Davyt, Ignacio Carrera y Gonzalo
Hernández DossiACS Omega 2025 10 (46), 55725-55732
DOI: 10.1021/acsomega.5c07092
Los hongos psicodélicos del género Psilocybe contienen las triptaminas psicoactivas psilocibina y
psilocina, compuestos que actualmente se investigan clínicamente para el tratamiento de la
depresión y otros trastornos psiquiátricos. Sin embargo, la cuantificación precisa de estos
alcaloides en matrices fúngicas sigue siendo un desafío analítico. En este trabajo, presentamos un
protocolo de extracción optimizado y un método de cuantificación robusto y no destructivo basado
en espectroscopia de resonancia magnética nuclear cuantitativa (RMNq). Mediante una
combinación de RMN de 1H y 31P, Se logra la detección y cuantificación simultánea de psilocina y
psilocibina en muestras secas de Psilocybe cubensis con alta precisión y reproducibilidad.
Aunque los principales alcaloides psicoactivos encontrados en las especies de "hongos mágicos"
son PSB y PS, estudios recientes han demostrado que el universo de metabolitos secundarios
presentes está lejos de ser completamente conocido y caracterizado. Se han descrito
recientemente variantes estructurales de PSB en varias especies de hongos psicodélicos (Figura 1),
como baeocistina (4-OPNMT, 2), norbaeocistina (4-OP-T, 3), aeruginascina (4-OPTMT, 4) y
norpsilocina (4-OH-NMT, 6).16−19 Además, se ha encontrado la presencia de varias β-carbolinas,
como harmina, harmano, norharmano, perlolirina y cordicinina C/D, en Psilocybe.
Figura 10. Se describen las triptaminas para Psilocybe y hongos psicodélicos relacionados.
La cuantificación de PS y PSB en extractos de P. cubensis se realizó mediante RMN cuantitativa
(qNMR), combinando técnicas de RMN de ¹H y ³¹P. La psilocina se cuantificó con éxito mediante
RMN de ¹H, aprovechando su señal aislada y bien resuelta a 6,27 ppm, correspondiente al protón
H-5 del anillo de indol (Figura 2). Como se mencionó anteriormente, el extracto metanólico se
redisolvió en DMSO-d6 tras la evaporación del disolvente; se evitaron deliberadamente los
disolventes con deuterio intercambiable, como MeOD y D₂O, ya que los indoles 4-OH pueden
participar en el intercambio de hidrógeno mediado por el grupo hidroxilo. Dado que la
cuantificación de psilocina depende de la integración de la señal H5, su intercambio con deuterio
invalidaría el método. Por otro lado, la PSB no pudo cuantificarse mediante RMN de ¹H debido a la
ausencia de un pico aislado en el espectro de protones. En cambio, se empleó la RMN de 31P para
cuantificar el PSB, centrándose en la señal del grupo fosfato. Al comparar la resonancia del fosfato
de un estándar auténtico de PSB con la señal correspondiente en el espectro de RMN de 31P de un
extracto, ambos referenciados externamente al ácido fosfórico al 85%, se observa un marcado
efecto matriz, evidenciado por una desviación del desplazamiento químico de hasta 0,4 ppm.
Creemos que esto se debe a ligeras diferencias en los estados de protonación del grupo fosfato.
C.- CARACTERIZACION DE NUTRIENTES (ALIMENTOS).
Detección automática de la composición de ácidos grasos en aceites comestibles mediante RMN
de 1H.
Castejón D, Fricke P, Cambero MI, Herrera A. Automatic ¹H-NMR Screening of Fatty Acid
Composition in Edible Oils. Nutrients. 2016 Feb 16;8(2):93. Doi: 10.3390/nu8020093. PMID:
26891323; PMCID: PMC4772056.
En este trabajo, se presentó un método de cribado basado en RMN para el análisis de la
composición de ácidos grasos de aceites comestibles. Describimos la evaluación y optimización
necesarias para el análisis automatizado de aceites vegetales mediante RMN de bajo campo para
obtener la composición de ácidos grasos (CAG). Para ello, se desarrollaron dos scripts que analizan
e interpretan automáticamente los datos espectrales. El objetivo de este trabajo fue impulsar el
análisis automatizado de la CAG mediante RMN. Debido a que este protocolo puede realizarse a
bajo campo y que el proceso completo, desde la preparación de la muestra hasta la impresión del
informe, solo lleva unos 3 minutos, este enfoque promete convertirse en una técnica fundamental
para el cribado de alto rendimiento. Para demostrar la aplicabilidad de este método, se determinó
la composición de ácidos grasos de aceites de oliva virgen extra de diversas variedades de aceituna
españolas (arbequina, cornicabra, hojiblanca, manzanilla y picual) mediante espectroscopia de
RMN de 1H según este protocolo.
Tradicionalmente, la RMN ha sido una técnica analítica utilizada para la verificación y elucidación
de estructuras moleculares y para la determinación de la pureza. Sin embargo, debido a las
necesidades de campos emergentes como la metabolómica, la RMN ha evolucionado rápidamente
hasta convertirse en una técnica de cribado para el análisis de mezclas.
Este desarrollo se ha visto facilitado por los avances técnicos en el campo de los cambiadores
automáticos de muestras, la calidad de los espectrómetros de RMN y el desarrollo de nuevo
software para el procesamiento de datos espectrales.
