LABORATORIO DE QUIMICA ORGANICA, BIOLOGICA Y MICROBIOLOGIA
Trabajo Practico N° 4
MÉTODOS PARA EL EXAMEN DE LAS MUESTRAS
TÉCNICAS DE COLORACIÓN MICROBIOLOGICAS
OBJETIVOS
Reconocer las distintas metodologías utilizadas para obtener contraste entre la célula y el
medio que la rodea, a fin de poder ser visualizada microscópicamente.
Adquirir destreza en el montaje y observación de preparados microbiológicos empleando
técnicas de tinción simple y diferencial.
Conocer las principales técnicas de coloración empleadas en el diagnostico microbiológico: C.
de Gram, C. de Ziehl Neelsen, C de May Grünwald Giemsa.
Reconocer la finalidad y campo de aplicación de cada técnica de coloración.
Comprender la fundamentación química, basada en la morfología microbiana, de cada técnica
de coloración microbiológica.
4.1. PRINCIPIOS GENERALES DE LAS COLORACIONES
En microbiología el microscopio se utiliza de forma rutinaria, ya que proporciona importante
información para la identificación temprana y definitiva de los microorganismos. Para
aprovechar esta ventaja de los microscopios, se han desarrollado técnicas tintoriales que
destacan las características morfológicas de los microorganismos. Existe una gran variedad de
tinciones que pueden ser aplicadas dentro del campo de la microbiología Por lo general, los
microorganismos son transparentes, y ello dificulta el estudio de los detalles morfológicos
cuando se los examina en su estado natural. Los primitivos métodos de fijación y coloración
fueron iniciados por iniciados por Paul Erlich y Robert Koch.
Existen técnicas de tinción específicas de gran utilidad, como la tinción de Ziehl-Neelsen, que
se utiliza para el diagnóstico de enfermedades crónicas como la tuberculosis o la actinomicosis,
o la tinción de azul de lactofenol, que preserva e identifica a los componentes estructurales de
los hongos. Las diferentes tinciones en el laboratorio microbiológico tienen una utilidad
fundamental para el diagnóstico y tratamiento oportuno de múltiples patologías de etiología
infecciosa.
Un colorante se define como una sustancia capaz de dar color a células, tejidos, fibras,
etcétera. De acuerdo con su origen, se pueden dividir en: colorantes naturales, los cuales son
extraídos de plantas o animales, y colorantes artificiales, que son aquellos de minerales
procesados y manipulados en el laboratorio.
Químicamente, el colorante está constituido de un componente auxócromo. y un cromóforo.
Los auxocromos son grupos positivos de átomos, que intensifican la acción de un grupo de
átomos no saturados (cromóforos) que, estando presentes en una molécula de una sustancia
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química, hacen que esta sea coloreada. Muchos de estos grupos o radicales, son ácidos y
bases que originan colorantes ácidos y básicos, y que fijan eficazmente el colorante.
Los colorantes utilizados en microbiología son sales, las cuales tienen un ion cargado
positivamente y otro negativamente, de los cuales uno está coloreado (auxocromo). Cuando el
ion coloreado es el cargado negativamente, el colorante se clasifica como aniónico o acido, por
ejemplo, el eosinato de sodio, el cual se ioniza como sodio+ y eosinato+. Cuando el ión
coloreado es el cargado positivamente, el colorante se clasifica como catiónico o básico, por
ejemplo el azul de metileno, el cual se ioniza como cloruro- y azul de metileno+
Algunos ejemplos de auxocromos son:
Ácidos: -COOH, -OH, -SO3H. Ácido (-) se combinan con Proteínas (+). Ej: eosina,
Fucsina ácida, Rojo congo.
Básicos: -NHR, -NR2, -NH2. Básico (+) se combinan con Ácidos nucleicos
Polisacáridos ácidos. Ej: Azul de metileno, Cristal violeta, Safranina.
