UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

(Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA)

FACULTAD DE QUÍMICA E INGENIERÍA QUÍMICA
ESCUELA PROFESIONAL DE QUÍMICA

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE QUÍMICA ORGÁNICA

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

PRÁCTICA N°5

DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO DE LAS PROTEÍNAS

HORARIO: ​ Martes 14:00 - 18:00 pm

DOCENTE: ​ Mg. Juan Carlos Woolcott Hurtado

FECHA DE ELABORACIÓN: 25 de abril de marzo del 2025

FECHA DE ENTREGA: ​29 de abril del 2025

ESTUDIANTE: Jhefferson Andre Zagaceta Pinpincos

-​

LIMA - PERÚ

2025
 TABLA DE CONTENIDO

I. INTRODUCCIÓN​ 1
II. FUNDAMENTO TEÓRICO​ 1
III. DETALLES EXPERIMENTALES​ 3
IV. DISCUSIÓN DE RESULTADOS​ 5
V. CONCLUSIONES​ 6
VI. BIBLIOGRAFÍA​ 6
 I.​ INTRODUCCIÓN
Las proteínas son biomoléculas fundamentales que participan en una amplia gama de
funciones estructurales, catalíticas y regulatorias en los organismos vivos. Una de sus
propiedades fisicoquímicas más relevantes es la carga eléctrica neta, la cual depende
directamente del pH del medio y de los grupos ionizables presentes en sus
aminoácidos constituyentes. El punto isoeléctrico (pI) de una proteína corresponde al
valor de pH en el cual la carga neta total de la molécula es cero. En esta condición, la
solubilidad de la proteína suele ser mínima, ya que las repulsiones electrostáticas se
reducen, favoreciendo la agregación y precipitación [1,2].

La determinación del punto isoeléctrico es esencial en numerosos procedimientos

bioquímicos, incluyendo la purificación, caracterización y separación de proteínas
mediante métodos como la electroforesis isoeléctrica, la cromatografía de intercambio
iónico y técnicas de precipitación selectiva [3]. Comprender esta propiedad permite
predecir el comportamiento de las proteínas en diferentes condiciones ambientales y
ajustar los protocolos de aislamiento y análisis según la naturaleza de la muestra.

En este laboratorio se trabajó con caseína, la principal proteína de la leche, y gelatina,

una proteína derivada del colágeno. La caseína posee un punto isoeléctrico alrededor
de pH 4.6 y tiende a precipitar con facilidad en medios ácidos, lo cual se aprovecha en
procesos como la elaboración del queso [4]. Por su parte, la gelatina, aunque derivada
del colágeno, presenta un comportamiento distinto debido a su hidrólisis parcial y
variabilidad estructural; su punto isoeléctrico puede variar entre pH 5 y 9 dependiendo
del tipo de gelatina y su método de obtención [5]. El estudio de estas proteínas
permitió observar cómo el cambio gradual del pH influye en la solubilidad y
comportamiento físico de cada proteína en solución acuosa.

Además de su importancia industrial y alimentaria, el análisis del punto isoeléctrico

aporta una comprensión más profunda sobre la estructura y propiedades de las
proteínas, relacionando la química de los aminoácidos con fenómenos observables en
el laboratorio. A través de este experimento, se buscó aplicar estos conceptos en un
contexto práctico, utilizando métodos simples de acidificación y observación de la
precipitación para determinar de manera aproximada el pI de las proteínas estudiadas.

II.​ FUNDAMENTO TEÓRICO

Las proteínas son polímeros naturales compuestos por cadenas de aminoácidos unidos por
enlaces peptídicos. Cada aminoácido presenta grupos funcionales ionizables (principalmente
el grupo amino y el grupo carboxilo), así como cadenas laterales que pueden poseer cargas
positivas o negativas dependiendo del pH del medio. Esta capacidad de ionización hace que
las proteínas presenten una carga eléctrica neta que varía según el pH de la solución.
El punto isoeléctrico (pI) es el valor de pH al cual una proteína tiene una carga neta igual a
cero. En esta condición, la cantidad de cargas positivas se iguala a la de cargas negativas, lo
que reduce las repulsiones electrostáticas entre moléculas y, en consecuencia, disminuye su
solubilidad. Este fenómeno puede inducir la precipitación de la proteína, lo que se aprovecha
en diversas técnicas de purificación y análisis [1].

El valor del pI depende de la secuencia de aminoácidos y de la estructura tridimensional de la

proteína. Por ejemplo, la caseína, una fosfoproteína presente en la leche, tiene un punto
isoeléctrico cercano a pH 4.6, valor en el cual precipita de manera espontánea en soluciones
ácidas, como ocurre en la fabricación del queso [2]. Por otro lado, la gelatina, una proteína
colagenosa parcialmente hidrolizada, puede presentar un rango de pI más amplio (entre pH 5
y 9), dependiendo de su origen (porcina, bovina, o de pescado) y método de obtención [3].

