UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA: BIOQUÍMICA Y
FARMACIA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
II CICLO II 2025 - 2026
Estudiantes:
• Garcia Bedor Litzi
• Guerrero Mishquero Nathaly
• Plaza Carpio Mileydi
• Quinto Marcillo Naomy
• Yepez Cruz Maria
Séptimo semestre / Grupo G3-A
Fecha: 14-Enero-26
Docente: QF. Fernando Morlás López
INFORME # 9
TEMA: Determinación de Salmonella spp
Objetivos de la práctica de laboratorio:
• Aplicar correctamente las etapas de preenriquecimiento, enriquecimiento selectivo y aislamiento para la
detección de Salmonella spp en alimentos.
• Identificar colonias presuntivas de Salmonella spp mediante el uso de medios selectivos y diferenciales como
agar XLD y agar sulfito de bismuto.
• Interpretar las características macroscópicas de las colonias desarrolladas para diferenciar Salmonella spp de
la microbiota acompañante.
Fundamentos
El género Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae y
está constituido por bacilos Gram negativos no esporulado
generalmente móviles por flagelos perítricos y anaerobios
facultativos. Estas bacterias son patógenos entéricos de gran
importancia en salud pública debido a su capacidad de causar
enfermedades transmitidas por alimentos, principalmente la
salmonelosis, que afecta tanto a humanos como a animales.
Salmonella spp se encuentra de forma natural en el tracto intestinal
de animales domésticos y silvestres, y su transmisión ocurre principalmente por el consumo de alimentos o agua
contaminados, como carnes crudas o mal cocidas, huevos, productos lácteos no pasteurizados y vegetales
contaminados. La infección puede manifestarse con síntomas gastrointestinales como diarrea, fiebre, dolor abdominal,
náuseas y vómitos, y en casos graves puede producir septicemia, especialmente en niños, adultos mayores e individuos
inmunocomprometidos.
Las bacterias crecenópmamente a 37ºC y pueden catabolizar la D-glucosa y otros carbohidratos con producción de
ácido y gas, una cepa de Salmonella típica produce ácido y gas a partir de la glucosa en el agar hierro tres azúcares,
pero no es capaz de utilizar lactosa y sacarosa en este medio, o en medios sólidos selectivos tales como verde brillante,
xilosa lisina, etc.
Salmonella spp es un patógeno entérico responsable de diversas enfermedades de importancia en salud pública, entre
las que destaca la salmonelosis no tifoidea que se manifiesta principalmente como una gastroenteritis caracterizada por
diarrea, fiebre, dolor abdominal, náuseas y vómitos tras el consumo de alimentos o agua contaminados. Asimismo,
ciertos serotipos como Salmonella enterica serotipo Typhi y Paratyphi son causantes de la fiebre tifoidea y
paratifoidea, enfermedades sistémicas graves que cursan con fiebre prolongada, malestar general y compromiso
intestinal, pudiendo provocar complicaciones severas como hemorragia o perforación intestinal. En individuos
inmunocomprometidos, niños y adultos mayores, la infección por Salmonella spp puede diseminarse fuera del tracto
gastrointestinal y originar bacteriemia, sepsis e infecciones extraintestinales como osteomielitis, meningitis y
endocarditis, lo que incrementa significativamente la morbilidad y mortalidad asociadas.
Determinación de Salmonella.
La detección de Salmonella spp en alimentos se realiza mediante un método microbiológico convencional, el cual
comprende una serie de etapas secuenciales diseñadas para favorecer la recuperación, el aislamiento y la identificación
del microorganismo, debido a que suele encontrarse en bajas concentraciones y acompañada de flora competitiva.
1. Preenriquecimiento
La muestra de alimento se homogeniza y se inocula en un medio no selectivo, generalmente agua peptonada
tamponada o caldo lactosado, y se incuba a 37 °C durante 18–24 horas.
Esta etapa permite la recuperación de células de Salmonella que puedan encontrarse dañadas por procesos físicos o
químicos, evitando su inhibición temprana.
2. Enriquecimiento selectivo
Una alícuota del cultivo preenriquecido se transfiere a medios selectivos líquidos, como caldo selenito-cistina y/o caldo
Rappaport-Vassiliadis, y se incuba entre 37–42 °C por 24 horas.
Estos medios inhiben el crecimiento de la flora acompañante y favorecen la multiplicación de Salmonella spp.
3. Aislamiento en medios selectivos y diferenciales
Posteriormente, el cultivo enriquecido se siembra por estría en medios sólidos selectivos y diferenciales, tales como:
• Agar XLD (Xilosa-Lisina-Desoxicolato)
• Agar SB (Sulfito de Bismuto)
Las placas se incuban a 37 °C durante 24–48 horas.