Al poner en contacto una célula bacteriana con un colorante ocurre un intercambio de iones
entre el colorante y los sitios activos de las superficies o el interior de la célula. Los iones
teñidos del colorante reemplazan a los iones de los componentes celulares, así, por ejemplo, el
catión azul de metileno+ reemplaza al catión Na+ de las células dándoles color.
Aunque los microorganismos vivos se pueden observar directamente en fresco al
microscopio óptico, la mayoría de las veces es necesario teñirlos para que, por medio del uso
de colorantes, sea mucho más fácil su identificación mediante la visualización coloreada de
ciertas estructuras, así como su reacción a determinadas técnicas.
Los colorantes tienen las siguientes funciones:
1. Permiten hacer visibles a los objetos microscópicos y transparentes.
2. Revelan su forma y tamaño
3. Muestran la presencia de estructuras internas (en algunos casos) y externas.
4. Producen reacciones químicas específicas, revelando la composición química de la
pared celular y estructuras específicas.
Se aconseja utilizar cultivos jóvenes para los métodos de coloración de rutina. Las células
viejas pierden su afinidad para la mayoría de los colorantes. En general los mejores resultados
se obtienen en cultivos de 24 h para bacterias y levaduras, mientras que para hongos
filamentosos se requieren cultivos de 5 a 7 días.
4.2. CLASIFICACION DE COLORACIONES MICROBIOLOGICAS
Según la estructura que el colorante tiñe en la bacteria, las coloraciones se han clasificado en:
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COLORACIONES SIMPLES: toda la muestra se tiñe del mismo color y se utiliza un
sólo colorante para el proceso. Ejemplos: Azul de metileno, Fucsina fenicada, Verde
de malaquita.
COLORACIONES COMPUESTAS Y DIFERENCIALES: se visualiza más de un
color porque se utiliza más de un colorante dentro del procedimiento de tinción.
Ejemplos: Gram, Ziehl Neelsen y May Grünwald -Giemsa
COLORACIONES ESTRUCTURALES: Consisten en el empleo de técnicas y
colorantes específicos con la finalidad de poner de manifiesto, algunas estructuras
especiales típicas microbianas, tal es el caso de:
a) Flagelos Rhodes, Tribondeau, Gray
b) Esporas: Shaeffer-fulton, Dorner
c) Cápsula: Hiss, Tinta china, Muir o Anthony,
d) Gránulos metacromáticos: Ernst-Neisser, Albert, Loeffler
4.3. PASOS GENERALES EN LAS COLORACIONES
La tinción o coloración es un método sencillo para incrementar el contraste entre la célula y su
entorno y por lo tanto contribuye a mejorar la imagen observada. En Microbiología todas las
tinciones se realizan a partir de suspensiones de microorganismos extendidas en un
portaobjetos (frotis), secadas y fijadas.
Figura 4.1: Pasos generales para realizar una tinción. 1. Extension, 2. Fijacion, 3. Adicion del
colorante, 4. Lavado, 5. Secado al aire. Guia de Farmacia
En la Figura 4.1 se pueden observar el esquema de los pasos generales para realizar una
tinción. A continuación, se describen los 5 pasos generales que son comunes a toda
coloración, ya sea simple, diferencial o estructural, a partir de muestras o cultivos microbianos.
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1. Preparación del extendido. Se elije un portaobjeto bien limpio (de ser necesario se limpia
con alcohol, papel servilleta). El extendido se puede realizar a partir de:
a) Un cultivo microbiano en medio sólido, ya sea en placa de Petri o tubo (Figura 4.2).
Cuando la muestra proviene de un cultivo en medio solido, es necesario disponer
previamente sobre el portaobjetos, una gota de agua o de solucion fisiologica, en la cual
se pueda disgregar el inoculo con suaves movimientos circulares con el ansa.
b) Un cultivo bacteriano en medio líquido o muestra liquida. En el caso de muestras
liquidas o cultivos microbianos en medios liquidos, esta se deposita directamente sobre
el portaobjetos y se distribuye homogeneamente mediante movimientos circulares
(Figura 4.3).
Figura 4.2: Preparación de un extendido a partir de un cultivo bacteriano en medio sólido.
