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Laboratorio
de Biología Molecular -
Programa de
microbiología
Título de la
correspondiente
práctica
Primer estudiante;
segundo estudiante y
tercer estudiante (En
orden alfabético)
Facultad de Ciencias
Básicas, Microbiología,
1
Universidad Santiago de
Cali, Cali, Colombia;
estudiante1@[Link]
(añadir correo
INSTITUCIONAL de cada
integrante)
Laboratorio de Biología
Molecular -
Programa de
microbiología
Título de la
correspondiente
práctica
2
Primer estudiante;
segundo estudiante y
tercer estudiante (En
orden alfabético)
Facultad de Ciencias
Básicas, Microbiología,
Universidad Santiago de
Cali, Cali, Colombia;
estudiante1@[Link]
(añadir correo
INSTITUCIONAL de cada
integrante) CARRERA DE MEDICINA
Informe de Laboratorio de Biología Molecular
Extracción de DNA – PCR – Electroforesis DNA
Nombre: Bryan Llumiquinga
Semestre: Segundo Paralelo: “B” Grupo: 2
Fecha:

3
4
RESUMEN

INTRODUCCIÓN (Si referencias bibliográficas)

La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es considerada uno de los avances científicos

más trascendentales e ingeniosos de la historia reciente esta poderosa técnica molecular que
consiste en la amplificación de fragmentos de ADN en cantidades significativas a partir de
una pequeña porción de material genético obtenida de un organismo o de una fuente
específica. La muestra de ADN puede ser extraída de diferentes tejidos, fluidos corporales o
incluso de microorganismos presentes en el entorno (Saiki et al., 1988). La técnica se basa en
la utilización de una enzima llamada Taq polimerasa, que sintetiza nuevas cadenas de ADN
complementarias a partir de un molde de ADN, utilizando como cebadores pequeños
fragmentos de ADN que flanquean la región de interés, Sólo se requiere someter la muestra
biológica que contiene el material genético a ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento,
esto posibilita que la región de interés pueda replicarse de forma exponencial, generando
millones o hasta billones de copias en pocas horas (Bartlett & Stirling, 2003).

La PCR es ampliamente utilizada en investigación biomédica, genética, medicina forense, y

diagnóstico de enfermedades, gracias a su sensibilidad y especificidad. Una de sus
aplicaciones más conocidas es la detección del virus SARS-CoV-2 causante del COVID-19 a
partir de hisopados nasales u orales, realizados a pacientes sospechosos de tener dicha
enfermedad (Corman et al., 2020). Esto revolucionó para siempre la forma en que los
científicos podían estudiar y manipular el ADN.

Otra aplicación importante de la PCR es estudiar genes microbianos para explorar la

diversidad genética de comunidades microbianas. Uno de los genes más estudiados es el 16S
rRNA, que lo tenemos presente en bacterias y arqueas (Gilbert et al., 2018). Este gen no solo
nos permite detectar la composición taxonómica de una comunidad microbiana, sino también
evaluar su diversidad alfa y beta (Caporaso et al., 2011). La diversidad alfa se refiere a la
riqueza de especies dentro de una misma muestra. En contraste, la diversidad beta compara la

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composición microbiana entre diferentes ambientes. El análisis de la diversidad microbiana
mediante el gen 16S rRNA ha revelado una notable variedad de patrones geográficos y
gradientes ambientales que moldean la estructura de las comunidades bacterianas (Lozupone
et al., 2012).

Gracias a la PCR del 16S rRNA, los científicos están revelando la estrecha relación entre
nuestro microbioma intestinal y enfermedades como obesidad, diabetes, alergias y cáncer. El
monitoreo de estas especies centinelas mediante PCR en tiempo real del 16S rRNA permite
evaluar la respuesta del microbioma a intervenciones terapéuticas o cambios en la dieta y
estilo de vida. El análisis del microbioma humano mediante técnicas moleculares como la
PCR está posibilitando el desarrollo de nuevas terapias y diagnósticos personalizados de
enfermedades (Janda & Abbott, 2007).