Las colonias sospechosas de Salmonella suelen ser incoloras o rojizas con centro negro, debido a la producción de
sulfuro de hidrógeno (H₂S).
4. Identificación bioquímica
Las colonias sospechosas se someten a pruebas bioquímicas confirmatorias, tales como:
• TSI (Triple Sugar Iron)
• LIA (Lysine Iron Agar)
• Citrato de Simmons
• Urea
• SIM
El perfil bioquímico típico de Salmonella incluye producción de H₂S, descarboxilación de lisina, utilización de citrato
y prueba de urea negativa.
5. Confirmación serológica
En algunos casos, se realiza la confirmación mediante pruebas serológicas con antisueros específicos, que permiten
identificar antígenos somáticos (O) y flagelares (H) del género Salmonella.
ISO 6579-1:2017
La detección de Salmonella spp en alimentos se realizó conforme a la norma ISO 6579-1:2017, la cual establece un
método horizontal estandarizado para la identificación de este microorganismo en alimentos, piensos y muestras
ambientales de la cadena alimentaria. Esta norma tiene como objetivo garantizar resultados confiables, reproducibles y
comparables entre laboratorios, debido a la importancia de Salmonella como uno de los principales agentes causales de
enfermedades transmitidas por alimentos. El método descrito contempla una secuencia sistemática que inicia con una
etapa de preenriquecimiento en agua peptonada tamponada, destinada a la recuperación de células bacterianas dañadas
o estresadas; continúa con un enriquecimiento selectivo en medios como el caldo Rappaport-Vassiliadis que favorecen
el crecimiento de Salmonella e inhiben la flora acompañante; seguido del aislamiento en medios sólidos selectivos y
diferenciales como agar XLD y SB donde se observan colonias con características típicas. Finalmente, la norma
establece la confirmación mediante pruebas bioquímicas y, de ser necesario, pruebas serológicas, permitiendo la
identificación precisa del género Salmonella. La aplicación de la ISO 6579-1:2017 es fundamental para el control
sanitario de los alimentos, la vigilancia epidemiológica y la protección de la salud pública.
Reactivos:
• Caldo lactosado o Agua de peptona bufferada
• Caldotetra-onato
• Caldo RappaportVassiliadis
• Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD
• Agar entérico de Hektóen (HE)
• Agar sulfito de bismuto (SB)
• Agar hierro-triple azúcar (TSI) o agar hierro Kiigler (KIA) solidificado e inclinado
• Agar hierro-lisina (LIA) inclinado.
• Agar urea
• Agar SIM (sulfuro-indol-mo-lidad)
• Agar citrato de Simmons inclinado
• Caldo rojo de me-lo-VogesProskauer (RM-VP)
• Solución de verde brillante al 0.1%
• Soluciónyodoyodura de potasio
• Reactivo de Kovac's
• Solución de rojo de me-lo.
Materiales:
• Cajas petri
• Pipetas
• Fundas ziploc
• Tubos de ensayos
• Marcador
• Probetas
Equipos:
• Incubadora
• Autoclave
• Mechero de bunsen
• Balanza
• Auxiliar de pipeteo
Procedimiento o desarrollo:
4. Pruebas bioquímicas preliminares
NOTA
Se recomienda identificar seis cultivos por cada unidad analítica (25.0 g). Seleccionar colonias procedentes de
ambos medios de enriquecimiento.
4.1. Agar triple azúcar hierro
1. Registrar las características del medio TSI antes de la inoculación (color del medio).
2. Por duplicado tomar suavemente una porción del centro de la colonia con asa bacteriológica recta y estéril e
inocular por picadura y estría en un tubo con agar triple azúcar hierro (TSI) inclinado.
3. Incubar el medio TSI a 35 ±2 ºC durante 24 h.
4. Consultar la tabla para la interpretación de los resultados.
4.2. Agar lisina hierro.
1. Hacer la misma operación que se hizo para TSI, tomando la asada de la misma colonia con la que se sembró
en estos medios, pero sembrando ahora en el agar lisina hierro (LIA).
2. Consultar la tabla para la interpretación de los resultados.
3. Retener todos los cultivos que muestren las reacciones características de Salmonella en los medios TSI y
LIA para realizar las pruebas bioquímicas complementarias.