Figura 4.3: Preparación de un extendido a partir de un cultivo bacteriano en medio líquido.
2. Fijación del extendido. Toda muestra biológica colocada sobre un portaobjetos, debe pasar
por el proceso de fijación a fin de permanecer fijada al portaobjetos, durante el proceso de
tinción y/o coloración. Existen dos procedimientos de fijación:
a) Fijación Química: se realiza empleando alcoholes, los cuales fijan la muestra por
deshidratación de las estructuras biológicas. Este tipo de fijación se utiliza en las
coloraciones de extendidos de sangre o en las baterias de coloración histológica. Los
alcoholes son diversos, tales como metanol o etanol en graduaciones adecuadas.
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b) Fijación física. Se realiza mediante el calor, ya sea pasando por la llama del mechero o
apoyando sobre una superficie caliente. En el laboratorio de microbiología, se fija el
frotis o extendido al calor, calentando suavemente a la llama del mechero hasta que se
seque.
3. Adición del colorante. Una vez fijada la muestra en el portaobjetos se procede a la etapa
de adición del o los colorantes para la coloración. Se cubre la zona de la muestra con suficiente
cantidad de colorante y se deja actuar el tiempo necesario según la técnica en cuestión. Las
coloraciones microbiológicas de rutina, emplean tiempos cortos de 30 segundos a 3 minutos
por etapa y/o colorante. En el caso de coloraciones simples, esta etapa se realiza una única
vez, con un solo colorante. En las coloraciones diferenciales y estructurales, esta etapa y la de
lavado se repiten de acuerdo al protocolo de tinción.
4. Proceso de lavado. Luego de cumplido el/los tiempo/s de tinción, se procede a lavar el
exceso de colorante con agua de canilla. El pH del agua corriente es el apropiado para lograr
una coloración adecuada. No se utiliza agua mineral, agua destilada o solución fisiológica en
este procedimiento.
5. Secado. Una vez finalizado el proceso de coloración, se deja secar el portaobjetos teñido al
aire. Puede colocarse próximo a un mechero de Bunsen encendido, aprovechando el calor
provocado por la llama para acelerar el proceso o bien, colocar el portaobjetos teñido entre dos
pliegos de papel servilleta o papel de filtro que absorban el excedente de humedad.
Una vez seco el extendido, se procede a su observación microscópica, teniendo en cuenta las
recomendaciones según el tipo de coloración empleado y el microorganismo a observar.
4.4. COLORACIÓN SIMPLE
Este tipo de coloraciones se utilizan poco en los laboratorios de rutina de bacteriología, debido
a que únicamente nos dan información de la morfología microbiana, con lo cual no se puede
establecer el grupo bacteriano en cuestión.
Las etapas de una coloración simple, comprenden:
1. Preparación del frotis o extendido
2. Fijación del extendido
3. Cubrir el extendido con el colorante (violeta cristal, fucsina, azul de metileno o safranina)
4. Dejar reaccionar el tiempo necesario (30 segundos a 3 minutos, según el colorante)
5. Lavar suavemente con agua corriente.
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6. Dejar secar al aire o acelerar el proceso de secado colocando entre dos pliegos de papel
servilleta y examinar bajo lente con aceite de inmersión.
Obsérvese las siguientes recomendaciones:
- Es buena práctica desechar el papel secante utilizado en este procedimiento y en otros
que intervengan microorganismos patógenos.
- Los portaobjetos si no se conservan como elemento de referencia, se colocarán en
solución desinfectante provisto por la catedra.
Tabla 4.1: Ejemplo de una coloración simple
Tinción Componentes Propósito
Coloración simple directa empleada para
revelar morfología de microorganismos. Una
Azul de Azul de metileno 0,3 gr
de sus aplicaciones es en la identificación de
metileno de
Etanol, 95% 30,0 ml Corynebacterium diphteriae, en el cual los
Loeffler
gránulos metacromáticos se tiñen
Agua destilada 100,0 ml
intensamente con azul de metileno,
diferenciándose del citoplasma azul más claro.