En conclusión, el ingenio detrás de la PCR y su versatilidad, han hecho de esta técnica una
protagonista indispensable en el avance de la biología molecular y la medicina actual,
trazando un camino para un futuro más prometedor en la lucha contra las enfermedades. El
constante avance en la investigación de estas áreas continuará llevando la medicina hacia
horizontes inexplorados, con resultados que beneficiarán a toda la humanidad.

MARCO TEÓRICO (Si referencias bibliográficas)

Gen 16S rRNA

El gen 16S rRNA es un gen presente en todas las células procariotas y es esencial para la
síntesis de proteínas. Debido a que está presente en todas las bacterias, pero su secuencia
varía entre especies, el análisis de este gen mediante secuenciación masiva permite
caracterizar la composición taxonómica de comunidades microbianas complejas (Woese y
Fox, 1977). La identificación de especies microbianas es importante en la medicina, ya que
permite la detección temprana de enfermedades infecciosas. Además, el estudio de
comunidades microbianas marinas es importante para entender la dinámica de los ecosistemas
marinos y su impacto en el medio ambiente (Poretsky et al., 2014).

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PCR convencional

La PCR convencional es una técnica de laboratorio que permite la amplificación de una

región específica de ADN para su posterior análisis. La técnica de PCR se basa en la
capacidad de la enzima ADN polimerasa para sintetizar nuevas cadenas de ADN
complementarias a una cadena molde existente. Consta de 3 pasos repetidos cíclicamente que
son los siguientes:

Desnaturalización: se calienta la muestra a una temperatura alta de 95°C durante 2min para
separar las dos hebras de ADN.

Alineamiento: se enfría la muestra a 55°C y se agregan los cebadores específicos que se unen
a la región objetivo.

Extensión: se aumenta la temperatura a 72°C durante 5 min y la ADN polimerasa sintetiza

nuevas cadenas de ADN complementarias a la cadena molde existente.

Estos pasos se repiten 35 veces para amplificar la región de interés y dura 2h. Los cebadores
universales más utilizados son 27F y 1492R que producirán un fragmento de 1470 pares de
bases (Lane, 1991).

Obtención previa de ADN

Previo a realizar la PCR, es necesario extraer el ADN de la muestra y purificar el ADN de la

muestra biológica. La obtención de ADN puede realizarse mediante diferentes métodos,
como la extracción de ADN con fenol-cloroformo, lisis celular, métodos caseros, kits
comerciales, precipitación con alcohol, extracción con solventes orgánicos y cromatografía,
etc. La elección del método dependerá del tipo de muestra y del objetivo del análisis (Green y
Sambrook, 2012). La calidad del ADN determina el éxito de la PCR.

Visualización de resultados

Después de realizar la PCR convencional, es necesario visualizar los resultados. Esto se puede
hacer mediante la electroforesis en gel de agarosa. La electroforesis en gel de agarosa permite
separar los fragmentos de ADN amplificados por tamaño y visualizarlos bajo luz ultravioleta.
Los fragmentos de ADN se comparan con un marcador de peso molecular para determinar el

7
tamaño de los fragmentos amplificados. El producto de PCR se secuencia mediante métodos
de secuenciación de Sanger o de próxima generación para identificar taxonómicamente las
bacterias (Janda y Abbott, 2007).

Además, como dato interesante tenemos que otro uso de la PCR del gen16S es la
cuantificación absoluta o relativa de grupos bacterianos mediante PCR cuantitativa (qPCR).
Emplea cebadores específicos para el grupo de interés y curvas estándar para cuantificar
copias del gen (Smith y Osborn, 2009). La qPCR en tiempo real permite monitorear cambios
en abundancias bacterianas, por ejemplo, durante una infección o tratamiento antibiótico.

PROCEDIMIENTO

[Link]ón del ADN

Bacteria Escherichia coli

Lisis celular Ebullición >95ºC Centrifugación

[Link]ón de la PCR

Tenemos una PCR del fragmento que queremos analizar que es el gen 16S ADNr,
necesitamos:

El material genético puede variar, en este caso estamos

utilizando ADN de una bacteria, pero se puede cambiar a
-ADN blanco (ADN de la
una célula humana.
bacteria)

-ADN polimerasa (Taq pol)

Master Mix
” Siempre es constante en una
8 PCR”
prueba de
-dNTPs

-Buffer + MgCl2

-2 primers (27F y 1492R) También pueden variar, dependiendo del

gen que se quiera visualizar.