De manera general, el pI se establece para el siguiente equilibrio:

El punto isoeléctrico indica que en este equilibrio, [ROOC-] tiene que ser igual a [NH3+], es
decir que la carga negativa como la positiva son iguales, por lo que se establece con la
ecuación de Henderson-Hasselbach:

Fig. 1. Determinación del valor del punto isoeléctrico. Tomado de [6].

Uno de los métodos experimentales más comunes para estimar el punto isoeléctrico de una
proteína es el método de turbidez. Este se basa en medir la opacidad o turbidez de una
solución proteica a diferentes valores de pH. A medida que se ajusta el pH, se produce una
agregación de proteínas cerca del punto isoeléctrico, lo que incrementa la turbidez debido a la
formación de precipitados visibles [4]. El valor de pH donde se observa la mayor turbidez
suele corresponder al punto isoeléctrico, ya que es donde las proteínas, al no repelerse
eléctricamente, tienden a agregarse y precipitar [5].

Este método, aunque simple, es eficaz para comparar el comportamiento isoeléctrico de

diferentes proteínas bajo condiciones controladas. Su aplicación en el presente experimento
permite evidenciar cómo variaciones estructurales entre proteínas como la caseína y la
gelatina influyen en su comportamiento frente al cambio de pH, y cómo el análisis visual o
instrumental de la turbidez puede brindar una estimación experimental útil del pI.

III.​ DETALLES EXPERIMENTALES

Se prepararon soluciones de caseína y de gelatina al 1% (fue necesario el
calentamiento para poder disolver el sólido en el agua) y soluciones de CH3COOH
0.01, 0.1, 0.2 y 1 M respectivamente; y de CH3COONa de 0.1 y 0.2 M.
a)​ Determinación del punto isoeléctrico de la caseína
Tabla 1. Composición de las soluciones buffer para la determinación del punto
isoeléctrico de la caseína

N° de tubo Composición de solución buffer pH de la mezcla

0.2 M CH3COOH 0.2 M CH3COONa

1 1.9 0.1 3.4

2 1.8 0.2 3.8

3 1.4 0.6 4.4

4 1.0 1.0 4.7

5 0.6 1.4 5.1

6 0.2 1.8 5.7

Los resultados se muestran dentro de la Figura 2:

Figura 2. Soluciones buffer para la determinación del punto isoeléctrico de la caseína.

No se apreció turbidez.

b)​ Determinación del punto isoeléctrico de la gelatina

En seis tubos de ensayo se colocaron las cantidades en mL indicadas por la Tabla 2. Tras
agitación, a cada tubo se le añadieron 2 mL de acetona lentamente por las paredes. Tras 30
minutos se observó la aparición de turbidez, indicado por la Figura 3:

Tabla 2. Composición de las soluciones buffer para la determinación del punto

isoeléctrico de la gelatina

N° de Agua 0.1 M 1.0 M 0.1 M Solución de pH

tubo CH3COOH CH3COOH CH3COONa gelatina

1 3.8 0.2 - 2.0 2.0 5.6

2 3.5 0.5 - 2.0 2.0 5.3

3 3.0 1.0 - 2.0 2.0 5.0

4 2.0 2.0 - 2.0 2.0 4.7

5 - 4.0 - 2.0 2.0 4.4

6 3.2 - 0.8 2.0 2.0 4.1

Figura 3. Tubos con las soluciones buffer para la determinación del punto isoeléctrico
de la gelatina.

El valor del pH del tubo en donde se observó mayor turbidez corresponde un pH aproximado
de 4.7, valor similar al rango indicado por [3].
IV.​ DISCUSIÓN DE RESULTADOS
En este experimento se evaluó el comportamiento de las proteínas caseína y gelatina
frente a variaciones de pH, con el objetivo de determinar experimentalmente sus
respectivos puntos isoeléctricos (pI). La metodología se basó en el uso de soluciones
buffer ácido-acetato en diferentes proporciones, lo que permitió obtener un rango de
pH en el cual se pudieran observar posibles precipitaciones proteicas como indicador
visual del pI.