Las principales aplicaciones de la RMN son el descubrimiento de fármacos y el diagnóstico clínico.
Mediante el desarrollo de un sistema totalmente automatizado, que comprende la preparación, la
adquisición de datos espectrales, el procesamiento, el análisis y la interpretación de los datos,
estos avances en el análisis de mezclas se han transferido recientemente con éxito al análisis de
zumos de frutas.
6.- Ejemplo desarrollado de una aplicación en un artículo de investigación (artículo en inglés
publicado de 2020-2026).
1.- detección de variantes genómicas.
Asignaciones de resonancia de H, 15N y 13C para 3rC y 3rCWP: variantes amiloidogénicas de la
cadena ligera 3 de la inmunoglobulina k
H, 15N and 13C resonance assignments for 3rC and 3rCWP: amyloidogenic variants of
imunoglobulin k 3 light-chain Paloma Gil-Rodrı´guez • Carlos Amero Biomol NMR Assign DOI
10.1007/s12104-014-9560-4
La amiloidosis primaria (AL) es la enfermedad sistémica amiloide más común y se caracteriza por el
depósito de fibras amiloides de cadena ligera de inmunoglobulina en diferentes órganos, lo que
provoca insuficiencia orgánica. Las proteínas de la cadena ligera de inmunoglobulina lambda 3 de
la línea germinal se han correlacionado con la AL. Se han derivado dos mutantes de esta línea
germinal: el mutante simple C34Y (3rC) y el mutante triple C34Y, W35A y P7D (3rCWP), que
presentan una notable diferencia en la propensión a la formación de fibrillas amiloides in vitro. En
este trabajo, presentamos las asignaciones de resonancia de 1H, 13C y 15N de estas proteínas,
como primer paso para utilizar la espectroscopia de resonancia magnética nuclear en solución y así
comprender mejor las diferencias en la formación de fibrillas amiloides entre estos dos mutantes.
Expresión y purificación de proteínas. La mutación C34Y se introdujo para mejorar la expresión de
la proteína y se utilizará como proteína de referencia (línea germinal). Las mutaciones W35A y P7D
se han observado en la base de datos AL-Base (Bodi et al., 2009). Los plásmidos 3rC/pet-22b(?) y
3rCW/pet-22b(?) se transformaron en E. coli BL21(DE3). Las células se cultivaron en 1 L de medio
2XYT suplementado con 100 µg/mL de ampicilina a 310 K (200 rpm) hasta alcanzar una densidad
óptica a 600 nm de 0,9. Posteriormente, las células se transfirieron a 250 ml de medio M9
enriquecido con 1 g/L de 15NH4Cl y 2 g/L de 13C6-glucosa (CIL) como únicas fuentes de nitrógeno
y carbono (Marley et al., 2001). Después de 1 h de crecimiento a 310 K, la expresión de la proteína
se indujo agregando IPTG a una concentración final de 0,8 mM y luego se incubó a 298 K (50 rpm)
durante 5 h antes de la recolección. Luego, las células se centrifugaron a 4000 rpm durante 20 min.
La proteína se extrajo por choque osmótico con sacarosa fría al 20 % (p/v), que contenía 100 mM
Tris, pH 8,0 y tampón EDTA 1 mM y se centrifugó a 7000 rpm. El precipitado se resuspendió con 20
mL de agua fría y se centrifugó a 7000 rpm. El sobrenadante con la proteína se recuperó y luego el
extracto se cargó en una columna de filtración en gel, Hi-load 16/600 Superdex S-200
(GEHealthcare) con 40 mM Tris, pH 8,2 y 50 mM NaCl. Las fracciones de proteína se combinaron y
concentraron utilizando un concentrador con un límite de exclusión de 5 kDa en un tampón que
contenía 20 mM de fosfato de sodio, pH 6, 20 mM de NaCl y 10 % de D2O. La concentración
aproximada para las muestras fue de 1 mM. Espectrometría de RMN Los datos de resonancia
magnética nuclear se recolectaron a 298 K en un espectrómetro Varian 700 MHz VNMR-S
equipado con una sonda de gradiente de campo pulsado de triple resonancia enfriada
criogénicamente en el Laboratorio Nacional de Estructuras de Macromoléculas (LANEM). Las
asignaciones de resonancia de la cadena principal para 3rC se obtuvieron utilizando espectros de
triple resonancia: HNCA, HNCACB, CBCA(CO)NH y HNCO. Las asignaciones de resonancia de la
cadena lateral se obtuvieron a partir de HBHA (CO)NH, C(CO)NH, 3D 1 H–15N–TOCSY (tm = 80 ms),
3D 1 H-15N-NOESY (tm = 150 ms) y HCCH–TOCSY, mientras que las asignaciones de resonancia de
la cadena principal para 3rCWPwere obtained using HNCACB, CBCA(CO)NH and HNCO
experiments. Side-chain resonance assignments were obtained from C(CO)NH, 3D 1 H–15N–TOCSY
(tm = 80 ms), 3D 1 H–15N–NOESY (tm = 150 ms) and HCCH– TOCSY. All NMR data were processed
and analyzed using NMRPipe and CARA.