Cátedra de Fisiología Facultad de Ciencias Veterinarias - UNNE Cátedra de Fisiología Facultad de Ciencias Veterinarias - UNNE
TA: Fisiología Eritrocitaria. Fundamentos y utilidad del Hematocrito y recuento de glóbulos Líquido de Turk: diluyente usado para el recuento de glóbulos blancos solución que
rojos. contiene ácido (clorhídrico al 1% o acético al 2%) y es HIPOTONICA respecto al
plasma sanguíneo, provocando así la lisis de glóbulos rojos y facilitando el recuento
Bibliografía sugerida: Duke y Swenson. Fisiología de los animales domésticos.
de los leucocitos. También puede tener un colorante incorporado, que actúe como
García Sacristán. Fisiología Veterinaria.
medio de contraste.
Microscopio
Clase Práctica N° 7 Contador celular.
Fisiología Hemática I Procedimiento para recuento de glóbulos
Hemograma 1. Obtener sangre total siguiendo el protocolo ya conocido y homogeneizar suavemente al
El hemograma es un estudio rutinario realizado para el diagnóstico clínico de algunas momento de uso.
entidades patológicas o como medio de seguimiento de evolución de las mismas. Consta de 2. Con la boquilla y la pipeta de Thoma aspirar sangre hasta la marca 0,5 (SIN BURBUJAS) y
partes importantes, el Eritrograma (Hematocrito, recuento de eritrocitos e índices de limpiar los restos de sangre externos de la pipeta.
Wintrobe), el Leucograma (recuento de leucocitos totales y cálculo diferencial) así como la 3. Aspirar diluyente (el que corresponda) hasta la marca 101 u 11 de la pipeta.
evaluación de las plaquetas y la medición de sólidos totales por refractometría. 4. Tapar los extremos con los dedos y agitar la pipeta manteniéndola en forma horizontal,
Esta cartilla desarrollaremos algunas partes que hacen al hemograma, el resto lo iremos
viendo en las siguientes clases. 5. Desechar las 5 o 6 primeras gotas (solo contendrá diluyente).
6. Colocar el cubreobjetos sobre la cámara de Neubauer y con la punta de la pipeta se toca
Recuento de eritrocitos y leucocitos el espacio entre el cubreobjetos y la cámara dejando fluir el líquido por capilaridad, sin que
El recuento de Eritrocitos o Glóbulos Rojos (GR): es una prueba cuantitativa que permite se derrame por los bordes.
determinar el número de glóbulos rojos que tiene un individuo. Se expresa en 7. Dejar en reposo 2 o 3 minutos la cámara.
millones/mm³. 8. Colocar en microscopio y observar:
El recuento de Leucocitos o Glóbulos Blancos (GB): es una prueba cuantitativa que permite Recuento de glóbulos rojos
determinar la concentración absoluta y relativa de glóbulos blancos. En esta práctica nos Con el objetivo de 10x del microscopio se localiza el cuadro central (figura 3) de los
limitaremos a contar manualmente los leucocitos totales expresándolos en miles/mm3, sin 9 cuadros primarios.
poder diferenciar entre los cinco tipos de leucocitos normales (neutrófilos, monocitos, Con el objetivo de 40x se deben contar los eritrocitos en 5 de los cuadros
linfocitos, basófilos y eosinófilos), tema que será abordado en la clase correspondiente. secundarios del área central.
A continuación se describirán ambos procesos ya que cuentan con muy pocas diferencias, Cada uno de los 5 cuadros está limitado por líneas dobles y triples y se dividen en 16
las cuales serán detalladas en cada caso. más pequeños (cuadrados terciarios).
Materiales necesarios:
Recuento de glóbulos blancos
Muestra de sangre anticoagulada (EDTA).
Emplear el objetivo 10x para ubicar los cuadrados primarios en los que se realizará
Cámara de Neubauer: Se trata de una gruesa placa de cristal con forma de
el conteo (los cuatro cuadrados primarios de las esquinas)
portaobjeto (figura 1), con cuatro surcos transversales que limitan tres porciones:
9. Realizar el recuento teniendo en cuenta lo siguiente:
dos barras laterales donde se apoya el cubre-cámara y una plataforma central en la
a. Se cuenta iniciando a la izquierda de la fila superior de los cuatro cuadros pequeños,
cual se encuentra grabada una retícula cuadrangular. En el caso de cámaras dobles,
luego de derecha a izquierda en la siguiente fila y así sucesivamente (figura 4).
que son las más comunes, existen 2 zonas reticuladas de conteo, una superior y otra
b. Se incluyen todas las células que tocan las líneas que forman los lados superior e
inferior.
izquierdo.
c. Las células que sobrepasan las líneas marginales no deben contarse.