4.5. COLORACIONES ESPECIALES/ DIFERENCIALES
4.5.1. COLORACIÓN DE GRAM
La tinción de Gram está fundamentada en la naturaleza química de la pared celular de las
bacterias. En la Figura 4.4, se ve esquematizados los componentes químicos de la pared
celular de los dos más numerosos grupos bacterianos. Gram (+) y Gram (-):
Pared Gram (+): Se destaca una capa densa y uniforme de 200 a 800 A˚ de
Peptidoglicano (Mureina o glicopéptido) representando el 50% del peso seco. Otros
elementos de la pared son ácidos teicoicos y ácidos lipoteicoicos. En menor medida
polisacáridos y proteínas.
Pared Gram (–) El peptidoglicano o glucopéptido representa el 10% del peso seco
formando una capa interna delgada de 20 a 30 A°, cubierta por capas externas de
lipopolisacáridos, lipoproteínas y proteínas. Se reconoce una membrana externa (ME) con
una bicapa lipídica asimétrica, atravesada por canales proteicos de porina y con el
Lipopolisacarido (LPS), en su cara externa.
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Figura 4.4: Representacion esquematica de los componentes químicos de paredes bacterianas en
funcion de su coloracion diferencial con la tecnica de coloración de Gram. Fuente: Murray (2017).
Productos empleados en la Coloración de Gram.
A continuación, se detallan los productos empleados en la tinción de Gram:
Colorante primario: Cristal Violeta
Mordiente: Lugol
Decolorante: Alcohol Acetona
Colorante de contraste: Safranina o Fucsina básica diluida
Etapas de la coloración de Gram:
Una vez preparado el extendido y realizada la fijación, se continúa con la coloración:
1) Se cubre el extendido con cristal violeta (colorante primario). - 1 minuto -
se lava con agua de canilla
2) Se cubre el extendido con Lugol (mordiente) - 1 a 2 minutos -
se lava con agua de canilla
3) se decolora con alcohol de 95° (decolorante). Pocos segundos, paso crítico.
se lava con agua de canilla
4) Se cubre con safranina o fucsina básica (colorante de contraste). 1 minuto -
se lava con agua corriente.
5) se seca suavemente al aire o sin frotar con papel secante.
Una vez que la preparación está totalmente seca, poner una gota muy pequeña de
aceite de cedro y observar al microscopio con el objetivo de inmersión. Se enfoca,
preferentemente, con el micrométrico. Después de utilizar el objetivo de inmersión
debe limpiarse suavemente con papel suave.
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La siguiente Tabla resume los pasos de la coloración de Gram en base a cada uno de los
productos que emplea y a la reacción y coloración que va produciendo en las bacterias Gram
(+) y Gram (-) durante el proceso de tinción (Tabla 4.2).
Tabla 4. 2: Coloración de Gram. Pasos de la tinción en base a cada uno de los productos que emplea y
a la reacción y coloración que va produciendo en las bacterias
Paso de la Producto que se Reacción y coloración de las bacterias
Tinción emplea GRAM (+) GRAM (-)
Colorante básico
Cristal violeta (CV) Bacterias color violeta Bacterias color violeta
o primario
Se forma el complejo CV-
Se forma el complejo CV-Yodo.
LUGOL Yodo.
Mordiente Las bacterias continúan
(solución iodada) Las bacterias continúan
teñidas de violeta.
teñidas de violeta.
Se deshidratan las paredes
Eliminación por extracción de
celulares.
los lípidos de las paredes
Se contraen los poros.
celulares (LPS de ME).
Decoloración Alcohol Acetona Disminuye la permeabilidad.
Aumenta la porosidad.
El complejo CV-I no sale de las
El complejo CV-I se separa de
células que continúan teñidas
la célula.
de color violeta.
Células no decoloradas, Células decoloradas, se tiñen
Colorante de Fucsina básica o quedan teñidas de color de color rosado con el
Contraste Safranina violeta del colorante básico o colorante de contraste o
primario secundario.
Fuente: Desarrollado por Jerke Gladis, 2005.