Paso 1.

Utilizar 1 μl del ADN bacteriano obtenido por el método de ebullición.

IMPORTANTE: preparar un control negativo de amplificación, para ello colocar 1 μl de

agua libre de nucleasas en lugar del ADN, esto sirve para saber si los reactivos, micropipetas
o puntas pueden estar contaminados con ADN. Seguir la mezcla sugerida a continuación:

-1 Tabla: Reactivos para realizar la PCR.

Con ADN Sin ADN

Tubo A (colonia hervida) Tubo B (colonia sin tratar) Tubo C (control negativo)

1 uL ADN (muestra líquida) 6 uL agua estéril 6 uL agua estéril

5 uL agua estéril Disolver una pequeña 1 uL primer 27F

cantidad de colonia
bacteriana (ADN)

1 uL primer 27F 1 uL primer 27F 1 uL primer 1492R

1 uL primer 1492R 1 uL primer 1492R 8 uL master mix

8 uL master mix 8 uL master mix Total 16 uL

Total 16 uL Total 16 uL

9
Datos adicionales:

- En este paso vamos hacer un proceso llamado” Colonibición” o también llamada PCR de
colonia. Consiste en no colocar ADN en el tubo B, sino que tenemos una modificación y
vamos a tomar una colonia.

-En el tubo B no vamos hacer extracción, sino que nos saltamos este paso y vamos directo a la
colonia de bacteria.

-Una pequeña muestra de la esquina de la colonia es suficiente, ya que entre más recojan,
pueden tener más contaminantes y la PCR no va a funcionar, se necesita lo mínimo para que
funcione correctamente la PCR.

-El tubo C, es el control negativo a diferencia de los otros tubos no tiene ADN, con lo cual no
va haber replicación o copias. Pero nos sirve para verificar que no haya contaminación.
Debemos tener cuidado de no arrastrar ninguna bacteria ya que hay bacterias en todos lados y
debemos tener cuidado con los reactivos.

Figura 1: Reactivos de la PCR.

Paso 2.

Mezclar bien y realizar una centrifugación rápida para recolectar toda la mezcla en el fondo
del tubo.

10
Paso 3.

Colocar los tubos en el termociclador y programarlo con las siguientes condiciones:

Luego la PCR tiene 3 pasos que son:

-Desnaturalización Temperatura a 95ºC y Tiempo de 2min.

-Alineamiento Temperatura a 55ºC y Tiempo de 30s.

-Elongación o ex-tensión Temperatura a 72ºC y Tiempo de 5min

[Link]

1. Preparar un gel de agarosa al 1%, pesando la cantidad correspondiente de agarosa y

disolverlo en la buffer de electroforesis 1x (TBE o TAE). En este paso se realizan
ciclo de calentamiento en el microondas para disolver completamente la agarosa

2. A continuación, se debe preparar el molde con la peinilla donde se vertirá el gel para
su solidificación.

3. Esperar a que la mezcla alcance unos 50 ºC y (2.5 gr de agarosa por cada 50mL de
Buffer)

4. Verter la agarosa en el molde y dejar solidificar unos 10-15 min

5. Colocar 10 ul del producto de PCR en el gel de agarosa (de ser necesario añadir 2 ul
de buffer de carga)

6. Cargar 3 ul del marcador de peso molecular

7. Programar el equipo para que realice la electroforesis a 100-120 V de 30 a 45 min

8. Visualizar el resultado en un transiluminador

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 Figura 2: Separación de moléculas en un campo eléctrico

RESULTADOS

Figura 3: Muestra Figura 4: Marcador de peso molecular

12
 Figura 5: Resultados de la Electroforesis en Gel de Agarosa

Nota:
M: marcador de peso molecular (la flecha roja indica la banda del tamaño de 1500 pares de bases)

OBJETIVOS:

Objetivo general:

 Caracterizar la diversidad bacteriana de muestras clínicas mediante la amplificación y

secuenciación del gen 16S rRNA.