10. Realizar los cálculos para determinar la cantidad de eritrocitos o leucocitos resultantes:
Cátedra de Fisiología Facultad de Ciencias Veterinarias - UNNE Cátedra de Fisiología Facultad de Ciencias Veterinarias - UNNE
Eritrocitos contabilizados X 10.000 = NUMERO DE ERITROCITOS/ mm3
El factor 10.000 proviene de multiplicar el volumen de un cuadrado secundario
(4/1000=0,004 mm3) por el número de cuadrados contados (5) y por la dilución 1/200.
Leucocitos contabilizados X 50 = NUMERO DE LEUCOCITOS/ mm3
El factor 50 surge de multiplicar el volumen de cada cuadrado primario (1/10) por el número
Figura 1: Cama de Neubauer de cuadrados contados (4) y por la dilución obtenida de 1/20.
Una retícula completa mide 3 mm x 3 mm de lado. Se encuentra dividida en 9
cuadrados primarios de 1mm de lado cada uno, de los cuales los cuadrados de las
esquinas son los destinados al recuento de Leucocitos, (al existir estos en menor
número que los hematíes, se necesitan menos líneas de referencia para realizar el
conteo). Estos se subdividen en 16 cuadrados secundarios.
El cuadrado primario central es el destinado al recuento de Hematíes y Plaquetas.
Se divide en 25 cuadrados secundarios de 0,2 mm de lado, y cada uno de estos
cuadros secundarios se subdivide a su vez en 16 cuadrados terciarios. El cuadrado
central está por tanto formado por 400 cuadrados pequeños (25x16). Los límites
entre las divisiones secundarias de la zona para recuento de glóbulos rojos tienen 2
o 3 líneas paralelas próximas que facilitan la selección de los eritrocitos que se
incluirán en el recuento.
Además necesitaremos:
Cubre-objeto.
Pipeta de Thoma (figura 2): Consta de una parte tubular capilar y de un bulbo o Figura 3: Área reticulada de la Cámara de Neubauer.
cámara de mezcla, que contiene una perlita (roja o blanca según corresponda) para
facilitar la dispersión uniforme de las células en el diluyente. La parte tubular esta
resenta la mitad del volumen del
representa el volumen total del líquido necesario para llenar la pipeta. La pipeta
para glóbulos rojos proporciona una dilución de 1/200 y la de glóbulos blancos una
dilución de 1/20.
Figura 4: Dirección del recuento celular (Izq.) y células consideradas en el recuento (Der.).
Figura °2 Pipeta de Thoma.
ANÁLISIS CON AUTO-ANALIZADOR DE HEMATOLOGÍA
Boquilla o tubo de goma: se adosa en el extremo de la pipeta para aspirar y cargarla. Los auto-analizadores hematológicos o contadores electrónicos (figura 5), son actualmente
Líquido de Hayem o solución de Dacie: es el diluyente usado para glóbulos rojos, la opción en los laboratorios modernos. El margen de error obtenido mediante los métodos
solución ISOTONICA respecto al plasma. manuales, oscila en torno al 20%, lo que se ve disminuido enormemente con estos aparatos,
Cátedra de Fisiología Facultad de Ciencias Veterinarias - UNNE Cátedra de Fisiología Facultad de Ciencias Veterinarias - UNNE
siendo el margen de error en torno o incluso inferior al 1%.
Hoy en día, los contadores electrónicos no se limitan solo a realizar el recuento de células y También los carotenos y las xantinas pueden colorear el plasma. Cuando hay hiperlipemia
su tipificación, por lo general proporcionan los resultados de todos y cada uno de los (exceso de lípidos en sangre) es turbio y blanquecino por la presencia de quilomicrones
parámetros constituyentes del hemograma. (gotas de grasa).
Número de hematíes por mm3 de sangre.
Los métodos manuales para obtenerlo son los siguientes:
Porcentaje de reticulocitos.
Número de leucocitos por mm3 de sangre. Método del micro-hematocrito
Fórmula leucocitaria. El micro-hematocrito es un método que requiere un mínimo volumen de sangre
Número de plaquetas por mm3 de sangre. especialmente en pacientes pequeños u hospitalizados que requieren tomas de muestras
Índices hematimétricos (eritrocitarios, reticulocitarios, leucocitarios y plaquetarios). constantemente.