4. Los cultivos desarrollados en TSI que no parecen de Salmonella pero que presentan en ambos medios.
5. Pruebas bioquímicas preliminares
5.1. Caldo urea (convencional)
1. Con asa bacteriológica recta estéril, tomar del crecimiento del tubo TSI e inocular en el tubo con caldo urea.
2. incubar a 35 ±2 ºC durante 24 ±2 h.
3. Consultar la tabla para la interpretación de los resultados.
4. Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Conservar los cultivos que den la prueba negativa.
5.2. Agar citrato de Simmons
1. Con asa bacteriológica recta estéril tomar crecimiento del tubo de TSI e inocular por estría en el tubo con
agar citrato de Simmons.
2. incubara 35 ±2 ºC durante 24 ±2 h.
3. Interpretar los resultados (Consultar tabla).
5.4. Medio SIM (Sulfuro-indol-movilidad)
1. Con asa bacteriológica recta estéril tomar crecimiento del tubo TSI e inocular por punción vertical en el tubo
con medio de SIM.
2. Incubara 35±2 ºC durante 24±2
3. Para verificar la producción de indol, adicionar al tubo con medio SIM que presente crecimiento de 0.2 a 0.3
mL de reactivo de Kovac's. 4, Interpretar resultados (Consultar tabla).
5.5. Caldo RM-VP (Rojo de metilo-Voges-Proskauer)
1. Con asa bacteriológica recta estéril tomar crecimiento del tubo TSI e inocular el tubo con caldo RM-VP.
5.5.1, Prueba de Voges-Proskauer (VP)
1. Parala prueba de Voges-Proskauer incubar a 35 ±2 ºC durante 48 ± 2 h.
2. Transferir a un tubo de 13 x 100 mm estéril un mililitro de cultivo.
3. Adicionar a este cultivo, 0.6 mL de reactivo de VP1 (alfa-naftol etanólico al 5 %), agitar y agregar 0.2 mL
del reactivo VP2 (hidróxido de potasio al 40%).
4. Adicionar algunos cristales de creatinina (opcional).
5. Agitar nuevamente y dejar reposar el tubo en forma inclinada, con el objeto de que la reacción se lleve a
cabo en presencia de oxígeno.
6. Interpretar los resultados después de 2 h. de incubación a temperatura ambiente (consultar tabla)
5.5.2. Prueba de Rojo de Metilo
1. Para la prueba de rojo de metilo (RM) incubar a 35 ±2ºC el resto del medio RMVP durante 48 h más (96 h.
de incubación en total a partir de la inoculación del -RMVP).
2. Adicionar al medio de cultivo dos a tres gotas de solución indicadora de metilo.
3. Agitar e interpretar los resultados en forma inmediata (Consultar tabla)
Las pruebas bioquímicas se pueden interpretar en la siguiente tabla, sin embargo, se sugiere que se consulten
otras referencias, además de las ya expresadas aquí, con el fin de determinar la especie del género en
cuestión, esto quiere decir que no necesariamente se encuentre en el alimento analizado la Salmonella, pero
sí puede encontrarse otra Enterobacteria, el que es indispensable identificar.
En este cuadro solamente se encuentran las pruebas bioquímicas más generales de Salmonella.
90% o más positivos en 1 o 2 días; - 90% o más negativos en 1 o 2 días; v, variable. La mayoría de los
cultivos de S. arizonae son negativos. La mayoría de los cultivos de S. arizonae son positivos. Excepto S.
entéricaserovar Pullorum y S. entéricaserovar Gallinarum y cepas con flagelos disfuncionales.
6. Identificación serológica.
6.1. Investigación de los antígenos somáticos de Salmonella (suero anti-Salmonella “O” polivalente).
1. Colocar con un asa bacteriológica, dos gotas separadas de solución salina estéril (NaCl 0.85%) sobre un
portaobjetos o en dos secciones de una placa para aglutinación.
2. Suspender en cada una de las gotas, una porción del cultivo desarrollado en TSI.
3. Agregar a una de ellas una gota del suero anti-Salmonella “O” polivalente y mezclar con el canto del asa o
empleando aplicadores de madera.
4. Agitar inclinando la lámina, hacer girar las gotas durante aproximadamente un minuto.
5. Observar bajo una buena iluminación y sobre un fondo oscuro la reacción.
6. Considerar cualquier grado de aglutinación como positiva.
7. Consultar el Cuadro 3 para la interpretación de los resultados.
NOTAS
• La suspensión del cultivo en la que no se adicionó el suero anti Salmonetla “O” polivalente se considerará
como el control negativo para poder interpretar el resultado.
• Cuando la aglutinación es positiva con el suero anti-Salmonella “O” polivalente, puede determinarse el
subgrupo empleando sueros inmunes para los diferentes subgrupos (los más frecuentes son B, C, D y E).