Objetivos específicos:

 Extraer y purificar ADN bacteriano de alta calidad a partir de las muestras clínicas.
 Amplificar un fragmento de ~1465 pb del gen 16S rRNA bacteriano mediante PCR
utilizando los cebadores universales 27F y 1492R.
 Optimizar las condiciones de la PCR (concentraciones de reactivos, ciclos térmicos)
para obtener amplicones específicos.
 Verificar la obtención de los amplicones esperados mediante electroforesis en gel de
agarosa.

13
  Determinar la diversidad bacteriana de las muestras clínicas mediante secuenciación
masiva de los amplicones del gen 16S rRNA.
 Analizar bioinformáticamente las secuencias para identificar los taxa bacterianos
presentes en cada muestra.
 Evaluar diferencias en la composición de las comunidades bacterianas entre muestras
clínicas.
 Relacionar los perfiles bacterianos observados con el estado de salud/enfermedad de
los pacientes.

CONCLUSIÓN:

Como podemos observar en la imagen de electroforesis ninguna de nuestras muestras se

puede visualizar correctamente ya que no encontramos ninguna banda de pares de bases en
los carriles asignados de la electroforesis, se podría decir que no se pudo amplificar el gen
(ADNr 16S) correctamente.

En la Primer muestra de ADN hervido, se puede visualizar que no hay ningún desplazamiento
de la muestra, por lo que podríamos decir que esta muestra no logro fragmentarse por
completo ya que no avanzo a través del gel de agarosa, así como nuestras dos muestras
faltantes.

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En conclusión, se podría decir que nuestras muestras no están bien hechas, ya que se detecta
posibles contaminantes que se pudieron haber generado en el área del laboratorio. En el
incluye diferentes factores como el no usar guantes quirúrgicos y también el no cambiar
correctamente las puntas de las pipetas de manera continua, entre otros causantes tenemos por
ejemplo la calidad inadecuada del ADN molde, error en el diseño de cebadores, condiciones
de PCR no óptimas, baja concentración de ADN molde, etc.

PREGUNTAS MOTIVADORAS

1. ¿Cuál es la utilidad del PCR en la práctica clínica?

La PCR tiene gran utilidad en la práctica clínica para el diagnóstico de enfermedades
infecciosas, detección de mutaciones genéticas, tipificación de microorganismos, entre
otras aplicaciones. Permite la detección ultrasensible y específica de secuencias de
ADN o ARN de interés clínico.
2. ¿Cuál son las ventajas y desventajas del PCR?
Ventajas: sensibilidad, especificidad, rapidez. Desventajas: no distingue entre ADN de
células viables o no, propensa a contaminación y artefactos.
3. ¿Cuál es el tamaño del fragmento amplificado esperado con ambos primers?

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 El tamaño del fragmento amplificado con los primers 27F y 1492R es de
aproximadamente 1465 pares de bases.
4. ¿Cuál es la secuencia de los primers empleados en la práctica?
La secuencia del primer 27F es 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'. La secuencia
del primer 1492R es 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'.
5. ¿Qué factores pueden influenciar en la PCR?, explicar cómo afectan
Factores que influyen en la PCR: calidad/cantidad de ADN molde, concentración de
MgCl2, temperatura y tiempo de annealing, calidad de la Taq polimerasa. La
optimización de estos factores es crucial.
6. ¿Qué pudiera generar una ausencia de amplificado?
La ausencia de amplificado puede deberse a: degradación del ADN, inhibidores de
PCR en la muestra, errores en el diseño de cebadores, contaminación, entre otros.
7. ¿Cuáles son los componentes del buffer de reacción de la PCR?
Componentes del buffer de PCR: Tris-HCl, KCl, MgCl2, dNTPs, estabilizadores,
mejoradores de reacción. Aportan estabilidad, iones y sustratos necesarios.

BIBLIOGRAFÍA
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