Valor hematocrito.
Material necesario:
Concentración de hemoblobina en la sangre.
Tubos capilares.
Velocidad de sedimentación globular.
Figura 5: Contador Hematológico. Microcentrífuga.
Plastilina.
Sangre anticoagulada.
Técnica:
1. Llenar un tubo capilar hasta 3/4 partes de su capacidad con sangre anticoagulada con
EDTA o heparina, sosteniendo el tubo en una posición casi horizontal para facilitar el llenado
(Como una alternativa puede obtenerse sangre por punción capilar de la oreja, uña o
almohadilla plantar utilizando tubos heparinizados).
2. Limpiar el exceso de sangre del exterior del capilar.
3. El extremo capilar debe sellarse con plastilina manteniendo el capilar en posición
horizontal e introduciendo este extremo en la placa con el compuesto sellador en un ángulo
de 90°, girar el capilar ligeramente y retirar de la placa.
4. Colocar el capilar en la microcentrifuga con la parte sellada hacia la periferia. Identificar
Cada contador electrónico, se basa en su propio fundamento para obtener los resultados;
bien los tubos.
algunos de ellos son: 5. Fijar el cabezal de la centrífuga y cerrar la tapa.
Método de la resistencia eléctrica o de la impedancia 6. Centrifugar durante 5 minutos entre 12.000 y 15.000 rpm.
Fue descubierto por Coulter en 1956. El dispositivo de medida consiste en un pequeño 7. Se retiran los tubos de la centrifuga y se lee el porcentaje de hematocrito, sin incluir la
orificio, a través del cual se hace pasar la sangre diluida y que tiene colocado un electrodo capa rica en leucocitos y plaquetas, en tablas comerciales o ábaco de lectura de la siguiente
a su entrada y otro a su salida. También se hace pasar una corriente eléctrica constante a forma:
través de ese mismo orificio. Si el orificio es atravesado solamente por líquido diluyente, la a. Sostener el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columna de
resistencia eléctrica medida por los electrodos es mínima y constante, pero cuando el eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismo nivel de la línea
orificio es atravesado por una célula sanguínea, se produce un aumento de la resistencia horizontal correspondiente al número 0.
eléctrica y un cambio de potencial entre los electrodos. b. Desplazar el tubo a través de la escala hasta que la línea marcada con el número
El número de señales eléctricas generadas indica el número de células presentes en la 100 quede al nivel del tope de la columna de plasma. Controlar que el fondo de la columna
sangre y la amplitud de estas señales es directamente proporcional al volumen celular. De de eritrocitos continúe sobre la línea cero. El tubo debe encontrarse completamente en
este modo es posible el recuento y la identificación de las células. posición vertical.
Método del rayo láser c. La línea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicará la fracción
El dispositivo de medida consta de un detector situado detrás de un capilar por el que de volumen en % de éstos (hematocrito).
circula un flujo continuo de sangre diluida. Un rayo láser atraviesa el capilar y se dirige
Cátedra de Fisiología Facultad de Ciencias Veterinarias - UNNE Cátedra de Fisiología Facultad de Ciencias Veterinarias - UNNE
hacia el detector. Método de Wintrobe
Cuando no pasan células a lo largo del capilar, el rayo láser incide sobre el detector, pero El método de Wintrobe es fácil de realizar, requiere de tubos calibrados y una mayor
si una célula pasa a través del capilar, el rayo láser es interceptado por ella y deja de cantidad de sangre.
incidir sobre el detector. Materiales requeridos:
El número de interferencias indica el número de células presentes en la sangre, y el grado Sangre anticoagulada.
de interferencia que produce cada célula a su paso es directamente proporcional a su Tubo de Wintrobe graduado de 0-10 cm (con 2 divisiones milimétricas y en
tamaño. direcciones opuestas).
Pipetas Pasteur.
Hematocrito
Procedimiento:
Por centrifugación, la sangre se separa en tres partes (figura 6):
1. Llenar con sangre el tubo de Wintrobe con ayuda de una pipeta Pasteur, comenzando
1-MASA GLOBULAR O ERITROCITICA (menor al 50%)
desde el fondo hasta la marca superior, teniendo cuidado de no provocar espuma.