En el caso de la caseína, se prepararon soluciones buffer con pH comprendido entre

3.4 y 5.7. Sin embargo, tal como se muestra en la Figura 2, no se observó turbidez
apreciable en ninguno de los tubos. Este resultado puede deberse a varios factores:
primero, la concentración utilizada de la proteína (1%) puede haber sido insuficiente
para evidenciar una precipitación visible. Segundo, la caseína es una proteína que se
encuentra en forma de micelas coloidales en solución acuosa, y estas estructuras
pueden mantenerse en suspensión incluso cerca del punto isoeléctrico si no hay
suficiente fuerza iónica o agentes desestabilizantes presentes [1]. Además, la ausencia
de adición de un desnaturalizante o precipitante, como la acetona, puede haber
favorecido la solubilidad residual de la proteína incluso a pH próximos a 4.6, su valor
teórico de pI [2].

En contraste, durante la determinación del punto isoeléctrico de la gelatina, se utilizó

una estrategia complementaria: se emplearon soluciones buffer en un rango de pH de
4.1 a 5.6 y, tras agregar acetona a cada mezcla, se observó una formación gradual de
turbidez en los tubos. La mayor turbidez se presentó en el tubo con pH aproximado de
4.7, lo cual concuerda con el rango reportado para gelatinas tipo A, cuyo punto
isoeléctrico se sitúa entre 4.7 y 5.2 dependiendo de su origen y grado de hidrólisis [3].

La acetona cumple un papel importante en este procedimiento. Al tratarse de un

disolvente orgánico miscible en agua, su adición reduce la constante dieléctrica del
medio, disminuyendo la solvatación de las moléculas de proteína. Esto favorece las
interacciones intermoleculares y promueve la agregación de las cadenas
polipeptídicas, especialmente cuando la carga neta de la proteína es cero, es decir, en
su punto isoeléctrico [4]. En este entorno, componentes polares y parcialmente
hidrofóbicos de la gelatina, como residuos de glicina, prolina e hidroxiprolina, se
asocian entre sí y precipitan, quedando en fase sólida. En cambio, fracciones más
pequeñas o péptidos hidrosolubles pueden permanecer en solución o formar parte del
sobrenadante.

La combinación de un ajuste fino del pH y la presencia de acetona permitió evidenciar

de manera clara el pI de la gelatina, a diferencia del comportamiento observado con la
caseína. Este resultado pone de manifiesto la importancia de emplear condiciones
 adecuadas según la naturaleza de cada proteína: mientras algunas requieren fuerzas
desestabilizantes adicionales, otras precipitan con mayor facilidad al alcanzar el
equilibrio de cargas.

V.​ CONCLUSIONES
La presente práctica permitió comprender experimentalmente el comportamiento de
las proteínas frente a variaciones de pH, así como aplicar el método de turbidez para
la estimación de su punto isoeléctrico (pI). En el caso de la caseína, no se observó
formación de turbidez visible en el rango de pH evaluado (3.4 a 5.7), lo que sugiere
que las condiciones experimentales no fueron suficientes para inducir su
precipitación, posiblemente debido a la estabilidad coloidal de sus micelas en solución
acuosa y a la ausencia de un agente desnaturalizante. En contraste, la gelatina mostró
una marcada turbidez a pH 4.7, lo que concuerda con el valor teórico de su pI y valida
el uso del método de turbidez apoyado por acetona como precipitante. La acetona
actuó disminuyendo la solvatación de las cadenas polipeptídicas, promoviendo su
agregación al alcanzar la neutralidad de carga. Estos resultados resaltan la importancia
del contexto químico y estructural de cada proteína para su análisis y subrayan la
utilidad de herramientas sencillas, como el ajuste de pH y la observación de turbidez,
para estudiar propiedades fundamentales como el punto isoeléctrico.

VI.​ BIBLIOGRAFÍA
1.​ Lehninger AL, Nelson DL, Cox MM. Principios de Bioquímica. 6.ª ed. Barcelona:
Omega; 2014.
2.​ Voet D, Voet JG. Biochemistry. 4th ed. Hoboken: John Wiley & Sons; 2011.
3.​ Walstra P, Wouters JTM, Geurts TJ. Dairy Science and Technology. 2nd ed. Boca
Raton: CRC Press; 2006.
4.​ Lucey JA, Singh H. Formation and physical properties of acid milk gels: a review.
Food Res Int. 1997;30(7):529–42.
5.​ Karim AA, Bhat R. Gelatin alternatives for the food industry: recent developments,
challenges and prospects. Trends Food Sci Technol. 2008;19(12):644–56.
6.​ Vázquez-Durán A, Martínez-López AL, et al. Effect of acetone on the precipitation
and structure of gelatin: An experimental and computational study. Int J Biol
Macromol. 2017;98:682–689.
7.​ Whitford D. Proteins: Structure and Function. Chichester: John Wiley & Sons; 2005.
8.​ Sawyer WH, Manning MC. Protein solubility and precipitation. In: Creighton TE,
editor. Encyclopedia of Molecular Biology. New York: Wiley-Liss; 1999. p. 1975–8.