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Qca Bios

El estudio cinético analizó la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina mediante la medición de la absorvancia en diferentes condiciones. Se calcularon los valores de Km y Vmáx utilizando dos métodos, resultando en un Km de 1.64 mM y 1.45 mM respectivamente. Los experimentos se realizaron a 37ºC con un sustrato específico y se detuvieron con NaOH para medir la reacción.

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El estudio cinético analizó la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina mediante la medición de la absorvancia en diferentes condiciones. Se calcularon los valores de Km y Vmáx utilizando dos métodos, resultando en un Km de 1.64 mM y 1.45 mM respectivamente. Los experimentos se realizaron a 37ºC con un sustrato específico y se detuvieron con NaOH para medir la reacción.

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UNIVERSIDAD DE MORON

Qca. Biológica y Biología Molecular

ESTUDIO CINETICO Y ACTIVACION

CALCULO DE KM Y V máx.

Aguirre, Natalia
De Carli, Ruben 3601-1145
Dembinski , Ezequiel 3601-3490
Giacobbe Boggio, Dalila 3601-3118

Año: 2007

Desarrollo
Se llevó a cabo un estudio cinético de la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina. Para esto
se colocaron 11 tubos de ensayo con diferentes volúmenes de buffer carbonato 0.1M a un pH
de 10.1 junto con diferentes volúmenes de sustrato (p-nitrofenilfosfato; 5.6 mM ), además se
adicionó 0.2ml de MgCl2 25Mm en todos los tubos utilizado como catalizador.
Posteriormente se colocaron los tubos en un baño termostático a 37ºC y se le administro a los
últimos 10 tubos 0.2ml de suero (conteniendo la enzima). El tubo Nº 1 fue utilizado como
blanco. Las 11 muestras se mantuvieron a dicha temperatura durante 15 min, tiempo que
permitió mantener una cinética de primer orden. Transcurrido este tiempo la reacción fue
detenida mediante el agregado de 3ml de NaOH.
A continuación se midió la absorvancia de cada muestra en un espectrofotómetro. A partir de
estos datos se realizaron los siguientes cálculos y gráficos:
Datos obtenidos:

Volumen S (ml) [S] 1/[S] ABS ABS - Blanco ABS/ 15 min


0,025 0,082352941 12,1428571 0,064
0,025
1/[S] 0,082352941
1/Velocidad 12,1428571 0,104 0,04 0,00266667
0,05 0,164705882 6,07142857
12,1428571 375 0,112 0,048 0,0032
0,1 0,329411765 3,03571429
6,07142857 312,5 0,295 0,231 0,0154
0,2 0,658823529 1,51785714
3,03571429
0,3 64,9350649
0,988235294 1,01190476
0,42 0,356 0,02373333
1,51785714
0,4 42,1348315
1,317647059 0,75892857 0,497 0,433 0,02886667
1,01190476
0,6 34,6420323
1,976470588 0,50595238 0,514 0,45 0,03
0,75892857
0,8 33,3333333
2,635294118 0,37946429 0,608 0,544 0,03626667
0,50595238
1 27,5735294
3,294117647 0,30357143 0,625 0,561 0,0374
1,2
0,37946429 3,952941176
26,7379679 0,25297619 0,808 0,744 0,0496
0,30357143 20,1612903 0,808 0,744 0,0496
0,25297619 20,1612903

En el gráfico, como los puntos no se encontraban alineados, se trazó una línea de tendencia
con la computadora donde se calculó la pendiente de dicha recta y el punto de corte con el eje
Y:

y = mx + B  y = 33,113x + 9,6882

Mediante la pendiente se puede obtener Km sabiendo que la velocidad máxima es 0.0496 min-1:

m= Km/Vm  Km = m Vm = 33.11 mM min-1 * 0.0496 min-1  Km = 1.64 mM


Otra forma de obtener el valor de Km es mediante la fórmula

Vi=(Vmax . [S])/(Km + [S])

donde

Km= (Vmax .[S]/Vi) - [S]

Km= ((Vmax /Vi) - 1) [S]

siendo Vmax igual a 0.0496 min-1 y Vi igual a 0.00267 min-1, entonces:

Km = 1.45 mM

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