2-CAPA FLOGISTICA, BLANQUECINA, DE LEUCOCITOS Y TROMBOCITOS (0,5 a 1,5%)
2. Centrifugar a 3.000 rpm por 30 minutos.
3-PLASMA SANGUINEO (mayor al 50%)
3. Obtener el hematocrito, observando la escala que inicia en la parte inferior del tubo.
Índices Hematimétricos
Los índices de glóbulos rojos (GR) son parte del análisis sanguíneo completo y se utilizan
para ayudar a diagnosticar la causa de anemia en un paciente, y de esta manera tipificarla.
Los índices abarcan:
El tamaño promedio de los glóbulos rojos (VCM)
La cantidad de hemoglobina por glóbulo rojo (HCM)
Concentración de Hemoglobina Corpuscular Media (CHCM)
Figura 6 Sangre centrifugada.
Volumen corpuscular medio (VCM)
Representa el volumen medio de los eritrocitos expresado en MICRAS CUBICAS. Indica si los
De esta manera obtenemos el VALOR HEMATOCRITO, que se define como: la proporción eritrocitos son más grandes o pequeños de lo normal. Se calcula conociendo el hematocrito
de glóbulos rojos, expresada en %, en un volumen total de sangre incoagulada (100 ml). y el número de glóbulos rojos según la siguiente ecuación:
(Es la relación glóbulo-plasma)
Con el valor hematocrito se confirma el diagnostico de diferentes enfermedades y VCM = Hto X 10 / Eritrocitos (millones/mm3)
patologías, como es el caso de las anemias (el volumen de eritrocitos es inferior a la cifra Se denomina NORMOCITOS a las células que poseen el tamaño normal para la especie. En
normal de cada especie) y la policitemia o hemoconcentración (el volumen de eritrocitos los recién nacidos su tamaño es mayor fisiológicamente. Si aumenta el volumen se
excede el máximo normal). denominan MACROCITOS (observable en anemia perniciosa) y si el tamaño disminuye se
denominan MICROCITOS (observable en anemia ferropriva). Tener en cuenta que en las
VARIACIONES: Varía con la edad, sexo, raza, estado de salud, gestación, alimentación y otras
hemorragias agudas disminuye el hematocrito y el número de glóbulos rojos, pero su
variables fisiológicas y patológicas.
tamaño es normal (denominándose anemia normocítica).
La capa blanca de 0,5 a 1,5 % se sitúa inmediatamente encima de la masa roja. En las
enfermedades anemizantes crónicas hay liberación de reticulocitos que quedan en la capa Los índices correspondientes a HEMOGLOBINA serán detallados en la clase
flogística dándole un color rosado. correspondiente.
El compartimiento plasmático normalmente supera el 50 % es incoloro pero puede ser
VELOCIDAD DE SEDIMENTACION GLOBULAR (VSG)
amarillento por la presencia de grandes cantidades de bilirrubina (del catabolismo de la
Cátedra de Fisiología Facultad de Ciencias Veterinarias - UNNE Cátedra de Fisiología Facultad de Ciencias Veterinarias - UNNE
La prueba de velocidad de sedimentación globular no se utiliza para diagnosticar una HEMATOCRITO % 42-45 38-42 40-45 35-40 32-38 40-43
enfermedad específica. Debemos observar los resultados de la prueba de VSG junto con
otra información u otros resultados de pruebas a fin de determinar el diagnóstico. Las VCM (u3) 64 57 52 50 37 60
pruebas que se indiquen dependerán de los síntomas del paciente.
Si se impide la coagulación de la sangre se produce al cabo de algún tiempo, la VSG (mm/1° hora) 5-10 sd 60-70 0-2 sd 1-14
sedimentación de los eritrocitos. La velocidad de sedimentación globular, consistente en la
medición de la velocidad con la que sedimentan los glóbulos rojos o eritrocitos de la ERITROCITOS (10 /mm )6 3
6-8 6-9 8-10 5-7 7-9 5-8
sangre, provenientes de una muestra sanguinea (Citratado o con EDTA), en un periodo
determinado de tiempo (habitualmente una hora). Esta prueba se basa en la diferencia LEUCOCITOS(103/mm3) 7-17 5-14 7-11 5-10 7-12 15-20
existente entre las densidades y volúmenes de los compartimentos sanguíneos; es decir
depende de un factor globular (densidad y masa del glóbulo rojo) y de uno plasmático
(resistencia que opone a la sedimentación de los corpúsculos celulares). Es un marcador BIBLIOGRAFIA:
inespecífico, no relacionado con ninguna enfermedad en concreto, cuya elevación implica BASTIDAS, O. Conteo celular con hematocitómetro. Uso elemental del hematocitómetro. Disponible en:
procesos inflamatorios, infecciosos o neoplásicos. [Link]
Factores que afectan a la VSG: [Link]
CERON MADRIGAL, José J. 2013. Análisis clínicos en pequeños animales. Intermédica. Ciudad Autónoma
Factores plasmáticos
de Bs. As., Argentina.