Examen del extendido coloreado con el Gram
Pueden reducirse los errores de interpretación y el tiempo necesario para el examen de los
extendidos coloreados con la tinción de Gram mediante el examen sistemático del portaobjeto,
de la siguiente manera:
1. Un breve examen macroscópico del portaobjeto (en 5X o 10X) informará al examinador si la
sustancia colorante ha quedado en el portaobjeto, que lado del mismo está coloreado, y si el
frotis es demasiado grueso o está poco decolorado, muy decolorado o irregularmente
coloreado.
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2. En un examen microscópico con poco aumento (en 5X o 10X) se ven a menudo grandes
formas fúngicas y por lo común es posible determinar las características de coloración de los
núcleos celulares.
3. Mediante la lente de inmersión en aceite (100x), evaluar la conveniencia técnica de la
coloración. Hay que insistir en que la mayoría de los errores de interpretación de los frotis
coloreados con el Gram se deben a errores en la preparación del portaobjeto, con un extendido
demasiado grueso, excesiva fijación por el calor que puede alterar la morfología normal de las
bacterias y células y decoloración escasa o excesiva.
a. Se puede evaluar con rapidez si la coloración por el Gram es adecuada, comparando
diferentes áreas del portaobjeto (con lente de inmersión en aceite). Las variaciones en los
resultados de la coloración se observan en la figura 4.5. Los núcleos de granulocitos y los
organismos Gram negativos en un área delgada del frotis deberán colorearse de rojo, y los
organismos Gram positivos de púrpura (fig. 4.5 C). El hallazgo de bacterias rojas próximas
a elementos celulares ligeramente purpúreos (decoloración marginal) en una parte más
gruesa del frotis, confirmará que se encuentran organismos Gram negativos (fig. 5 B) y que
no son bacterias Gram positivas decoloradas en exceso (Fig. 5 D). Los campos totalmente
poco decolorados (fig. 4.5 A) indican sólo la presencia de bacterias pero no pueden
distinguirse sus características de coloración.
Figura 4.5: Posibles variaciones en una coloración Gram. A y B- Coloración poco decolorada. C-
Coloración IDEAL. D- Coloración muy decolorada.
b. Puede controlarse la técnica de coloración de Gram coloreando una muestra de flora
bucal por ejemplo, que contiene organismos Gram negativos y Gram positivos y células
epiteliales.
c. Si el frotis coloreado con el Gram es técnicamente inadecuado, hacer uno nuevo y
volver a colorearlo.
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4. Cuidado con los artificios. El material Gram positivo de forma irregular suele ser precipitado
de Cristal Violeta de la coloración de Gram más que los cocos Gram positivos.
5. Recordar que los organismos Gram positivos viejos, muertos o tratados con antibióticos,
pueden aparecer como Gram negativos. Porque sus propiedades físicas y químicas están
alteradas y sus paredes celulares son más permeables al agente decolorante y hay menor
retención del colorante principal.
6. Reconocer las limitaciones de la coloración de Gram. No constituye un método para
cápsulas, esporas, micobacterias u hongos salvo algunas formas de levaduras. Esta coloración
puede proporcionar indicios de la presencia de cápsulas o esporos por ello, deberán usarse
otros medios de coloración más específicos para destacar estas estructuras.
a. Las micobacterias no captan bien la coloración de Gram, si hay sospecha de ello
proceder a una coloración acidorresistente (Ziehl Neelsen).
b. Los hongos, por lo general, son de tamaño elefantiásico en comparación con la mayoría
de las bacterias, (Figura 4.6). Si bien los hongos son nominalmente Gram (+) la mayoría se
revela mal o no se revela. Como excepción algunas levaduras se colorean como Gram (+).
Se detectan mejor los hongos con un montaje húmedo conveniente (como ser Lactofenol
azul de algodón), examinado con objetivo seco de gran aumento (40X),
7. Conservar el frotis. Es parte importante de los datos básicos de la muestra. El portaobjeto
debe guardarse o agregarse al informe. La inmersión en aceite se limpiará con papel
absorbente suave.
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