• Si la aglutinación con el suero anti-Salmonella “O” polivalente es negativa, utilizar el suero anti-Salmonella
“Vi” polivalente y efectuar la prueba en las mismas condiciones ya descritas. Si hay aglutinación con “Vi”
calentar a ebullición y repetir nuevamente la prueba con el suero anti-Salmonella O” polivalente.
6.2. Investigación de los antígenos flagelares de Salmonella (suero anti-Salmonella “H” polivalente).
1. Para ensayo el antígeno flagelar en el mismo día, inocular el crecimiento del cuitivo de TSI en agar infusión
cerebro corazón (BHI).
2. Incubara 35º C durante 4 a 6h.
3. Adicionar al cultivo 2.5 mL de solución salina formalizada.
4. Colocar 0.5 mL del suero antiflagelar “H” polivalente en un tubo de ensayo para serología (12 x 75 mm).
5. Adicionar 0.5 mL del cultivo formalizado (el obtenido en el punto 3 de este inciso).
6. Preparar un control de solución salina mezclando 0.5 mL de solución salina formalizada con 0.5 mL del
antígeno formalizado.
7. Incubar las mezclas en baño de agua a una temperatura entre 48 y 50 ºC.
8. Observar en intervalos de 15 minutos por espacio de 1 hora.
9. Una prueba positiva es cuando se observa aglutinación en la muestra de prueba, pero no en el control.
10. Debe interpretarse como negativa una prueba en la que ninguna de las mezclas muestre aglutinación.
11. Cuando ambas mezclas se aglutinan, se considera la prueba inespecífica.
Resultados obtenidos:
Muestra: Pollo
Agar XLD Agar BFS
En el agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) se En el agar Sulfito de Bismuto (SB) no se evidenció el
evidenció crecimiento bacteriano, observándose desarrollo de colonias de color negro o verde oscuro,
predominantemente colonias de color amarillo a ni colonias con brillo metálico, características
amarillento, de tamaño pequeño a mediano, con comúnmente asociadas a la presencia de Salmonella
superficie lisa y bordes regulares, distribuidas a lo spp. Asimismo, no se observó oscurecimiento del
largo de las estrías de siembra. Esta coloración medio circundante, lo que indica la ausencia de la
amarilla es indicativa de la fermentación de reducción del sulfito de bismuto y de la producción
carbohidratos presentes en el medio por parte de la de H₂S. El crecimiento bacteriano fue escaso y poco
microbiota acompañante, lo cual provoca el viraje definido, sin alteraciones macroscópicas
del indicador de pH. No se observaron colonias de significativas del medio de cultivo, lo que refuerza la
color rojo con centro negro, ni signos de ausencia de microorganismos con comportamiento
producción de sulfuro de hidrógeno (H₂S), que típico de Salmonella spp. en la muestra analizada.
constituyen características típicas y diferenciadoras
de Salmonella spp. en este medio selectivo y
diferencial.
Conclusiones:
• En la práctica realizada para determinar la presencia de Salmonella spp en productos cárnicos, sobre todo en
pollos, se utilizaron medios selectivos y diferenciales como agar Xilosa lisina desoxicolato (XLD) y agar
sulfito de bismuto (BFS), los cuales son muy utilizados para la detección presuntiva de este microorganismo.
• En el lagar XLD se observó crecimiento bacteriano, pero las colonias desarrolladas no presentaron las
características típicas de salmonella (colonias de centro negro), lo que indica que el crecimiento corresponde a
otro microorganismo, así mismo, en el agar BFS no se evidenció crecimiento de colonias. La ausencia de las
colonias confirma que no hubo desarrollo de colonias presuntivas de salmonella en estos medios selectivos.
• Los resultados obtenidos en ambos medios de cultivo selectivos permiten concluir que la muestra de pollo
analizada no presentó contaminación por salmonella spp.
Recomendaciones:
• Cumplir rigurosamente las condiciones de incubación, tiempos y temperaturas establecidas en cada etapa del
método, para asegurar resultados confiables.
• Realizar siempre la identificación presuntiva en más de un medio selectivo y diferencial, con el fin de minimizar
falsos positivos o negativos.
• Complementar el aislamiento con pruebas bioquímicas confirmatorias y, de ser posible, pruebas serológicas para
una identificación más precisa del microorganismo.
• Mantener estrictas normas de bioseguridad durante la manipulación de muestras alimentarias y cultivos bacterianos,
debido al riesgo sanitario asociado a Salmonella spp.
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