La velocidad de se ve influida por la capacidad de aglutinación de los glóbulos rojos y por Coppo, José Antonio. 2010. Interpretación de análisis clínicos en perros y gatos. Universidad Católica de Salta.
los factores de aglutinación presentes en el plasma. Los más importantes son las Proteínas LARA, L. Manual de prácticas de laboratorio de patología clínica. Disponible en:
plasmáticas, especialmente el fibrinógeno y las globulinas. Se cree que estas proteínas [Link]
RUIZ ARGÜELLES, G.J. 2009. Fundamentos de hematología. Editorial medica Panamericana. Mexico.
disminuyen la carga electrostática de la membrana de los hematíes, disminuyendo la Disponible en: [Link]
repulsión entre ellos y favoreciendo su agregación.
Factores físicos
Sobre todo la morfología eritrocitaria y el VCM, observándose que a mayor tamaño de los
hematíes, mayor velocidad de sedimentación.
Factores ajenos a la sangre
Tales como temperatura, Hemólisis, tiempo transcurrido desde la extracción o limpieza de
material.
Inflamación
Uno de los efectos sistémicos que tiene el proceso inflamatorio, es un aumento de la VSG.
Especie
Los rumiantes muestran gran estabilidad de la suspensión de eritrocitos en el plasma y una
lenta VSG, porque tienen poca tendencia a aglomerarse. En el equino, por lo contrario, la
mucha velocidad, aumentando la VSG.
Aumentos: cuando la propensión de las células a formar agregados es mayor, ocurriendo
esto en la gestación, aumento de temperatura ambiental, tensión de oxigeno alta,
infecciones agudas generales y locales y fase aguda de enfermedades crónicas, afecciones
purulentas, tumores malignos y anemias.
Cátedra de Fisiología Facultad de Ciencias Veterinarias - UNNE
Disminuciones: ocurre en policitemias verdaderas, aumentos de la presión parcial de
dióxido de carbono, infecciones hepáticas que cursan con hipofibrinogenemia y
microcitosis.
Para determinar la VSG nos valemos de los siguientes métodos:
Método de WESTERGREN
Es una prueba que requiere sangre incoagulada, motivo por el cual, a la sangre extraída se
le adiciona una sustancia anticoagulante (la más común es citrato sódico al 3,8 % en
proporción exacta de 1 parte de citrato por 3 de sangre, es decir, al 1/4).
La sangre, homogeneizada, se carga en una pipeta de (de 2mm de diámetro interno, 30cm
de longitud y calibrada de 0 a 200mm) acomodada en un soporte quedando la pipeta
formando un ángulo de 90°. En el momento de llegar a la marca 0, se pone en marcha el
cronómetro. La lectura se efectúa directamente (en milímetros) a intervalo de tiempo
determinados (30´, 60´90´). La lectura determina los milímetros que han sedimentado
los hematíes, que se expresa en mm/hora y se compara el resultado obtenido con el valor
normal estandarizado por especies.
Si se inclina la pipeta hasta los 60° la sedimentación se acelera, debido a que existe menor
distancia que se opone al descenso de los hematíes y al ascenso del plasma. Este principio
es la base del Westergren Inclinado (Método de los 60°).
La sedimentación globular se realiza en tres etapas:
-Hemaglutinación: Es la tendencia de los hematíes a formar agregados en forma de
"pilas de moneda". Estos sedimentan de forma muy lenta por lo que van a
determinar la velocidad de todo el proceso.
-Sedimentación: Desplazamiento de los hematíes hacia el fondo de la pipeta a
velocidad constante.
-Acúmulo o depósito en el fondo lentamente.
El principio físico de esta prueba se basa en la Ley de Stokes considerando los hematíes
como esferas suspendidas en un medio infinito.
Método de Chattas:
Se utiliza cuando el volumen de sangre sea escaso se puede utilizar las pipetas de Chattas,
la técnica se realiza de la misma manera pero los resultados deben ser corregidos utilizando
un nomograma o tabla para conversión.
TABLA CON PARAMETROS HEMATOLOGICOS NORMALES
PARAMETRO CANINO FELINO EQUINO BOVINO OVINO PORCINO